Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей
и благополучия человека

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Определение остаточных количеств
спинозинов А и Д в плодах томатов, томатном
соке, в луке-перо и луке-репке методом
высокоэффективной жидкостной
хроматографии

Методические указания
МУК 4.1.3415-17

Москва 2017

1. Разработаны Российским государственным аграрным университетом - МСХА им. К.А. Тимирязева, Учебно-научный консультационный центр «Агроэкология пестицидов и агрохимикатов» Минсельхоза России (А.В. Довгилевич, Е.В. Довгилевич, Н.В. Устименко, Е.Н. Тестова).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 22 декабря 2016 г. № 2).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты нрав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 14 февраля 2017 г.

4. Введены впервые.

СОДЕРЖАНИЕ

 

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Определение остаточных количеств
спинозинов А и Д в плодах томатов, томатном соке,
в луке-перо и луке-репке методом
высокоэффективной жидкостной хроматографии

Свидетельство о метрологической аттестации МВИ от 31.03.2016 № РОСС RU.0001.310430/0257.31.03.2016.

Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения уровня остаточных количеств спинозинов А и Д в плодах томатов и томатном соке, в луке-перо и луке-репке в диапазоне 0,05 - 0,5 мг/кг (каждого) и 0,1 - 1,0 мг/кг (по сумме спинозинов А и Д).

Методические указания носят рекомендательный характер.

Спиносад

Спиносад - смесь (2R,3aR,5aR,5bS,9S,13S,14R,16аS,16bR)-2-(6-дезокси-2,3,4-три-O-метил-α-L-манно-пиранозилокси)-13-(4-диметиламино-2,3,4,6-тетрадезокси-β-Д-эритропиранозилокси)-9-этил-2,3,3а,5а,5b,6,7,9,10,11,12,13,14,15,16а,16b-гексадекогидро-14-метил-1H-8-оксациклододека-[b]as-индацен-7,15-диона и (2S,3aR,5aS,5bS,9S,13S,14R,16аS,16bS)-2-(6-дезокси-2,3,4-три-O-метилα-L-маннопиранозилокси)-13-(4-диметил-амино-2,3,4,6-тетрадезокси-β-Д-эритропиранозилокси)-9-этил-2,3,3а,5а,5b,6,7,9,10,11,12,13,14,15,16а,16b-гексадекогидро-4,14-диметил-1H-8-оксациклододека[b]as-индацен-7,15-диона в соотношении от 5:95 % до 50:50 %.

Спинозин A, R = Н_-

Спинозин D, R = СН_3-.

Молекулярная масса: спинозин А - 732,0; спинозин Д - 746,0.

Эмпирическая формула: спинозин А - C₄₁H₆₅NO₁₀; спинозин Д - C₄₂H₆₇NO₁₀.

Агрегатное состояние: порошок.

Цвет, запах: светло-серый или белый.

Давление паров (при 25 °С): 3,0×10^-5 МПа - для спинозина А; 2,0×10^-5 МПа - для спинозина Д.

Коэффициент распределения в системе октанол-вода:

- спинозин А - K_ow log Р 2,8 (pH 5), 4,0 (pH 7), 5,2 (pH 9);

- спинозин Д - K_ow log Р 3,2 (pH 5), 4,5 (pH 7), 5,2 (pH 9).

Температура плавления: спинозин А - 84,0 - 99,5 °С; спинозин Д - 161,5 - 170,0 °С.

Растворимость в воде:

- спинозин А - 89 мг/дм³ (дистиллированная вода), 235 мг/дм³ (20 °С и при pH 7);

- спинозин Д - 0,5 мг/дм³ (дистиллированная вода), 0,33 мг/дм³ (20 °С и при pH 7).

Растворимость в органических растворителях (г/л при 20 °С):

- спинозин А: ацетон - 16,8; ацетонитрил - 13,4; хлористый метилен - 52,5; метанол - 19,0; гексан - 0,448; толуол - 45,7; н-октанол - 0,926;

- спинозин Д: ацетон - 1,01; ацетонитрил - 0,255; хлористый метилен - 44,8; метанол - 0,252; гексан - 0,743; толуол - 15,2; н-октанол - 0,127.

Оба вещества устойчивы к гидролизу при pH 5 и pH 7; ДТ₅₀ при pH 9 составляет 200 дней для спинозина А и 259 дней для спинозина Д. Фотодеградация в воде: ДТ₅₀ при pH 7 составляет 0,93 дня для спинозина А и 0,82 дня для спинозина Д.

Краткая токсикологическая характеристика. Спиносад относится к веществам малоопасным по острой оральной (ЛД₅₀ для самок крыс 3783 мг/кг, для самцов крыс - более 5000 мг/кг) и дермальной (ЛД₅₀ для кроликов более 2000 мг/кг) токсичности, но к умеренно опасным веществам по ингаляционной токсичности (ЛК₅₀ для крыс (4 ч) более 5180 мг/м³). Он не вызывает раздражения кожи, отмечается лишь слабое покраснение глаз у кроликов. Не обладает мутагенным и нейротоксичным свойствами или репродуктивной токсичностью.

