ИНСТРУКЦИЯ
ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ВИТАМИНА С В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ

Метод визуального титрования витамина С является наиболее простым, доступным и широко используется как в нашей стране, так и за рубежом для определения этого витамина в пищевых продуктах, не содержащих естественных пигментов, мешающих визуальному установлению конца титрования.

Метод прошел широкую апробацию в различных лабораториях научных н практических учреждений (лаборатории пищевых отделов СЭС, кафедр гигиены питания медицинских институтов. лабораторий различных отраслей пищевой промышленности), одобрен Минздравом СССР и рекомендован для практического использования Межведомственной комиссией по составлению «Таблиц химического состава пищевых продуктов».

Принцип метода. Метод основан на способности аскорбиновой кислоты (АК), окисляясь, количественно восстанавливать 2,6-дихлорфенолиндофенолят натрия. АК экстрагируют раствором метафосфорной кислоты и титрируют 2,6-дихлорфенолиндофенолятом натрия до установления светло-розовой окраски. Дегидроаскорбиновую кислоту в АК восстанавливают цистеином. Для отделения АК от редуцирующих соединений, присутствующих в пищевых продуктах, подвергавшихся тепловой обработке и длительно хранившихся, экстракты обрабатывают формальдегидом при определенном pH.

Оборудование. Потенциометр; термостат водяной на 37 °С; весы лабораторные общего назначения с наибольшим пределом взвешивания 200 г, проверочной ценой деления не более 0,50 мг; весы лабораторные, общего назначения с наибольшим пределом взвешивания 500 г, поверочной ценой деления не более 50 мг; гомогенизатор.

Посуда. Ступка с пестиком; воронки фильтровальные диаметром 5 - 7,5 см; колбы мерные вместимостью 50 и 100 см³; микробюретки на 2 см³ с ценой деления 0,01 см³; пипетки градуированные на 1, 2, 5 и 10 см³; цилиндры мерные на 100 п 200 см³; стаканы на 50 и 100 см³.

Реактивы

1. Аскорбиновая кислота (Госфармакопея СССР, изд., ст. 6).

2. 2,6-дихлорфенолиндофенолят натрия.

3. Калий фосфорнокислый двузамещенный.

4. Метафосфорная кислота.

5. Натрий уксуснокислый.

6. Серная кислота ос.ч.

7. Уксусная кислота ледяная.

8. α-цистеин НCl.

9. Формальдегид 36 - 38 %.

10. Этилендиаминтетрауксусная кислота.

11. Бумага фильтровальная.

Приготовление реактивов.

1. Раствор метафосфорной кислоты 6 % и 3 %. Растирают в ступке 60 г. НРО₃ и растворяют в 940 см³ дистиллированной воды без нагревания. При стоянии раствор медленно гидролизуется до Н₃РО₄, поэтому свежий раствор готовят еженедельно. 3 % раствор НР готовят в день проведения анализа из 6 % раствора.

2. Стандартные растворы аскорбиновой кислоты (АК) с массовой концентрацией 1 мг/см³ и 0,1 мг/см³. Растворяют 0,1000 г АК в мерной колбе на 100 см³ в 3 % растворе метафосфорной кислоты и доводят тем же раствором кислоты до метки (раствор с массовой концентрацией 1 мг/см³). Для приготовления раствора 0,1 мг/см³ 10 см³ раствора АК с концентрацией 1 мг/см³ вносят в мерную колбу вместимостью 100 см³ и доводят до метки 3 % раствором метафосфорной кислоты. Растворы неустойчивы, их приготовляют непосредственно перед их применением.

3. Раствор 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия 0,04 %. Растворяют 0,2 г 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия в 300 см³ горячей свежекипяченой (в течение 30 мин) дистиллированной воды, фильтруют через складчатый фильтр в мерную колбу вместимостью 500 см³ и промывают фильтр горячей водой. После охлаждения раствор доводят до метки охлажденной свежекипяченой дистиллированной водой. Срок годности раствора при хранении в холодильнике не более 20 дней.

Установка титра раствора 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия: в две конические колбы наливают по 9 см³ 3 % раствора метафосфорной кислоты и по 1 см³ раствора АК с массовой долей 0,1 мг см³ и быстро титруют раствором 2,6-дихлорфенолиндофенола натрия до светло-розовой окраски не исчезающей в течение 10 - 15 сек. Таким же образом титруют 10 см³ 3 % раствора метафосфорной кислоты (контроль на реактивы). Поправку к титру раствора вычисляют по формуле Т = 0,10 : (V - V₁), где 0,10 - количество АК в 1,0 см³ стандартного раствора, мг; V - объем раствора 2,6-дихлорфенолиндофенола, затраченный на титрование стандартного раствора АК, см³; V₁ - объем 2,6-дихлорфенолиндофенола, затраченный на титрование 3 % раствора метафосфорной кислоты, см³.

4. Раствор α-цистеина НСl, с массовой концентрацией 50 мг/см³. Раствор приготовляют в день применения.

5. Ацетатный буфер (pH - 4,0). Растворяют 49,8 г уксуснокислого натрия в 70 см³ дистиллированной воды и, добавляя ледяную уксусную кислоту (около 100 см³), потенциометрически доводят pH до 4,0.

