ГОСУДАРСТВЕННОЕ
САНИТАРНО-ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОЕ
НОРМИРОВАНИЕ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
ГОСУДАРСТВЕННЫЕ
САНИТАРНО-ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКИЕ
ПРАВИЛА И НОРМАТИВЫ
4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ.
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
Метод микробиологического измерения
концентрации клеток микроорганизма
Trichoderma longibrachiatum TW-1 - продуцента
b-глюканазы
в воздухе рабочей зоны
Методические указания
МУК 4.2.1070-01
Минздрав России
Москва 2002
1. Разработаны к. м. н. В. И. Бобровым (ВНЦ по безопасности биологически активных веществ).
2. Утверждены и введены в действие Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации - Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации 20 сентября 2001 г.
3. Введены впервые.
СОДЕРЖАНИЕ
УТВЕРЖДАЮ
Главный государственный
санитарный врач Российской
Федерации - Первый заместитель
Министра здравоохранения
Российской Федерации
Г. Г. Онищенко
20 сентября 2001 г.
МУК 4.2.1070-01
Дата введения: с момента
утверждения
4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
Метод микробиологического измерения концентрации клеток микроорганизма Trichoderma longibrachiatum TW-1 - продуцента b-глюканазы в воздухе рабочей зоны
Методические указания
1. Общие положения и область применения
Настоящие методические указания устанавливают методику проведения микробиологического количественного анализа концентрации клеток штамма - Trichoderma longibrachiatum TW-1-продуцента b-глюканазы в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 100 до 6000 клеток в 1 м3 воздуха.
Методические указания разработаны в соответствии с требованиями ГОСТ 12.1.005-88 «ССБТ. Воздух рабочей зоны. Общие санитарно-гигиенические требования» и ГОСТ Р 8.563-96 «Методики выполнения измерений».
Методические указания предназначены для применения в лабораториях предприятий, организаций и учреждений, аккредитованных в установленном порядке на право проведения микробиологических исследований.
2. Характеристика штамма-продуцента b-глюканазы
Продуцент b-глюканазы Trichoderma longibrachiatum TW-1 относится к классу несовершенных грибов. Рост характерных колоний определяется на 5-6 сутки. На агаризованной среде СМ микроорганизм образует характерные колонии до 15 мм в диаметре с гладкой подошвой, не врастающие в агар, с волнистым краем, пушистым воздушным мицелием, который покрыт спорами белого и желтого цвета. Гифы мицелия бесцветные, септированные, многократно ветвистые. Оптимальная температура роста 28-30 °С.
Предельно допустимая концентрация (ПДК) в воздухе рабочей зоны - 5000 кл/м3, 3 класс опасности, пометка А.
3. Пределы измерений
Методика обеспечивает выполнение измерений количества клеток продуцента b-глюканазы в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 100 до 6000 клеток в 1 м3 воздуха при доверительной вероятности 0,95.
4. Метод измерений
Метод измерения концентрации штамма-продуцента основан на аспирации из воздуха микробных клеток (спор, фрагментов мицелия) продуцента b-глюканазы на поверхность плотной питательной среды СМ и подсчета выросших колоний по зонам просветления, образующихся вокруг каждой колонии штамма как результат продукции b-глюканазы на среде с окрашенной целлюлозой.
5. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы
При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства и материалы.
5.1. Средства измерений, вспомогательные устройства, материалы
Прибор для бактериологического анализа воздуха, модель 818 (щелевой прибор Кротова) ТУ 64-12791-77
Термостаты электрические суховоздушные или водяные
Автоклав электрический ГОСТ 9586-75
Бокс, оборудованный бактерицидными лампами
Холодильник бытовой
Весы лабораторные, аналитические типа ВЛА-200
Микроскоп биологический с иммерсионной системой типа «Биолам» Л-211
Лупа с увеличением х 10 ГОСТ 25706-83
Чашки Петри бактериологические плоскодонные стеклянные, диаметром 100 мм
Пробирки биологические, вместимостью 20 и 35 мл ГОСТ 10515-75
Пипетки мерные на 1, 5 и 10 мл ГОСТ 10515-75
Пипетки мерные на 1,5, и 10 мл ГОСТ 1770-74
Колбы конические, вместимостью 250 и 500 мл ГОСТ 1770-74
Секундомер ГОСТ 9586-75
Барометр ГОСТ 24696-79
Марля медицинская ГОСТ 9412-77
Вата медицинская гигроскопическая ГОСТ 25556-81
5.2. Реактивы, растворы
Бенгальский розовый
Диметилсульфоксид
Спирт этиловый ректификат ГОСТ 5962-67
Селективная среда для штамма-продуцента b-глюканазы
Состав среды: КН2РO4- 1 г; MgSO4×7Н2O - 0,5 г; (NH4)2SO4 - 5 г; целлюлоза порошковая в пересчете на сухое вещество - 5 г; глюкоза - 5 г; дрожжевой экстракт - 0,5 г; агар - 20 г;
вода дистиллированная - до 1000 мл.