Область применения. Спиносад - инсектицид контактного и кишечного действия из группы спинозинов, обладающий парализующим эффектом.

Он эффективно подавляет развитие вредителей из отрядов жесткокрылых, бахромчатокрылых, прямокрылых, двукрылых и чешуекрылых (имаго и личинки) в посевах зерновых, плодовых, овощных и декоративных культур при норме расхода 5 - 40 г д.в./га. Препараты на основе спиносада используются также для борьбы с синантропными насекомыми и в ветеринарии.

В России установлены следующие гигиенические нормативы:

ВДСД - 0,02 мг/кг массы человека;

ОДК в почве - 0,1 мг/кг;

ПДК в воде водоемов - 0,11 мг/дм³;

ОБУВ в воздухе рабочей зоны - 1,0 мг/м³;

ОБУВ в атмосферном воздухе - 0,002 мг/м³;

МДУ в продукции (мг/кг): огурцы - 1,0; перец - 2,0; картофель - 0,5;

МДУ в импортируемой продукции (мг/кг): лук - 0,2;

ВМДУ в импортируемой продукции (мг/кг): томаты - 0,3; лук - 0,2.

1. Погрешность измерений

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности Р = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительные интервалы среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в табл. 2.

Таблица 1

Метрологические параметры для спинозина А и спинозина Д

 Таблица 2

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный
интервал среднего результата для спинозина А и спинозина Д

2. Метод измерений

Метод основан на определении спинозинов А и Д с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием ультрафиолетового детектора после его экстракции из образцов органическим растворителем, очистки экстракта на концентрирующих патронах № 1, 2 и 3.

Идентификация веществ проводится по времени удерживания, а количественное определение - методом абсолютной калибровки.

В предлагаемых условиях анализа метод специфичен. Специфичность обеспечивается подбором состава подвижной фазы и выбором колонок различной полярности.

3. Средства измерений, реактивы,
вспомогательные устройства и материалы

3.1. Средства измерений

Примечание. Допускается использование средств измерений с аналогичными или лучшими характеристиками.

3.2. Реактивы

Примечание. Допускается использование реактивов с аналогичными или лучшими характеристиками.

3.3. Вспомогательные устройства и материалы

Примечание. Допускается применение оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4. Требования безопасности

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТу 12.1.007-76, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ Р 12.1.019-09, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТу 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТу 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 «Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны». Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТу 12.0.004-91.

5. Требования к квалификации операторов

К выполнению измерений и обработке их результатов допускаются специалисты, имеющие опыт работы в химической лаборатории, прошедшие обучение и владеющие техникой проведения анализа, освоившие метод анализа в процессе тренировки и уложившиеся в нормативы контроля при проведении процедуры контроля погрешности анализа.

6. Условия измерений

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 ± 5) °С, относительной влажности не более 80 % и нормальном атмосферном давлении;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

7. Подготовка к выполнению определений

Выполнению измерений предшествуют следующие операции: очистка растворителей (при необходимости), приготовление растворов, кондиционирование хроматографической колонки, подготовка концентрирующих патронов № 1, 2 и 3 для очистки экстракта, проверка хроматографического поведения вещества на концентрирующих патронах № 1, 2 и 3, установление градуировочной характеристики.

7.1. Подготовка органических растворителей

7.1.1. Очистка ацетонитрила

Ацетонитрил, содержащий воду, предварительно осушают, добавляя в него гранулированный безводный хлористый кальций из расчета не менее 100 г/дм³. Выдерживают его над осушителем в течение 5 - 6 часов. Затем ацетонитрил сливают с осушителя в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 см³ аппарата для перегонки растворителей.

Ацетонитрил перегоняют при температуре 81,5 °С, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 81,5 °С, отбрасывают.

7.1.2. Очистка ацетона

Ацетон, содержащий воду, предварительно осушают, добавляя в него гранулированный безводный хлористый кальций из расчета не менее 100 г/дм³. Выдерживают его над осушителем в течение 5 - 6 часов. Затем ацетон сливают с осушителя в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 см³ аппарата для перегонки растворителей, прибавляют туда марганцовокислый калий из расчета 100 мг/дм³. Ацетон перегоняют при температуре 56,2 °С, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 56,2 °С, отбрасывают.

7.1.3. Приготовление бидистиллированной воды

Дистиллированную воду помещают в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 см³ от аппарата для перегонки растворителей, добавляют к ней марганцовокислый калий из расчета 1 г/дм³ и кипятят в течение 6 часов.

Собирают фракции, отогнанные при температуре 100,0 °С, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 100,0 °С, отбрасывают.

