МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ДЕПАРТАМЕНТ ВЕТЕРИНАРИИ

от 9 ноября 2000 года N 13-7-2/2183

Методические указания по лабораторной диагностике пироплазмидозов животных

УТВЕРЖДАЮ

Заместитель руководителя Департамента ветеринарии Е.А.Непоклонов

     1. Общие положения

1.1. Пироплазмидозы (бабезиоз, тейлериоз) - протозойные болезни животных, вызываемые возбудителями отряда Piroplasmida. Возбудители пироплазмидозов обладают видовой специфичностью.

Пироплазмидозы вызывают у лошадей - Piroplasma caballi (Babesia caballi), Nuttallia equi (B. equi): у крупного рогатого скота - P. bigeminum (B. bigemina), Babesia bovis (Francaiella colchica), B. divergens; у овец и коз - P. ovis (B. motasi). В.ovis; у собак P. canis (B. canis).

Тейлериоз вызывают у крупного рогатого скота - Theileria annulata и Th. sergenti; у овец и коз - Th. ovis.

Заболевания протекают остро, подостро, хронически и сопровождаются лихорадкой, анемией, желтушностью и кровоизлияниями на слизистых оболочках, гемоглобинурией (при пироплазмозе - бабезиозе), увеличением лимфатических узлов (при тейлериозе) и заканчиваются нередко гибелью животных.

1.2. Диагноз на пироплазмидозы ставят на основании эпизоотологических, клинических, патологоанатомических данных и результатов лабораторных исследований (микроскопического, серологического).

1.3. Лабораторные исследования на пироплазмидозы включают:

микроскопию мазков из крови, внутренних органов, головного мозга,

пунктатов лимфатических узлов:

морфологическую дифференциацию возбудителей;

постановку и учет реакции длительного связывания комплемента (РДСК) с нуталлийным антигеном для диагностики пироплазмидозов лошадей.

     2. Отбор и пересылка материала для исследования

2.1. В лабораторию для исследования направляют от подозреваемых в заболевании или больных животных: тонкие мазки крови из периферических сосудов уха, хвоста или венчика; на тейлериоз дополнительно - мазки из пунктатов лимфатических узлов; 1-2 см нативной сыворотки крови для серологического исследования на нутталлиоз, пироплазмоз лошадей; от павших и убитых животных - часть печени, легких, селезенки, почки, сердца, головного мозга и лимфатические узлы.

2.2. Мазки крови берут в период развития симптомов болезни, при повышенной температуре, до применения специфического лечения..

2.3. Перед отбором материала у животного шерсть на месте взятия крови выстригают, кожу тщательно протирают вначале ватным тампоном, смоченным в растворе этилового спирта, а затем сухим. Стерильной иглой делают прокол вены ушной раковины или ножницами надрезают край верхушки уха или хвоста. К свободной выступившей капле крови легко прикасаются поверхностью сухого обезжиренного предметного стекла. Затем стекло быстро поворачивают вверх каплей и удерживают пальцами левой руки в горизонтальном положении. Шлифованным краем другого предметного стекла (или покровного) прикасаются к капле крови. Как только кровь равномерно распределится по ребру этого стекла, им быстро проводят по поверхности стекла справа налево под углом 45°. Ширина мазка должна быть уже предметного стекла. Для каждого нового мазка берут свежую каплю крови. От каждого животного готовят по 2 мазка.

При исследовании большого количества подозрительных в заболевании животных, размещенных в помещении при беспривязном содержании, можно брать кровь с соблюдением правил асептики из яремной вены (V. Jugularis) одновременно в 2 пробирки для приготовления мазков и получения сыворотки.

Для приготовления мазков кровь берут в пробирки, содержащие трилон Б* (из расчета 0,1 см 10% раствора трилона Б на 1 см), в объеме 1,0 см, в другие пробирки - для получения сыворотки. Пробирки закрывают резиновыми пробками.

_______________

* Трилон Б - динатриевая соль этилендиаминтетроуксусная кислота

Мазки крови готовят из трилоновой крови в лабораторных условиях в день ее взятия. Готовые мазки крови высушивают на воздухе; подсушивать их над пламенем или на солнце нельзя. В холодное время года мазки делают в теплом помещении или на стеклах, подогретых на крышке стерилизатора. Правильно приготовленные мазки должны быть тонкими, равномерными, достаточной длины и заканчиваться на 0,5-1,0 см от края стекла.

Кровь для получения сыворотки ставят в термостат (+37°С) или другое теплое место; после полной ретракции сгустка его отделяют от стенок пробирки, обводя вокруг тонкой стерильной металлической спицей, и ставят в темное (прохладное) место для отстаивания сыворотки. Используют для исследования в РДСК сыворотку без следов гемолиза эритроцитов.

