4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ.
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Методические указания. - М.: Федеральный центр Гос­санэпиднадзора Минздрава России, 2004. .

1.  Разработаны Российским государственным медицинским университе­том (к. б. н. Н. И. Шейной).

2.  Утверждены Первым заместителем министра здравоохранения Россий­ской Федерации - Главный государственным санитарным врачом Российской Федерации 24 октября 2003 г.

3.  Введены в действие с I декабря 2003 г.

4.Введены впервые.

1. Общие положения и область применения

Настоящие методические указания устанавливают методику проведения микробиологического количественного анализа концентрации клеток штамма Aspergillus awamori ВНИИгенетика 120/177 - продуцента глюкоамилазы в атмосферном воздухе населенных мест в диапазоне концентраций от 100 до 5 000 клеток в 1 м³ - воздуха.

Методические указания разработаны в соответствии с требованиями ГОСТ 17.2.4.02-81 «Охрана природы. Атмосфера. Общие требования к методам определения загрязняющих веществ» и Р 8.563-96 «Методики выполнения измерений».

Методические указания предназначены для применения в лабораториях предприятий, организаций и учреждений, аккредитованных в установленном порядке на право проведения микробиологических исследований.

Методические указания одобрены и рекомендованы секцией «Гигиенические аспекты биотехнологии и микробного загрязнения окружающей среды» Проблемной комиссии «Научные основы гигиены окружающей среды».

2. Биологическая характеристика Aspergillus awamori
ВНИИгенетика 120/177 и его гигиенический норматив

На 5 день развития на сусло-агаре штамм образует крупные ровные круглые колонии, средний диаметр которых составляет 0,5-1,0 см, а максимальный - 1,5-3,0 см. Край колоний ровный. Колонии гомогенные, гладкие, плоские.

При температуре 38-42°С штамм-продуцент появляется на сусло-агаре в виде маленьких белых колоний уже на 1-2 дни. На 3 день в среду выделяется оранжево-желтый пигмент, процесс спорообразования идет интенсивнее. Образование конидиеносцев с конидиями придает колониям глубокий интенсивно-серый цвет. Колонии становятся опушенными и приподнимаются над средой.

Систематическое положение микроорганизма

Класс	Fungi imperfecti
Порядок	Hyphomycetales
Семейство	Mucedinaceae
Секция	Monoverticillata
Род	Aspergillus
Вид	awamori
Штамм	ВНИИгенетика 120/177

Штамм Aspergillus awamori 120/177 получен во ВНИИгенетика как мутант из Asp.awamori С529Д 466 и депонирован в ЦМПМ института. Штамм является продуцентом глюкоамилазы.

Штамм-продуцент растет на жидких и агаркзованных средах. Оптимальная температура роста 27-30°С, рН среды - 5,0-6,0, культивирование 7 суток. Для размножения используется агаризованная среда Чапека, сусло-агар 5-6°Б, картофельно-сахарозный агар.

Предельно допустимая концентрация (ПДК) в атмосферном воздухе населенных мест - 200 кл/м³, пометка А.

3. Пределы измерений

Методика обеспечивает выполнения измерений количества клеток плесневого гриба в атмосферном воздухе населенных мест в диапазоне концентраций от 100 до 5 000 клеток в 1 м³ воздуха при доверительной вероятности 0,95.

4. Метод измерений

Метод основан на аспирации из воздуха клеток плесневого гриба на поверхность среды сусло-агар и подсчета выросших колоний по типичным культурально-морфологическим признакам и яркому оранжево-желтому окрашиванию субстрата на 3 сутки.

5. Средства измерений, вспомогательные устройства,
реактивы и материалы

При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства и материалы.

6. Требования безопасности

При выполнении измерений концентрации клеток штамма-продуцента в атмосферном воздухе соблюдают следующие требования:

6 1. Правила техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.005-88.

6.2. Электробезопасность при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-79 и инструкции по эксплуатации прибора.