7.1.4. Очистка гексана

Гексан, содержащий воду, предварительно осушают, добавляя в него гранулированный безводный хлористый кальций из расчета не менее 100 г/дм³. Выдерживают его над осушителем в течение 5 - 6 часов. Затем гексан сливают с осушителя в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 см³ аппарата для перегонки растворителей.

Гексан перегоняют при температуре 68,7 °С, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 68,7 °С, отбрасывают.

7.2. Приготовление растворов для проведения анализа

7.2.1. Приготовление 2 %-го водного раствора
уксуснокислого аммония

В мерную колбу объемом 1000 см³ переносят 20 г аммония уксуснокислого, добавляют 500 см³ бидистиллированной воды и перемешивают до полного растворения соли. Доводят водой объем в колбе до метки и еще раз тщательно перемешивают. Раствор хранят в холодильнике не более 1 месяца.

7.2.2. Приготовление подвижной фазы для ВЭЖХ

В плоскодонную колбу объемом 1 дм³ помещают 350 см³ ацетонитрила, 350 см³ метанола и 200 см³ 2 %-го водного раствора уксуснокислого аммония. Смесь тщательно перемешивают, пропускают через нее газообразный гелий со скоростью 20 см³/мин в течение 5 минут, после чего помещают в ультразвуковую ванну для удаления растворенных газов на 1 минуту.

7.2.3. Приготовление смеси для растворения проб и
приготовления стандартных растворов

В колбу объемом 100 см³ помещают 50 см³ ацетонитрила, прибавляют 50 см³ метанола и тщательно перемешивают. Смесь используют для растворения проб и приготовления стандартных растворов.

7.2.4. Приготовление градуировочных растворов

Спинозин А и спинозин Д разлагаются под воздействием света. При работе как со стандартными растворами, так и с аналитическими пробами следует соблюдать меры предосторожности: защищать от света (например, обертывать черной бумагой) колбы с экстрактами, концентрирующие патроны № 1, 2 и 3, концентраторы с сухим остатком экстракта. Процедуры очистки экстрактов в делительных воронках и упаривания экстрактов на ротационном вакуумном испарителе необходимо проводить в затемненной комнате (без включения электрического света).

7.2.4.1. Стандартный раствор № 1 с концентрацией спинозина А 100,0 мкг/см³. Взвешивают 10 мг спинозина А в мерной колбе объемом 100 см³. Навеску растворяют в смеси для приготовления стандартных растворов (п. 7.2.3) и доводят объем до метки этой же смесью. Полученный стандартный раствор № 1 используется для приготовления смесевых стандартных растворов спинозинов для хроматографического исследования и для установления градуировочной зависимости. Стандартный раствор № 1 хранят в холодильнике не более 2 месяцев.

7.2.4.2. Стандартный раствор № 2 с концентрацией спинозина Д 100,0 мкг/см³. Взвешивают 10 мг спинозина Д в мерной колбе объемом 100 см³. Навеску растворяют в смеси для приготовления стандартных растворов (п. 7.2.3) и доводят объем до метки этой же смесью. Полученный стандартный раствор № 2 используется для приготовления смесевых стандартных растворов спинозинов для хроматографического исследования и для установления градуировочной зависимости. Стандартный раствор № 2 хранят в холодильнике не более 2 месяцев.

7.2.4.3. Стандартный раствор № 3 с концентрацией спинозина А и спинозина Д по 10,0 мкг/см³ каждого. Из стандартного раствора № 1 отбирают пипеткой 10 см³, помещают в мерную колбу объемом 100 см³. Из стандартного раствора № 2 отбирают пипеткой 10 см³ и помещают в ту же колбу объемом 100 см³, доводят объем до метки смесью для приготовления стандартных растворов (п. 7.2.3). Стандартный раствор № 3 используется для приготовления стандартных растворов для хроматографического исследования и для установления градуировочной зависимости. Стандартный раствор № 3 хранят в холодильнике не более 1 месяца.

7.2.4.4. Стандартный раствор № 4 с концентрацией спинозина А и спинозина Д по 5,0 мкг/см³ каждого. Из стандартного раствора № 3 отбирают пипеткой 5 см³, помещают в мерную колбу объемом 10 см³, доводят объем до метки смесью для приготовления стандартных растворов (п. 7.2.3). Стандартный раствор № 4 используется для приготовления стандартных растворов для хроматографического исследования и для установления градуировочной зависимости. Стандартный раствор № 4 хранят в холодильнике не более 1 месяца.

7.2.4.5. Стандартный раствор № 5 с концентрацией спинозина А и спинозина Д по 2,5 мкг/см³ каждого. Из стандартного раствора № 4 отбирают пипеткой 5 см³, помещают в мерную колбу объемом 10 см³, доводят объем до метки смесью для приготовления стандартных растворов (п. 7.2.3). Стандартный раствор № 5 используется для приготовления стандартных растворов для хроматографического исследования и для установления градуировочной зависимости. Стандартный раствор № 5 хранят в холодильнике не более 1 месяца.