2.4. При взятии пунктата из лимфатических узлов животное надежно фиксируют, на месте пункции выстригают шерсть, кожу протирают ватным тампоном, смоченным в растворе спирта или настойки йода. Левой рукой оттягивают лимфатический узел и удерживают большим и указательным пальцами левой руки. Затем вглубь узла вводят стерильную иглу, надевают на нее шприц и поршнем отсасывают лимфу. После шприц отсоединяют, иглу извлекают, а содержимое шприца выдавливают поршнем на предметное стекло, делают тонкие мазки и высушивают на воздухе.

2.5. На высушенных мазках из крови и пунктата острым предметом или простым карандашом пишут номер, вид животного и дату их приготовления.

2.6. Материал от павших или убитых животных отбирают до наступления трупного окоченения.

2.7. Мазки упаковывают в чистую непористую бумагу, складывая их попарно так, чтобы мазки располагались на противоположных (наружных) сторонах предметных стекол, патологический материал помещают во влагонепроницаемую тару; сыворотки крови сливают после полного отстоя в другие пробирки и плотно закрывают резиновыми пробками.

Упакованные материалы - мазки из крови и пунктатов или трилоновую кровь и сыворотки крови в пробирках, части органов доставляют в лабораторию в день отбора.

     3. Микроскопическое исследование

3.1. Из доставленного для исследования патологического материала делают по 2 мазка из каждого объекта.

3.1.1. Мазки из головного мозга готовят путем заключения мелких кусочков между предметными стеклами. После растирания помещенного между ними материала стекла разъединяют в противоположные стороны в горизонтальном направлении, в результате чего получается два тонких мазка. Мазки высушивают на воздухе.

3.1.2. Из паренхиматозных органов готовят мазки-отпечатки. Для этого вырезанный острым скальпелем кусочек органа захватывают пинцетом и свободной поверхностью кусочка делают на стекле несколько тонких отпечатков. Мазки-отпечатки высушивают на воздухе.

3.2. Мазки фиксируют этиловым ректифицированным 95%-ным спиртом - 20-25 мин или смесью этилового спирта и серного эфира в равных количествах - 15-20 минут. После высушивания мазки окрашивают азур-эозином по Романовскому-Гимзе (краску разводят дистиллированной водой рН 7,0-7,2 в соотношении 1:10) - 30-45 минут (в зависимости от качества краски и температуры помещения), промывают дистиллированной водой рН 7,0-7,2 до исчезновения следов краски на фильтровальной бумаге, высушивают и исследуют под иммерсионной системой микроскопа (х 90). Качество окрашивания мазка определяют под микроскопом по окрашиванию лейкоцитов. Если лейкоциты бледно окрасились или не окрасились - исследовать препарат бесполезно, необходимо применить другую серию краски.

3.3. При микроскопии обнаруживают пироплазмы (бабезии) в эритроцитах, тейлерии и нутталлии (бабезии) экви - в эритроцитах и в клетках лимфоидной ткани в виде различной формы шизонтов. Цитоплазма пироплазмид окрашивается в голубовато-синеватый цвет, глыбки хроматина - в красно-фиолетовый или красный.

     4. Дифференциальная диагностика возбудителей и оценка результатов

4.1. Пироплазмид дифференцируют между собой по их форме, углу соединения парных грушевидных форм, соотношению их размера к радиусу эритроцита, локализации в эритроците, а также от анаплазм и эперитрозоон. При определении пользуются следующей таблицей:

4.2. Результат исследования считают положительным при обнаружении в препарате из исходного материала возбудителей пироплазмидозов.

4.3. В сомнительных случаях при диагностике пироплазмидозов лошадей ставят РДСК с нутталлийным антигеном ВИЭВ.

     5. Постановка и учет реакции длительного связывания комплемента (РДСК) с нутталлийным антигеном ВИЭВ

5.1. Реакция длительного связывания комплемента (РДСК) применяется для выяснения эпизоотического состояния хозяйств по пироплазмидозам лошадей, при необходимости постановки диагноза на нутталлио-, бабезионосительство.

5.2. Реакцию ставят в объеме 0,5 мл (по 0,1 мл каждого компонента) в пробирках 10-12x120 мм.

5.3. Компоненты реакции:

- антиген (лиофилизированный) с наполнителем из сахарозы и карбоксиметилцеллюлозы. Имеет вид пористой таблетки, хорошо растворим в физиологическом растворе, хранится при +2 - +4°С. Используют в рабочем титре, указанном на этикетке ампулы;

- испытуемые и контрольные (пироплазмидозная и нормальная) сыворотки лошадей в разведении 1:5, инактивированные при 58-59°С в течение 30 минут в день постановки реакции;

- комплемент - сыворотка морской свинки (свежая или лиофилизированная);

- гемолитическая сыворотка - гемолизин, выпускаемый биопромышленностью. В реакции используют тройной титр гемолизина;

- эритроциты барана, отмытые 3-кратно физиологическим раствором путем центрифугирования при 3000 об/мин в течение 10 мин. Из осадка готовят 2%-ную взвесь в физиологическом растворе.

