Государственное санитарно-эпидемиологическое нормирование Российской Федерации

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Метод микробиологического измерения
концентрации клеток микроорганизма
Pseudomonas fluorescens (denitrificans)
В 99 - продуцента витамина В₁₂
в воздухе рабочей зоны

Методические указания

МУК 4.2.1008-00

Минздрав России

Москва 2001

Метод микробиологического измерения концентрации клеток микроорганизма Pseudomonas fluorescens (denitrificans) В 99 - продуцента витамина B₁₂ в воздухе рабочей зоны: Методические указания. - М.: Федеральный центр госсанэпиднадзора Минздрава России, 2001.

1. Разработаны канд. биол. наук Бару Р.В., канд. биол. наук Лапчинской А.В. (Государственный научный центр по антибиотикам).

2. Утверждены и введены в действие Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации - Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации 21 декабря 2000 г.

3. Введены впервые.

СОДЕРЖАНИЕ

УТВЕРЖДАЮ

Главный государственный санитарный врач

Российской Федерации - Первый заместитель

Министра здравоохранения Российской Федерации

Г.Г. Онищенко

21 декабря 2000 г.

Дата введения: с момента утверждения

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Метод микробиологического измерения
концентрации клеток микроорганизма
Pseudomonas fluorescens (denitrificans)
В99 - продуцента витамина В₁₂ в воздухе рабочей зоны

Методические указания

1. Общие положения и область применения

Настоящие методические указания устанавливают методику проведения микробиологического количественного анализа концентрации клеток штамма Pseudomonas fluorescens (denitrificans) В99 - продуцента витамина В₁₂ в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 100 до 3000 клеток в 1 м³ воздуха.

Методические указания разработаны в соответствии с требованиями ГОСТ 12.1.005-88 «ССБТ. Воздух рабочей зоны. Общие санитарно-гигиенические требования» и ГОСТ 8.563-96 «Методики выполнения измерений».

Методические указания предназначены для применения в лабораториях предприятий, организаций и учреждений, аккредитованных в установленном порядке на право проведения микробиологических исследований.

Методические указания одобрены и рекомендованы секцией «Гигиенические аспекты биотехнологии и микробного загрязнения окружающей среды» Проблемной комиссии «Научные основы гигиены окружающей среды».

2. Характеристика штамма-продуцента витамина В₁₂

Микроорганизм Pseudomonas fluorescens (denitrificans) В99 является продуцентом витамина В₁₂. Штамм растет на агаризованных средах на основе мелассы при температуре 28°С. В течение 3-х суток образует округлые колонии 1 - 2 мм белого цвета. Морфологически представляет собой грамотрицательные подвижные палочки размером 0,45 - 0,85´0,6 мкм. Штамм устойчив к следующим антибиотикам: левомицину, линкомицину, полимиксину М, ристомицину, цефалотину и эритромицину.

Предельно допустимая концентрация (ПДК) в воздухе рабочей зоны - 2000 кл/м³.

3. Пределы измерений

Методика обеспечивает выполнение измерений количества клеток продуцента витамина В₁₂ в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 100 до 3000 клеток в 1 м³ воздуха при доверительной вероятности 0,95.

4. Метод измерений

Метод основан на аспирации из воздуха клеток продуцента витамина В₁₂ на поверхность плотной питательной среды и подсчете высохших колоний по типичным морфологическим признакам.

5. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы

При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства и материалы.

5.1. Средства измерений, вспомогательные устройства, материалы

5.2. Реактивы, растворы

Антибиотики: левомицетин, линкомицин, полимиксин М, цефалотин, эритромицин.

Спирт этиловый ректификат ГОСТ 5962-67

Селективная среда для штамма-продуцента.

Среда: меласса - 100 - 150 г; (NН₄)₂НРО₄ - 1,3 г; MgSО₄7H₂О - 1,0 г; (NН₄)₂SО₄ - 0,5 г; MnSO₄H₂O - 0,1 г; ZnSO₄7H₂O - 0,1 г; агар Difco - 20 г; вода дистиллированная - до 1000 мл; рН - 6,8 - 7,0; стерилизация 121°С, 30 минут.

6. Требования безопасности

При выполнении измерений концентрации клеток продуцента витамина В₁₂ в воздухе рабочей зоны соблюдают следующие требования.

6.1. Правила техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.005-88.

6.2. Электробезопасность при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-79 и инструкции по эксплуатации прибора.

6.3. Руководство «Положение об организации работы по технике безопасности в микробиологической промышленности» (1980), «Инструкция по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности» (1977).