7.2.4.6. Стандартный раствор № 6 с концентрацией спинозина А и спинозина Д по 1,0 мкг/см³ каждого. Из стандартного раствора № 3 отбирают гашеткой 1 см³, помещают в мерную колбу объемом 10 см³, доводят объем до метки смесью для приготовления стандартных растворов (п. 7.2.3). Стандартный раствор № 6 используется для приготовления стандартных растворов для хроматографического исследования и для установления градуировочной зависимости. Стандартный раствор № 6 хранят в холодильнике не более 1 месяца.

7.2.4.7. Стандартный раствор № 7 с концентрацией спинозина А и спинозина Д по 0,5 мкг/см³ каждого. Из стандартного раствора № 6 отбирают пипеткой 5 см³, помещают в мерную колбу объемом 10 см³, доводят объем до метки смесью для приготовления стандартных растворов (п. 7.2.3). Стандартный раствор № 7 используется для хроматографического исследования и для установления градуировочной зависимости. Стандартный раствор № 7 хранят в холодильнике не более 1 месяца.

7.2.4.8. Стандартный раствор № 8 с концентрацией спинозина А и спинозина Д по 0,25 мкг/см³ каждого. Из стандартного раствора № 5 отбирают пипеткой 1 см³, помещают в мерную колбу объемом 10 см³, доводят объем до метки смесью для приготовления стандартных растворов (п. 7.2.3). Стандартный раствор № 8 используется для хроматографического исследования и для установления градуировочной зависимости. Стандартный раствор № 8 хранят в холодильнике не более 1 месяца.

7.2.4.9. Стандартные растворы спинозина А и спинозина Д с концентрациями 10,0; 5,0; 2,0 и 1,0 мкг/см³ для хроматографического исследования и для внесения в контрольные образцы. Методом последовательного разведения ацетонитрилом готовят растворы, содержащие по 10,0; 5,0; 2,0 и 1,0 мкг/см³ и используют эти растворы для хроматографического исследования и для внесения в контрольные образцы.

7.3. Установление градуировочной характеристики

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади (высоты) пика от концентрации спинозина А и спинозина Д в растворе (мкг/см³), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4 растворам для градуировки с концентрацией 2,5; 1,0; 0,5 и 0,25 мкг/см³.

В инжектор хроматографа вводят по 20 мм³ каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.5. Осуществляют не менее 5 параллельных измерений.

7.4. Подготовка концентрирующих патронов № 1
для очистки экстрактов и проверка хроматографического поведения
спинозинов А и Д на них

7.4.1. Подготовка концентрирующих патронов № 1
для очистки экстракта

Все процедуры происходят с использованием вакуума, скорость потока растворов через патрон не должна превышать 5 см³/мин.

Патрон № 1 устанавливают на алонж с отводом для вакуума, сверху в патрон вставляют шприц с разъемом типа Люер объемом не менее 10 см³ (используют как емкость для элюентов).

Кондиционирование: патрон последовательно промывают 10 см³ смеси гексана с ацетоном в соотношении 1:1 и 10 см³ гексана. Элюаты отбрасывают. Нельзя допускать высыхания патрона.

7.4.2. Проверка хроматографического поведения спинозинов А и Д
на концентрирующих патронах № 1

Для проверки хроматографического поведения спинозинов А и Д на концентрирующих патронах № 1 готовят контрольный экстракт анализируемой матрицы (плоды томата, томатный сок, лук-перо и лук-репка) по соответствующей методике и проводят все процедуры очистки, предшествующие очистке на патронах.

Из стандартного раствора спинозина А и спинозина Д в ацетонитриле, содержащего по 10 мкг/см³ каждого соединения, отбирают 1 см³, помещают в концентратор объемом 100 см³ с контрольной пробой матрицы и упаривают на ротационном вакуумном испарителе досуха при температуре не выше 30 °С. Сухой остаток растворяют в 1 см³ ацетона, помещают на 30 секунд в ультразвуковую ванну и тщательно обмывают стенки концентратора. Затем в концентратор прибавляют 9 см³ гексана, смесь тщательно перемешивают и полученный раствор вносят на патрон. Элюат собирают в концентратор и упаривают досуха. Сухой остаток растворяют в 2 см³ смеси для растворения проб (п. 7.2.3) и 20 мм³ пробы вводят в хроматограф.

Исходный концентратор обмывают сначала 10 см³ смеси гексана с ацетоном в соотношении 9:1, а затем двумя порциями по 5 см³ каждая смеси гексана с ацетоном в соотношении 9:1 и последовательно вносят растворы на патрон. Элюат после прохождения каждой порции элюентов собирают в отдельные концентраторы объемом по 100 см³ и упаривают досуха. Сухой остаток растворяют в 2 см³ смеси для растворения проб (п. 7.2.3) и 20 мм³ пробы вводят в хроматограф.