6. Требования безопасности
При выполнении измерений концентрации клеток продуцента b-глюканазы в воздухе рабочей зоны соблюдают:
· правила техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.005-88;
· правила электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-79 и инструкцию по эксплуатации прибора;
· требования, изложенные в руководстве «Положение об организации работы по технике безопасности в микробиологической промышленности» (1980);
· положения «Инструкций по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности» (1977).
Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами.
7. Требования к квалификации операторов
К выполнению измерений и обработке их результатов допускаются лица с высшим или средним специальным образованием, прошедшие соответствующую подготовку и имеющие навыки работы в области микробиологических исследований.
8. Условия измерений
Процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят в нормальных условиях при температуре воздуха (20 ± 5) °С, атмосферном давлении 630-800 мм рт. ст. и влажности воздуха не более 80 %.
9. Проведение измерений
9.1. Условия отбора проб воздуха
Для определения продуцента b-глюканазы воздух аспирируют при помощи аппарата Крогова со скоростью 10 л/мин на поверхность плотной питательной среды. Время аспирации воздуха (1- 10 мин) зависит от предполагаемой концентрации клеток продуцента, а прямой метод позволяет учитывать на чашке до 200 колоний продуцента.
Аппарат Кротова перед каждым отбором пробы воздуха тщательно протирают спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенку прибора, наружную и внутреннюю стенку крышки.
На подвижный диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо.
После отбора пробы воздуха и остановки диска, прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы.
9.2. Выполнение анализа
Метод предполагает учет количества колоний, выросших на 2-3 сутки после посева проб воздуха по зонам просветления, которые являются результатом образования целлюлаз на срезах с окрашенной целлюлозой в присутствии повышенного количества глюкозы.
Существенным признаком промышленных мутантов рода Trichoderma является пониженная катаболическая репрессия по сравнению с дикими мутантами Trichoderma. В то время как у диких штаммов глюкоза в концентрациях выше 0,02 г/л практически полностью подавляет образование целлюлаз в глубинной культуре, у промышленных мутантов подавление образования целлюлаз начинается при концентрациях глюкозы выше 1 г/л.
Селективную среду расплавляют, остужают до 60 °С, добавляют 50 мг/л бенгальского розового, растворенного в 1 мл диметил-сульфоксида, тщательно перемешивают и разливают по 10 мл в стеклянные чашки Петри на горизонтальной поверхности. Бенгальский розовый предназначен для специфического окрашивания целлюлозы и для ограничения разрастания колоний на чашках. Чашки с застывшей средой помещают в термостат на сутки при температуре 37 °С, после чего проросшие чашки бракуют, стерильные чашки используют для контроля воздуха.
После отбора проб воздуха чашки Петри помещают в термостат при 28-30 °С на 2 дня и затем при температуре 44 °С на 18 ч для образования вокруг колоний зон просветления.
Количественный учет микробных клеток штамма-продуцента b-глюканазы проводится методом подсчета зон просветления, образующихся вокруг колоний микроорганизма как результат продукции глюканазы на среде СМ с окрашенной целлюлозой.
10. Вычисление результатов измерений
Расчет концентрации клеток продуцента в пересчете на 1 м3 воздуха производят по формуле:
кл/м3, где
Х - концентрация клеток продуцента в воздухе;
N - количество колоний продуцента, выросших на чашке;
1000 - коэффициент пересчета на 1 м3 воздуха;
V - объем воздуха, л (произведение скорости на время аспирации).
11. Оформление результатов измерений
Результаты измерений оформляют протоколом по форме:
Протокол №
количественного микробиологического анализа штамма-продуцента Trichoderma longibrachiatum TW-1 в воздухе рабочей зоны
Дата проведения анализа
Место отбора пробы
Название лаборатории
Юридический адрес организации
Результаты микробиологического анализа
|
Шифр или № пробы |
Определяемый микроорганизм |
Концентрация, кл/м3 |
|
|
|
|
Ответственный исполнитель
Научный руководитель
Список литературы
1. ГОСТ 12.1.005-88 «ССБТ. Воздух рабочей зоны. Общие санитарно-гигиенические требования».
2. ГОСТ 8.563-96 «ГСИ. Методики выполнения измерений».
3. Положение об организации работы по технике безопасности в микробиологической промышленности (М., 1980, 27 с.).
4. Инструкции по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности (М., 1977, 7 с.).