Государственное
санитарно-эпидемиологическое нормирование
Российской Федерации
Государственные санитарно-эпидемиологические
правила и гигиенические нормативы
4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
Метод микробиологического измерения
концентрации клеток
микроорганизма
Trichoderma viride 44-11-62/3 - продуцента
комплекса целлюлолитических ферментов
в
воздухе рабочей зоны
Методические указания
МУК 4.2.1784-03
МИНЗДРАВ РОССИИ
МОСКВА 2004
Методические указания. - М.: Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России, 2004.
1. Разработаны: Российским государственным медицинским университетом (к.б.н. Н.И. Шеиной).
2. Утверждены Первым заместителем министра здравоохранения Российской Федерации - Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 24 октября 2003 г.
3. Введены в действие с 1 декабря 2003 г.
4. Введены впервые.
УТВЕРЖДАЮ
Главный государственный санитарный
врач Российской Федерации,
Первый заместитель Министра
здравоохранения Российской Федерации
Г.Г. Онищенко
24 октября 2003 г.
Дата введения: 1 декабря 2003 г.
4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
Метод микробиологического измерения концентрации
клеток микроорганизма Trichoderma viride 44-11-62/3 –
продуцента комплекса целлюлолитических ферментов в воздухе рабочей зоны
Методические указания
МУК 4.2.1784-03
1. Общие положения и область применения
Настоящие методические указания устанавливают методику проведения микробиологического количественного анализа концентрации клеток штамма - Trichoderma viride 44-11-62/3 продуцента комплекса целлюлолитических ферментов (целлюлаза, ксиланаза) в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 100 до 5000 клеток в 1 м3 воздуха.
Методические указания разработаны в соответствии с требованиями ГОСТ 12.1.005-88 «ССБТ. Воздух рабочей зоны. Общие санитарно-гигиенические требования» и Р 8.563-96 «Методики выполнения измерений».
Методические указания предназначены для применения в лабораториях предприятий, организаций и учреждений, аккредитованных в установленном порядке на право проведения микробиологических исследований.
Методические указания одобрены и рекомендованы секцией «Гигиенические аспекты биотехнологии и микробного загрязнения окружающей среды» Проблемной комиссии «Научные основы гигиены окружающей среды».
2. Характеристика штамма-продуцента Trichoderma viride 44-11-62/3
На агаризованной среде сусло-агар (содержание солодового сусла 5 - 6° по Баллингу) на 5 день развития микроорганизм образует характерные колонии до 5 - 5,5 см в диаметре с гладкой подошвой, слегка приподнятые над поверхностью среды, не врастающие в агар, с волнистым краем, пушистым воздушным мицелием, который покрыт спорами лимонно-желтого цвета. На 3 день развития в среду выделяется ярко-желтый пигмент лимонного оттенка. Гифы мицелия бесцветные, септированные, многократно ветвистые.
Систематическое положение микроорганизма.
Класс Fungi imperfecti
Порядок Hyphomycetales
Род Trichoderma
Вид viride
Штамм 44-11-62/3
Штамм Trichoderma viride 44-11-62/3 получен во ВНИИбиотехнология в лаборатории Биосинтеза ферментов методом индуцированной селекции с применением этиленимина и нитрозометилмочевины из исходной культуры Trichoderma viride 44 - продуцента целлюлазы и депонирован в ЦМПМ ВНИИгенетика.
Штамм-продуцент синтезирует высокоактивный комплекс целлюлолитических ферментов для производства ферментного препарата целловиридин Г3х. Максимальная активность целлюлазы составляет 35 ед./мл, ксиланазы - 42 ед./мл.
Штамм-продуцент растет на жидких и агаризованных средах. Культивирование гриба происходит 5 суток при температуре 36 - 38 °С, затем 5 суток при комнатной температуре. Для размножения и хранения используется сусло-агар 5 - 6 °Б. рН среды - 5,0 - 6,0.
Предельно допустимая концентрация (ПДК) в воздухе рабочей зоны - 2000 кл./м3, А.
3. Пределы измерений
Методика обеспечивает выполнение измерений количества клеток штамма-продуцента в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 100 до 5000 клеток в 1 м3 воздуха при доверительной вероятности 0,95.
4. Метод измерений
Прямой метод измерения концентрации штамма-продуцента основан на аспирации из воздуха микробных клеток (спор, фрагментов мицелия) на поверхность плотной питательной среды сусло-агар и подсчета выросших колоний по культурально-морфологическим признакам на день развития.
Косвенный метод измерения концентрации штамма-продуцента основан на аспирации из воздуха микробных клеток на поверхность плотной питательной селективной среды и подсчета выросших колоний по зонам просветления, образующихся вокруг каждой колонии штамма как результат продукции целлюлазы на среде с окрашенной целлюлозой.
5. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы
При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства и материалы.