Определяют фракции, содержащие спинозин А и спинозин Д, полноту смывания и необходимый объем элюента.

Изучение поведения спинозинов А и Д на концентрирующих патронах № 1 проводят каждый раз при отработке методики или поступлении новой партии патронов.

7.5. Подготовка концентрирующих патронов № 2 для очистки
экстрактов и проверка хроматографического поведения
спинозинов А и Д на них

7.5.1. Подготовка концентрирующих патронов № 2
для очистки экстракта

Все процедуры происходят с использованием вакуума, скорость потока растворов через патрон не должна превышать 5 см³/мин.

Патрон № 2 устанавливают на алонж с отводом для вакуума, сверху в патрон вставляют шприц с разъемом типа Люер объемом не менее 10 см³ (используют как емкость для элюентов).

Кондиционирование: концентрирующий патрон промывают 5 см³ смеси гексана с ацетоном в соотношении 1:1. Элюат отбрасывают.

7.5.2. Проверка хроматографического поведения спинозинов А и Д
на концентрирующих патронах № 2

Для проверки хроматографического поведения спинозинов А и Д на концентрирующих патронах № 1 готовят контрольный экстракт анализируемой матрицы (плоды томата, томатный сок, лук-перо и лук-репка) по соответствующей методике и проводят все процедуры очистки, предшествующие очистке на патронах.

Из стандартного раствора спинозина А и спинозина Д в ацетонитриле, содержащего по 10 мкг/см³ каждого соединения, отбирают 1 см³, помещают в концентратор объемом 100 см³ с контрольной пробой матрицы и упаривают на ротационном вакуумном испарителе досуха при температуре не выше 30 °С. Сухой остаток растворяют в 10 см³ смеси гексана с ацетоном в соотношении 1:1, перемешивают и вносят на патрон. Элюат собирают в концентратор объемом 100 см³, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе досуха при температуре не выше 30 °С, сухой остаток растворяют в 2 см³ смеси для растворения проб (п. 7.2.3) и 20 мм³ пробы вводят в хроматограф.

Исходный концентратор обмывают сначала 10 см³ смеси гексана с ацетоном в соотношении 1:2, а затем двумя порциями по 10 см³ ацетона и двумя порциями по 10 см³ смеси ацетонитрила с метанолом в соотношении 1:1 и вносят на патрон. Элюат после прохождения каждой порции элюентов собирают в отдельные концентраторы объемом по 100 см³, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С, сухой остаток растворяют в 2 см³ смеси для растворения проб (п. 7.2.3) и 20 мм³ пробы вводят в хроматограф.

Определяют фракции, содержащие спинозин А и спинозин Д, полноту смывания и необходимый объем элюента.

Изучение поведения спинозинов А и Д на концентрирующих патронах № 2 проводят каждый раз при отработке методики или поступлении новой партии патронов.

7.6. Подготовка концентрирующих патронов № 3 для очистки
экстрактов и проверка хроматографического поведения
спинозинов А и Д на них

7.6.1. Подготовка концентрирующих патронов № 3
для очистки экстракта

Все процедуры происходят с использованием вакуума, скорость потока растворов через патрон не должна превышать 5 см³/мин.

Патрон № 3 устанавливают на алонж с отводом для вакуума, сверху в патрон вставляют шприц с разъемом типа Люер объемом не менее 10 см³ (используют как емкость для элюентов).

Кондиционирование: патрон промывают последовательно 10 см³ смеси гексана с ацетоном в соотношении 1:1 и 10 см³ гексана. Элюаты отбрасывают. Нельзя допускать высыхания патрона.

7.6.2. Проверка хроматографического поведения спинозинов А и Д
на концентрирующих патронах № 3

Для проверки хроматографического поведения спинозинов А и Д на концентрирующих патронах № 1 готовят контрольный экстракт анализируемой матрицы (плоды томата, томатный Сок, лук-перо и лук-репка) по соответствующей методике и проводят все процедуры очистки, предшествующие очистке на патронах.

Из стандартного раствора спинозина А и спинозина Д в ацетонитриле, содержащего по 10 мкг/см³ каждого соединения, отбирают 1 см³, помещают в концентратор объемом 100 см³ с контрольной пробой матрицы и упаривают на ротационном вакуумном испарителе досуха при температуре не выше 30 °С. Сухой остаток растворяют в 2 см³ ацетона, помещают на 30 секунд в ультразвуковую ванну и тщательно обмывают стенки концентратора. Затем в концентратор прибавляют 8 см³ гексана, смесь тщательно перемешивают и полученный раствор вносят на патрон. Элюат собирают в концентратор и упаривают досуха. Сухой остаток растворяют в 2 см³ смеси для растворения проб (п. 7.2.3) и 20 мм³ пробы вводят в хроматограф.