Перед постановкой реакции взвесь эритроцитов и гемолизин, разведенный в тройном титре, смешивают в равных объемах (гемолитическая система) и смесь выдерживают 20 минут при температуре 37°С для сенсибилизации эритроцитов.

Титрование комплемента

Нативный комплемент перед титрованием разводят 1:30 (0,1 мл + 2,9 мл физиологического раствора). Сухой комплемент разводят 1:20 (0,1 мл комплемента + 1,9 мл физиологического раствора).

Титрование проводят в гемолитической системе:

Примечание: НГ - нет гемолиза; ЧГ - частичный гемолиз; ПГ - полный гемолиз.

Примечание: Для удобства в работе и более точной дозировки вначале рекомендуется приготовить необходимые разведения комплемента в 10-кратных объемах в отдельных пробирках.

Для этого в дополнительный ряд пробирок вносят комплемент разведенный 1:20 (1:30) в дозах 0.1: 0.2; 0,3 и т.д. до 1 мл, и добавляют в каждую пробирку недостающее до 3 мл соответственно 2,9: 2.8; 2,7; и т.д. Из первой пробирки этого ряда переносят по 0,3 мл жидкости в первую пробирку, из второй - во вторую соответственно и т.д. Эту работу можно выполнять аппаратом Флоринского.

Титром является наименьшее количество разведенного 1:30 (1:20) комплемента, который дает полный гемолиз эритроцитов. В приведенном примере титр равен 0,04. Для реакции берут 2 дозы, т.е. 0,08.

Расчет количества комплемента, необходимого для главного опыта, делают по формуле:

     ,

где А - рабочая доза комплемента, Б - количество пробирок в реакции, В - разведение комплемента, Х - количество чистого комплемента.

Пример: 0,08x100:20=0,4. Так как общий объем разведенного комплемента, необходимого для 100 пробирок, равен 10 мл (100x0,1 мл), то к 0,4 мл чистого комплемента следует добавить 9,6 мл физиологического раствора.

Главный опыт

Испытуемые сыворотки исследуют в разведении 1:5 с антигеном и без антигена.

Для контроля в реакцию берут 2 позитивные (пироплазменные или нутталлийные) и 2 негативные (нормальные) сыворотки в разведении 1:5. Одновременно ставят контроль антигена на антикомплементарность (антигена 0,2 мл - комплемента 0,1 мл - гемолизина 0,2 мл) и на гемотоксичность (антигена 0.1 мл- физиологического раствора 0,2 мл + 0,2 мл гемолитической системы).

Схема главного опыта:

После чего пробирки ставят в холодильник при температуре 2-4°С на 18-20 часов, а затем на 30 минут при комнатной температуре,

Гемолитическая система 0,2 0,2 0,2 0,2

Водяная баня при 37-38°С - 10-15 минут, в зависимости от прохождения контролей. Холодильник при 2-4°С - на 4-5 часов или на другой день - при условии хранения в холодильнике,

Примечание: позитивные и негативные сыворотки (контроли) испытывают по схеме главного опыта.

Учет реакции начинают с контролей: в испытуемых сыворотках без антигена (2-й ряд), в заведомо отрицательных сыворотках и контроле на антикомплементарность антигена должен быть полный гемолиз; в заведомо положительных сыворотках и контроле гемосистемы - полная задержка гемолиза. После проверки контролей учитывают результаты реакции с испытуемыми сыворотками. Степень задержки гемолиза эритроцитов отмечают крестами и оценивают:

5.4. Животных, с сывороткой крови которых получена сомнительная РДСК, исследуют повторно через месяц.

     6. Диагноз считают установленным при получении одного из следующих показателей:

обнаружение возбудителей пироплазмидозов при микроскопическом исследовании пат материала; получение положительного результата РДСК.

     7. Сроки исследования:

микроскопического до 2-дн,

серологического - 5-дн.

С утверждением настоящих Методических указаний утрачивают силу: "Методические указания по лабораторным исследованиям на пироплазмидозы животных", утвержденные Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России от 16 декабря 1996 г; "Наставление по постановке и учету реакции длительного связывания комплемента (РДСК) с нутталлийным антигеном ВИЭВ", утвержденное Главным управлением ветеринарии МСХ СССР от 04.03.1976 г. Методические указания по лабораторной диагностике пироплазмидозов животных переработаны, дополнены Всероссийским научно-исследовательским институтом экспериментальной ветеринарии (В.Т.Заблоцкий, Н.А.Казаков, З.П.Мутузкина, Х.Георгиу), Центральной научно-методической ветеринарной лабораторией (Т.И.Сидоркина, В.Д.Певнева).