5.1. Средства измерений, вспомогательные устройства, материалы
Прибор для бактериологического анализа
воздуха, модель 818 (щелевой прибор Кротова) ТУ 64-12791-77
Термостаты электрические суховоздушные
или водяные
Автоклав электрический ГОСТ 9586-75
Бокс, оборудованный бактерицидными лампами
Холодильник бытовой
Весы лабораторные, аналитические типа ВЛА-200
Микроскоп биологический с иммерсионной
системой типа «Биолам» Л-211
Лупа с увеличением ´ 10 ГОСТ 25706-83
Чашки Петри бактериологические плоскодонные,
стеклянные, диаметром 100 мм
Пробирки биологические, вместимостью 20 и 35 мл ГОСТ 10515-75
Пипетки мерные на 1, 5 и 10 мл ГОСТ 10515-75
Пипетки мерные на 1, 5 и 10 мл ГОСТ 1770-74
Колбы конические, вместимостью 250 и 500 мл ГОСТ 1770-74
Секундомер ГОСТ 9586-75
Барометр ГОСТ 24696-79
Марля медицинская ГОСТ 9412-77
Вата медицинская гигроскопическая ГОСТ 25556-81
5.2. Реактивы, растворы
Агаризованное пивное сусло 5 - 6 °Б для штамма-
продуцента (агар - 1,8 %, рН 5,0 - 6,0,
режим стерилизации 1,1 - 1,2 ати в течение 30 мин)
Молочная кислота, синоним-альфа-оксипролиновая
кислота (из расчета 0,4 мл на 100 мл среды
сусло-агар для подавления посторонней бактериальной
микрофлоры) ГОСТ 490-79
Бенгальский розовый
Диметилсульфоксид
Спирт этиловый ректификат ГОСТ 5962-67
Селективная среда для штамма-продуцента.
Состав среды: КН2РО4 - 1 г; MgSO4×7H2О - 0,5 г;
(NH4)2SO4 - 0,7 г; целлюлоза порошковая
в пересчете на сухое вещество - 0,9 г; лактоза -0,3 г;
дрожжевой экстракт - 0,5 г; агар - 18 г;
вода дистиллированная - до 1000 мл
6. Требования безопасности
При выполнении измерений концентрации клеток штамма-продуцента, в воздухе рабочей зоны соблюдают следующие требования:
6.1. Правила техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.005-88.
6.2. Электробезопасность при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-79 и инструкции по эксплуатации прибора.
6.3. Руководство «Положение об организации работы по технике безопасности в микробиологической промышленности» (1980), «Инструкции по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности» (1977).
6.4. Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованным бактерицидными лампами.
7. Требования к квалификации операторов
К выполнению измерений и обработке их результатов допускают лиц с высшим или средним специальным образованием, прошедших соответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области микробиологических исследований.
8. Условия измерений
Процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят в нормальных условиях при температуре воздуха (20 ± 5 °С), атмосферном давлении 630 - 800 мм рт.ст. и влажности воздуха не более 80 %.
9. Проведение измерения
9.1. Условия отбора проб воздуха
Для определения концентрации клеток штамма-продуцента воздух аспирируют при помощи аппарата Кротова со скоростью 10 л/мин на поверхность плотной питательной среды. Время аспирации воздуха (1 - 10 мин) зависит от предполагаемой концентрации клеток продуцента (прямой метод позволяет учитывать на чашке до 200 колоний продуцента, косвенный - до 30 - 50 колоний на чашке).
Аппарат Кротова перед каждым отбором пробы воздуха тщательно протирают спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенку прибора, наружную и внутреннюю стенку крышки.
На подвижной диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо.
После отбора пробы воздуха и остановки диска, прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы.
9.2. Выполнение анализа
При выполнении анализа воздуха прямым методом среду сусло-агар расплавляют, остужают до 50 - 60 °С, добавляют молочной кислоты из расчета 0,4 мл на 100 мл среды (для подавления посторонней бактериальной микрофлоры), тщательно перемешивают и разливают в чашки Петри.
При выполнении анализа воздуха рабочей зоны косвенным методом селективную среду расплавляют, остужают до 60 °С, добавляют 50 мг/л бенгальского розового, растворенного в 1 мл диметилсульфоксида, тщательно перемешивают и разливают по 10 мл в стеклянные чашки Петри на горизонтальной поверхности. Бенгальский розовый предназначен для специфического окрашивания целлюлозы и для ограничения разрастания колоний на чашках.
Чашки с застывшей средой помещают в термостат на сутки при температуре 37 °С, после чего проросшие чашки бракуют, стерильные чашки используют для контроля воздуха.
После отбора проб воздуха чашки Петри помещают в термостат на 42 °С (для интенсификации развития). Через 3 суток производят подсчет выросших колоний по культурально-морфологическим признакам и характерной пигментации среды (прямой метод) или зон просветления вокруг выросших колоний продуцента (косвенный метод) как результат продукции целлюлолитических ферментов на среде с окрашенной целлюлозой.
10. Вычисление результатов измерения
Расчет концентрации клеток продуцента в пересчете на 1 м3 воздуха производят по формуле:
кл./м3, где
Х - концентрация клеток продуцента в воздухе;
N - количество колоний продуцента, выросших на чашке;
1000 - коэффициент пересчета на 1 м3 воздуха;
V - объем воздуха, л (произведение скорости на время аспирации).
11. Оформление результатов измерений
Результаты измерений оформляют протоколом по форме.
Протокол №
количественного микробиологического анализа штамма-продуцента Trichoderma viride 44-11-62/3 в воздухе рабочей
зоны
|
1. Дата проведения анализа ___________________________________________________ |
|
2. Место отбора пробы _______________________________________________________ |
|
3. Название лаборатории _____________________________________________________ |
|
4. Юридический адрес организации ___________________________________________ |
Результаты микробиологического анализа
|
Шифр или № пробы |
Определяемый микроорганизм |
Концентрация, кл./м3 |
|
|
|
|
Ответственный исполнитель
Научный руководитель
Список литературы
1. ГОСТ 12.1.005-88 «ССБТ. Воздух рабочей зоны. Общие санитарно-гигиенические требования».
2. ГОСТ 8.563-96. ГСИ «Методики выполнения измерений».
3. Положение об организации работы по технике безопасности в микробиологической промышленности. - М., 1980. 27 с.
4. Инструкции по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности. - М., 1977. 7 с.
5. Бабьева И.П., Зенова Г.М. Биология почв. М.: МГУ. 122 с.
СОДЕРЖАНИЕ