Исходный концентратор обмывают сначала двумя порциями по 10 см³ смеси гексана с ацетоном в соотношении 4:1 и последовательно вносят растворы на патрон. Элюат после прохождения каждой порции элюентов собирают в отдельные концентраторы объемом по 100 см³ и упаривают досуха. Сухой остаток растворяют в 2 см³ смеси для растворения проб (п. 7.2.3) и 20 мм³ пробы вводят в хроматограф.

Определяют фракции, содержащие спинозин А и спинозин Д, полноту смывания и необходимый объем элюента.

Изучение поведения спинозинов А и Д на концентрирующих патронах № 3 проводят каждый раз при отработке методики или поступлении новой партии патронов.

7.7. Подготовка и кондиционирование колонки
для жидкостной хроматографии

Хроматографическую колонку с предколонкой устанавливают в термостате хроматографа и стабилизируют при температуре 30 °С и скорости потока подвижной фазы 1 см³/мин 3 - 4 часа.

8. Отбор проб и хранение

Отбор проб проводится в соответствии с «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов», № 2051-79 от 21.08.79, а также в соответствии с ГОСТ Р 51783-01 «Лук репчатый свежий, реализуемый в розничной торговой сети. ТУ», ГОСТ Р 55906-13 «Томаты свежие, реализуемые в розничной торговой сети», ГОСТ Р 32876-14 «Консервы. Соки овощные, Сок томатный, ТУ».

Пробы лука и плодов томатов хранят в холодильнике в полиэтиленовых пакетах при температуре 0 - 4 °С в течение суток. Для длительного хранения пробы замораживают и хранятся в морозильной камере при температуре -18 °С.

Пробы томатного сока хранят в стеклянной герметично закрытой таре в холодильнике при температуре 4 °С не более 5 суток.

9. Выполнение определения

9.1. Плоды томатов

9.1.1. Экстракция и очистка полученного экстракта
перераспределением в системе несмешивающихся растворителей

Образец измельченных плодов томатов массой 20 г помещают в стеклянный стакан объемом 500 см³, прибавляют 100 см³ ацетонитрила и перемешивают 1 минуту с помощью погружного миксера. Экстракт фильтруют через фильтр низкой плотности в защищенную от света коническую колбу объемом 250 см³ с 5 г хлорида натрия, остаток на фильтре промывают 10 см³ ацетонитрила, перемешивают и выдерживают 5 минут. Затем объединенный экстракт переносят в делительную воронку объемом 250 см³ (нерастворившуюся соль оставляют в колбе) и после разделения фаз нижний водный слой отбрасывают. Ацетонитрильный экстракт в делительной воронке промывают двумя порциями гексана объемом по 50 см³, каждый раз интенсивно встряхивая воронку по 2 минуты. После полного разделения фаз отбрасывают выделившийся нижний водный слой и верхний гексановый слой. Ацетонитрильный экстракт переносят в концентратор объемом 250 см³ через слой безводного сульфата натрия, осушитель в колбе промывают 10 см³ ацетонитрила, объединяют с основным экстрактом и упаривают досуха при температуре не выше 30 °С.

9.1.2. Очистка экстракта на концентрирующих патронах № 1

Сухой остаток, полученный по п. 9.1.1, растворяют в 1 см³ ацетона, тщательно обмывают стенки концентратора, прибавляют в концентратор 9 см³ гексана, перемешивают и вносят на подготовленный патрон. Элюат собирают в концентратор объемом 100 см³. Исходный концентратор обмывают 10 см³ смеси гексана с ацетоном в соотношении 9:1 и также вносят на патрон, элюаты объединяют в концентраторе объемом 100 см³ и упаривают досуха при температуре не выше 30 °С.

Сухой остаток растворяют в 4 см³ смеси для растворения проб (п. 7.2.3) и 20 мм³ пробы вводят в хроматограф.

9.2. Томатный сок

9.2.1. Экстракция и очистка полученного экстракта
перераспределением в системе несмешивающихся растворителей

Образец томатного сока массой 20 г помещают в стеклянный стакан объемом 500 см³, прибавляют 100 см³ ацетонитрила и перемешивают 1 минуту с помощью погружного миксера. Экстракт фильтруют через фильтр низкой плотности в защищенную от света коническую колбу объемом 250 см³ с 5 г хлорида натрия, остаток на фильтре промывают 10 см³ ацетонитрила, перемешивают и выдерживают 5 минут. Затем объединенный экстракт переносят в делительную воронку объемом 250 см³ (нерастворившуюся соль оставляют в колбе) и после разделения фаз нижний водный слой отбрасывают. Ацетонитрильный экстракт в делительной воронке промывают двумя порциями гексана объемом по 50 см³, каждый раз интенсивно встряхивая воронку по 2 минуты. После полного разделения фаз отбрасывают выделившийся нижний водный слой и верхний гексановый слой. Ацетонитрильный экстракт переносят в концентратор объемом 250 см³ через слой безводного сульфата натрия, осушитель в колбе промывают 10 см³ ацетонитрила, объединяют с основным экстрактом и упаривают досуха при температуре не выше 30 °С.