6.3. «Инструкции по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности» (1977).

6.4. Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами.

7. Требования к квалификации операторов

К выполнению измерений и обработке их результатов допускают лиц с высшим или средним специальным образованием, прошедших соответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области микробиологических исследований.

8. Условия измерений

Процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят в нормальных условиях при температуре воздуха (20 ± 5 °С), атмосферном давлении 630-800 мм рт. ст. и влажности воздуха не более 80 %.

9. Проведение измерения

9.1. Условия отбора проб воздуха

Для определения концентрации клеток плесневого гриба воздух аспирируют при помощи аппарата Кротова со скоростью 10 л/мин на поверхность среды сусло-агар. Время аспирации воздуха (5 - 20 мин) зависит от предполагаемой концентрации клеток штамма-продуцента.

Аппарат Кротова перед каждым отбором пробы воздуха тщательно протирают спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенку прибора; наружную и внутреннюю стенку крышки. На подвижной диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо. После отбора пробы воздуха и остановки диска, прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы.

9.2. Выполнение анализа

Метод предполагает учет количества типичных колоний, выросших на 3 сутки после посева проб воздуха, по культурально-морфологическим признакам и яркой оранжево-желтой пигментации среды. Прямой метод позволяет учитывать на чашке до 200 колоний продуцента.

Агаризованную среду сусло-агар расплавляют, остужают до 50-60 °С, добавляют молочную кислоту из расчета 2 мл на 0,5 л среды (для подавления посторонней бактериальной микрофлоры), тщательно перемешивают и разливают по 10 мл в стеклянные чашки Петри на горизонтальной поверхности.

Чашки с застывшей средой помещают в термостат на сутки при температуре 37 °С, после чего проросшие чашки бракуют, стерильные чашки используют для контроля воздуха.

После отбора проб воздуха чашки Петри помещают в термостат при температуре 38-42 °С (повышенная температура, способствует более быстрому росту колоний и плодоношений рода Asper-gillus). Через 2-3 суток производят подсчет выросших типичных колоний продуцента. При необходимости культуру подвергают микроскопированию.

10. Вычисление результатов измерения

Расчет концентрации клеток продуцента в пересчете на 1 м³ воздуха производят по формуле:

кл/м³ ,где

Х- концентрация клеток продуцента в воздухе,

N - количество колоний продуцента, выросших на чашке,

1 000 - коэффициент пересчета на 1 м³ воздуха,

V - объем воздуха, л (произведение скорости на время аспирации).

11. Оформление результатов измерений

Результаты измерений оформляют протоколом по форме.

Протокол №
количественного микробиологического анализа штамма-продуцента
Aspergillus awamori ВНИИгенетика 120/177
в атмосферном воздухе населенных мест

1. Дата проведения анализа______________

2. Место отбора пробы__________________

3.Название лаборатории_________________

4.Юридический адрес организации_______

Результаты микробиологического анализа

Шифр или № пробы	Определяемый микроорганизм	Концентрация, кл/м3

Ответственный исполнитель

Научный руководитель

Список литературы

1. Руководство по контролю загрязнения атмосферы: РД 52.04.186 -96. М., 1991.693с.

2. ГОСТ 8.563-96. ГСИ «Методики выполнения измерений».

3. Положение об организации работы по технике безопасности в микробиологической промышленности. М., 1980. 27 с.

4. Инструкции по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности. М., 1977. 7с.

5. ГОСТ 17.2.4.02-81 «Охрана природы. Атмосфера. Общие требования к методам определения загрязняющих веществ».

6. Влодавец В. В. К определению плесневых грибов рода Asper-gillus в воздухе лечебных учреждений// Гиг. и сан., 1988. № 8.93-95с.

7. Бабьева И. П., Зенова Г. М. Биология почв. М.: МГУ. 122с.

СОДЕРЖАНИЕ