6. Раствор серной кислоты: к 50 см³ дистиллированной воды осторожно добавляют 50 см³ концентрированной серной кислоты.

7. Раствор этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) с массовой концентрацией 15 %.

8. Раствор двузамещенного фосфорнокислого калия с массовой концентрацией 45 %.

Ход определения.

Интервал определяемых концентраций АК составляет 0,05 - 0,12 в объеме экстракта (от 1,0 до 10 см³), взятого на титрование. Величину навески продукта и последующее разведение рассчитывают исходя из интервала указанных концентраций.

Навеску исследуемого материала, взятую из средней пробы (1 - 50 г в зависимости от предполагаемого количества витамина С), помещают в фарфоровый стакан, в который налито 30 - 50 см³ 6 % НРО₃, и гомогенизируют. Полученный гомогенат, включая мякоть, количественно переносят в мерную колбу или цилиндр вместимостью 100 - 200 см³, доводят до метки 3 % НРО₃, перемешивают и фильтруют через фильтровальную бумагу. При анализе сухих продуктов гомогенат после измельчения настаивают в течение 10 - 15 мин. При определении витамина в жидких объектах необходимое количество материала отвешивают или отмеряют в мерную колбу вместимостью 100 см³ и доводят до метки 3 % НРО₃.

Экстрагирование проводят быстро, полученные экстракты сразу используют для анализа. При экстрагировании АК из продуктов, расфасованных в металлическую тару, или из продуктов с высоким содержанием железа, навеску образца (1 - 25 г) гомогенизируют в 6 % раствора НРО₃, переносят в цилиндр вместимостью 100 см³ этим же раствором кислоты и доводят объем до 50 см³, перемешивают. Через 10 мин. прибавляют 30 см³ ацетатного буферного раствора и 10 см³ раствора ЭДТА, доводят до метки 3 % раствором НРО₃, перемешивают и фильтруют.

Определение АК. В две конические колбы вносят пипеткой от 1 до 10 см³ экстракта, доводят объем 3 % раствором НРО₃ до 10 см³ и титруют раствором 2,6-дихлорфенолиндофенола до слабо-розового окрашивания, не исчезающего в течение 10 - 15 с. Таким образом титруют 10 см³ 3 % раствора НРО₃ (контроль на реактивы - V₀).

При содержании в продукте редуцирующих соединений контрольное испытание проводят следующим образом: в коническую колбу помещают такой же объем экстракта, как при определении АК, прибавляют равный ему объем ацетатного буфера и раствор формальдегида в объем, равном половине объема буферного раствора, перемешивают, закрывают колбу пробкой, оставляют на 10 мин и титруют раствором 2,6-дихлорфенолиндофенола (V₀).

Массовую долю АК в мг на 100 г продукта вычисляют по формуле:

(1)

где: T - титр раствора 2,6-дихлорфенолиндофенола;

V - объем 2,6-дихлорфенолиндофенола, израсходованного на титрование испытуемого раствора (среднее из двух параллельных определений), см³;

V₀ - объем раствора 2,6-дихлорфенолиндофенола, израсходованного на титрование при контрольном испытании, см³;

V₁ - общий объем экстракта, полученный при экстрагировании пробы, см³;

V₂ - объем экстракта, взятый на титрование, см³;

а - масса навески, г;

100 - пересчет на 100 г продукта.

Вычисление проводят до первого десятичного знака. За конечный результат принимают среднее арифметическое двух параллельных определений. Расхождение между двумя параллельными определениями не должно превышать 5 % от среднего арифметического значения.

Определение общего содержания витамина С (аскорбиновая кислота + дегидроаскорбиновая кислота) (АК + ДАК).

В коническую колбу помещают 2 - 20 см³ экстракта (для проведения двух параллельных определений) (V₃), доводят pH до 7,2 - 7,4 (потенциометрически) 45 % раствором двузамещениого фосфорнокислого калия, добавляют раствор цистеина в таком количестве, чтобы его массовая концентрация приблизительно в 300 раз превышала предполагаемое содержание ДАК, и ставят колбу в термостат при температуре 37 °С на 30 мин. Массовую долю цистеина в мг, добавленную к экстракту, рассчитывают по формуле:

где: K - массовая концентрация АК в продукте, определенная по формуле (1), мг на 100 г продукта;

V₃ - объем экстракта, взятый на восстановление ДАК в АК, см³;

остальные обозначения те же, что в формуле (1).

После термостатирования раствор быстро охлаждают до комнатной температуры, доводят потенциометрически pH раствора до 0 - 0,5 раствором серной кислоты и измеряют объем (V₄). К части раствора (с примерной массовой концентрацией АК 0,1 мг) (V₂) прибавляют формальдегид до получения массовой доли 3 %, закрывают колбу пробкой и через 8 мин титруют раствором 2,6-дихлорфенолиндофенола до слабо-розового окрашивания, не исчезающего в течение 10 - 15 с.

Массовую долю витамина С в мг на 100 г продукта вычисляют по формуле:

(3)

где: V₄ - объем раствора после доведения pH до 0 - 0,5, см³;

остальные обозначения те же, что в формулах (1) и (2).

Вычисления проводят до первого десятичного знака. За результат принимают среднее арифметическое двух параллельных определений. Расхождение между двумя параллельными определениями не должно превышать 8 % от среднего арифметического значения.