Далее проводят очистку экстракта по п. 9.1.2 «Очистка экстракта на концентрирующих патронах № 1».

После очистки элюат упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С, сухой остаток растворяют в 4 см³ смеси для растворения проб (п. 7.2.3) и 20 мм³ пробы вводят в хроматограф.

9.3. Лук-репка

9.3.1. Экстракция и очистка полученного экстракта
перераспределением в системе несмешивающихся растворителей

Образец измельченного лука-репки массой 20 г помещают в полипропиленовую банку для экстракции объемом 250 см³, защищенную от света, прибавляют 50 см³ смеси ацетонитрила с водой в соотношении 8:2 и помещают на 5 минут в ультразвуковую ванну, а затем на 5 минут на аппарат для встряхивания проб. Экстракцию повторяют еще два раза, используя каждый раз по 50 см³ смеси ацетонитрила с водой в соотношении 8:2 и помещая на 5 минут в ультразвуковую ванну, а затем на 5 минут на аппарат для встряхивания проб. Экстракт фильтруют через фильтр низкой плотности в защищенную от света коническую колбу объемом 250 см³ с 5 г хлорида натрия, перемешивают и выдерживают на 5 минут. Затем объединенный экстракт переносят в делительную воронку объемом 250 см³ (нерастворившуюся соль оставляют в колбе) и после разделения фаз нижний водный слой отбрасывают. Ацетонитрильный экстракт в делительной воронке промывают двумя порциями гексана объемом по 50 см³, каждый раз интенсивно встряхивая воронку по 2 минуты. После полного разделения фаз отбрасывают выделившийся нижний водный слой и верхний гексановый слой. Ацетонитрильный экстракт переносят в концентратор объемом 250 см³ через слой безводного сульфата натрия, осушитель в колбе промывают 10 см³ ацетонитрила, объединяют с основным экстрактом и упаривают досуха при температуре не выше 30 °С.

9.3.2. Очистка экстракта на концентрирующих патронах № 2

Сухой остаток, полученный по п. 9.3.1, растворяют в 10 см³ смеси гексана с ацетоном в соотношении 1:1 и вносят на подготовленный патрон, элюат отбрасывают. Исходный концентратор сначала обмывают 10 см³ смеси гексана с ацетоном в соотношении 1:2, а затем 10 см³ ацетона вносят на патрон, элюаты также отбрасывают. Спинозины А и Д элюируют с патрона 10 см³ ацетона и 10 см³ смеси ацетонитрила с метанолом в соотношении 1:1, элюаты объединяют в концентраторе объемом 100 см³ и упаривают досуха при температуре не выше 30 °С.

Сухой остаток растворяют в 4 см³ смеси для растворения проб (п. 7.2.3) и 20 мм³ пробы вводят в хроматограф.

9.4. Лук-перо

9.4.1. Экстракция и очистка полученного экстракта
перераспределением в системе несмешивающихся растворителей

Образец измельченного лука-пера массой 20 г помещают в полипропиленовую банку для экстракции объемом 250 см³, защищенную от света, прибавляют 50 см³ смеси ацетонитрила с водой в соотношении 8:2 и проводят экстракцию и очистку полученного экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей по п. 9.3.1.

9.4.2. Очистка экстракта на концентрирующих патронах № 3

Сухой остаток, полученный по п. 9.4.1, растворяют в 2 см³ ацетона, тщательно обмывая стенки концентратора, прибавляют 8 см³ гексана, перемешивают и вносят на подготовленный патрон № 3. Элюат собирают в концентратор объемом 100 см³. Исходный концентратор обмывают 10 см³ смеси гексана с ацетоном в соотношении 4:1 и также вносят на патрон, элюаты объединяют в концентраторе объемом 100 см³ и упаривают досуха при температуре не выше 30 °С.

Сухой остаток растворяют в 4 см³ смеси для растворения проб (п. 7.2.3) и 20 мм³ пробы вводят в хроматограф.

9.5. Условия хроматографирования

Хроматографическая система, включающая:

- хроматограф жидкостный, снабженный термостатом для колонок с диапазоном температур от 15 до 80 °С, с ультрафиолетовым детектором с изменяемой длиной волны и чувствительностью не ниже 0,005 единиц адсорбции на шкалу;

- компьютерное программное обеспечение, контролирующее работу всего прибора, обеспечивающее сбор и хранение всех хроматограмм в процессе проведения хроматографического анализа, обеспечивающее обработку результатов измерений, вывод и расчет хроматограмм и количественный анализ.