6.4. Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическими материалами осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами.

7. Требования к квалификации операторов

К выполнению измерений и обработке их результатов допускают лиц с высшим и средним специальным образованием, прошедших соответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области микробиологических исследований.

8. Условия измерений

Процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят в нормальных условиях при температуре воздуха 20±5°С, атмосферном давлении 630 - 800 мм рт. ст. и влажности воздуха не более 80%.

9. Проведение измерения

9.1. Условия отбора проб воздуха

Для определения продуцента витамина B₁₂ в воздух аспирируют при помощи аппарата Кротова со скоростью 10 л/мин на поверхность плотной питательной среды. Время аспирации воздуха (1 - 10 мин) зависит от предполагаемой концентрации клеток продуцента.

Аппарат Кротова перед каждым отбором воздуха тщательно протирают спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенку прибора; наружную и внутреннюю стенку крышки. На подвижной диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо. После отбора пробы воздуха и остановки диска прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы.

9.2. Выполнение анализа

Метод предлагает учет количества типичных по морфологическим признакам колоний, выросших на 2 - 3 сутки после посева воздуха. Прямой метод позволяет учитывать на чашке до 200 колоний продуцента.

Селективную среду расплавляют, остужают до 60°С, добавляют свежеприготовленный в стерильной дистиллированной воде раствор антибиотика (левомицитин, линкомицин, цефалотин и др.) из расчета 30 мкг на 1 мл среды (для подавления посторонней бактериальной микрофлоры), тщательно перемешивают и разливают по 10 мл в стеклянные чашки Петри на горизонтальной поверхности. Чашки с застывшей средой помещают в термостат на сутки при температуре 37°С, после чего проросшие чашки бракуют, стерильные чашки используют для контроля воздуха.

После отбора проб воздуха чашки Петри помещают в термостат на 28°С. Через 48 - 72 часа производят подсчет выросших типичных колоний продуцента. При необходимости культуру подвергают микроскопированию.

10. Вычисление результатов измерения

Расчет концентраций клеток продуцента в пересчете на 1 м³ воздуха производят по формуле

, кл/м³,

где Х - количество микробных клеток в воздухе;

N - количество колоний продуцента, выросших на чашке;

1000 - коэффициент перевода на 1 м³ воздуха;

V - объем воздуха, л (произведение скорости на время аспирации).

В случае невозможности использования аппарата Кротова рекомендуется применять метод седиментации клеток продуцента из воздуха непосредственно на чашки Петри с полной питательной средой. Время отбора проб воздуха может составлять до 60 минут (при определении концентрации микроорганизма в атмосферном воздухе).

При использовании этого метода пользуются следующим расчетом концентрации клеток продуцента: эмпирически установлено, что за 5 мин на площадь 100 см² оседает количество бактерий, содержащееся в 10 л воздуха, за 1 мин - 2 л воздуха. Площадь чашки Петри диаметром 100 мм (радиус 8 см) равна 78,54 см².

Составляем пропорцию:

на 100 см² за 1 мин оседает 2 л воздуха

на 78,54 см² - Х л

Х= 1,57 л/мин.

Следовательно, на стеклянную чашку Петри за 1 мин оседает 1,57 л воздуха.

Надо определить количество клеток в 1 м³ воздуха.

На 1 чашку (диаметр 100 мм) за 1 мин оседает количество микробов, содержащихся в 1,57 л воздуха, за Т мин - 1,57×Т, л.

В этом количестве содержится N колониеобразующих единиц (микробных клеток - спор, обрывков мицелия), а в 1 м³ воздуха содержится

.

Пример: за 30 мин седиментации выросло 12 колоний микроорганизма. В 1 м³ воздуха содержится

 клетки.

11. Оформление результатов измерений

Результаты измерений оформляют протоколом по форме.

Протокол №

количественного микробиологического анализа штамма-продуцента Pseudomonas fluorescens (denitrificans) B99 в воздухе рабочей зоны.

1. Дата проведения анализа _________________________

2. Место отбора пробы _____________________________

3. Название лаборатории ___________________________

4. Юридический адрес организации __________________

Результаты микробиологического анализа

Ответственный исполнитель

Научный руководитель

Список литературы

1. ГОСТ 12.1.005-88 «ССБТ. Воздух рабочей зоны. Общие санитарно-гигиенические требования».

2. ГОСТ 8.563-96. ГСИ. «Методики выполнения измерений».

3. Положение об организации работы по технике безопасности в микробиологической промышленности. - М., 1980. - 27 с.

4. Инструкции по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности. - М., 1977. - 7 с.