Колонка хроматографическая стальная длиной 150 мм, с внутренним диаметром 3,9 мм, зернением 5 мкм, заполненная сорбентом с привитыми полярными группами С18.

Предколонка хроматографическая стальная, длиной 20,0 мм, внутренним диаметром 3,9 мм, зернением 5 мкм, заполненная сорбентом с привитыми полярными группами С8.

Температура колонки: 30 °С.

Подвижная фаза: ацетонитрил - метанол - 2 %-й водный раствор уксуснокислого аммония в соотношении 350:350:200.

Длина волны: 240 нм.

Скорость потока элюента: 1,0 см³/мин.

Чувствительность не менее 0,005 AUFS (единиц абсорбции на шкалу).

Объем вводимой пробы 20 мм³.

Линейный диапазон детектирования сохраняется в пределах 2 - 20 нг.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартные растворы спинозина А или спинозина Д с концентрацией 2,5 мкг/см³, соответственно разбавляют.

10. Обработка результатов

Для обработки результатов хроматографического анализа используется компьютерное программное обеспечение химического анализа, которое входит в хроматографическую систему.

Альтернативная обработка результатов.

Содержание спинозина А и спинозина Д в пробах рассчитывают по формуле без учета полноты извлечения вещества из проб:

X - содержание спинозина А или спинозина Д в пробе, мг/кг;

S_cm - высота (площадь) пика стандарта, мм;

S_np - высота (площадь) пика образца, мм;

А - концентрация стандартного раствора, мкг/см³;

V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, см³;

m - масса анализируемого образца, г (см³);

Р - содержание спинозина А или спинозина Д в аналитическом стандарте, %.

Для определения содержания спиносада в пробах суммируют содержание спинозина А и спинозина Д.

11. Проверка приемлемости результатов
параллельных определений

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости:

X₁, Х₂ - результаты параллельных определений, мг/кг;

r - значение предела повторяемости (табл. 1), при этом r = 2,8×σ_r.

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

12. Оформление результатов

Результат анализа представляют в виде:

 - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

Δ - граница абсолютной погрешности, мг/кг:

δ - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

В случае если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

«содержание вещества в пробе менее 0,05 мг/кг»^*.

________

^* 0,05 мг/кг - предел обнаружения.

13. Контроль качества результатов измерений

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений, а также контроль стабильности градуировочной характеристики осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1 - 6-02 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».

13.1. Контроль стабильности градуировочной характеристики.

Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

Контроль стабильности градуировочной характеристики для спинозинов А и Д проводят при смене основных градуировочных растворов № 1 и 2 каждые 2 месяца, при смене основных градуировочных растворов № 3, 4, 5, 6, 7 и 8 - каждый месяц, а также в начале и по окончании каждой серии анализов.

При контроле стабильности градуировочной характеристики проводят измерения не менее трех образцов концентраций для градуировки, содержание спинозинов А и Д в которых должно охватывать весь диапазон концентраций от 0,25 до 2,5 мкг/см³.

Градуировочная характеристика считается стабильной, если для каждого из используемого для контроля градуировочного раствора сохраняется соотношение:

для спинозина А и 2,81 для спинозина Д, где

X - концентрация спинозинов А и Д контрольного измерения, мкг/см³;

С - известная концентрация градуировочного раствора спинозинов А и Д в смеси для приготовления стандартных растворов (п. 7.2.3), взятая для контроля стабильности градуировочной характеристики, мкг/см³;

2,75 или 2,81 - погрешность градуировочной характеристики, %.

Если величина расхождения (А) превышает 2,75 или 2,81 %, делают вывод о невозможности применения градуировочной характеристики для дальнейших измерений. В этом случае выясняют и устраняют причины нестабильности градуировочной характеристики и повторяют контроль ее стабильности с использованием других градуировочных растворов спинозинов А и Д, предусмотренных МВИ. При повторном обнаружении нестабильности градуировочной характеристики определяют ее заново согласно п. 7.3.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом добавок.

Величина добавки С_д должна удовлетворять условию:

 - характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно) мг/кг, при этом:

Δ - граница абсолютной погрешности, мг/кг:

δ - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

Результат контроля процедуры К_к рассчитывают по формуле:

, С_д - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11), содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце и концентрация добавки соответственно, мг/кг.

Норматив контроля К рассчитывают по формуле:

Проводят сопоставление результата контроля процедуры (К_к) с нормативом контроля (К).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию:

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), не должно превышать предела воспроизводимости (R):

X₁, Х₂ - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

Приложение 1

Полнота извлечения спинозина А и спинозина Д из плодов томатов,
томатного сока, лука-пера и лука-репки

(5 повторностей для каждой концентрации, Р = 0,95)