ПРЕДИСЛОВИЕ

Успешное выполнение намеченной ХХVII съездом КПСС широкой программы развития в нашей стране агропромышленного комплекса в немалой степени зависит от хорошей организации ветеринарного обслуживания животноводства, четко налаженной работы ветеринарных диагностических лабораторий. Проводимые в лабораториях исследования позволяют правильно организовать мероприятия по предупреждению инфекционных и инвазионных болезней, а в случаях возникновения заболевания своевременно поставить диагноз и принять целенаправленные меры по его быстрейшей ликвидации.

В работе ветеринарных лабораторий все большее применение находят современные методы исследований, одновременно идет совершенствование диагностики многих заболеваний, предлагаются новые более чувствительные и достоверные методы, позволяющие полнее и на ранних стадиях выявлять заболевших животных и тем самым способствовать быстрейшему оздоровлению хозяйств.

Специалисты лабораторий постоянно расширяют перечень показателей и болезней, на которые проводятся исследования.

За последнее время утверждено значительное количество инструктивных документов по проведению лабораторных исследований, что позволило более четко организовать работу специалистов, улучшить качество исследований, получать сопоставимые результаты.

Оснащение лабораторий современным оборудованием позволяет внедрять в работу более точные инструментальные методы.

В своей работе ветеринарные лаборатории не могут использовать всего многообразия предлагаемых методов исследования из-за того, что они или недостаточно апробированы, или из-за сложности используемого оборудования. Имеют место случаи, когда предлагаемые различными авторами методы при определении одних и тех же показателей дают несовпадающие результаты. Поэтому в настоящий справочник включены методы лабораторных исследований патологического материала, полученного от больных, убитых или павших сельскохозяйственных животных, апробированные Центральной ветеринарной лабораторией и утвержденные в разные годы бывшим Министерством сельского хозяйства СССР.

Книга содержит методические указания по диагностике вирусных, риккетсиозных, хламидиозных болезней, а также методические указания по лабораторной диагностике паразитарных болезней животных и пчел.

Методики излагаются по единой схеме: взятие и пересылка патологического материала, методы его обработки, микроскопические исследования, включая световую и люминесцентную микроскопию, выделение возбудителей на куриных эмбрионах и культурах клеток, заражение лабораторных животных, гистологические исследования, идентификация и дифференциация возбудителей с использованием различных методов, определение биологической активности вакцин и исследования на напряженность иммунитета.

Методы лабораторных исследований, представленные в справочнике, унифицированы и стандартизированы, что создает возможность для стандартизации аппаратов, приборов, инструментов, посуды, реактивов, биопрепаратов и другого специального имущества, определения объема подготовки специалистов и степень оснащения ветеринарных диагностических лабораторий. Таким образом, стандартизация методов исследования является способом наведения строгого порядка в ветеринарной лабораторной работе.

ИНФЕКЦИОННЫЙ ЛАРИНГОТРАХЕИТ КУР

Временное наставление по лабораторной диагностике
инфекционного ларинготрахеита кур

(Утверждено 27 августа 1964 г.)

Возбудитель относится к группе герпес, содержит ДНК, его размер 250 нм.

Материал для исследования: трупы кур, паренхиматозные органы, трахеи, гортани, выделения из трахеи и гортани, сыворотка крови.

Микроскопические исследования: мазки-соскобы с конъюнктивы, гортани и трахеи павших или клинически больных кур в ранней стадии заболевания высушивают на воздухе, фиксируют спирт-эфиром в течение 20 мин и окрашивают раствором краски Гимза (1 капля краски на 1 мл дистиллированной воды) при 37 °С в течение 2 ч или при комнатной температуре 12 - 18 ч. Затем мазки промывают водой, обесцвечивают, быстро погружая в метиловый спирт, снова промывают водой и просматривают под микроскопом с иммерсионной системой. Ацидофильные включения обнаруживают в ядрах клеток. Ядро с включениями увеличено, с более темной окраской - стенки ядра. Цитоплазма пораженной клетки - голубая, ядро - темно-фиолетовое, а включение - красное с розовым оттенком. Вокруг включения наблюдается неокрашенная зона. Включения имеют разнообразную форму (круглую, вытянутую, треугольную).

Выделение вируса инфекционного ларинготрахеита на куриных эмбрионах. При вскрытии павших или вынужденно убитых кур отбирают пораженные гортань, трахею, конъюнктиву. Собранный материал гомогенизируют с физиологическим раствором в разведении 1:10, центрифугируют при 1 - 1,5 тыс. об/мин в течение 10 мин. Далее к надосадочной жидкости добавляют антибиотики по 1000 ЕД (стрептомицина и пенициллина) на 1 мл суспензии. Материал выдерживают в течение 3 - 12 ч при температуре 2 - 4 °С и заражают им 9 - 12-дневных куриных эмбрионов.

Эмбрионы заражают нанесением суспензии на хорионаллантоисную мембрану в дозе 0,2 мл по принятой методике. Зараженных эмбрионов помещают в термостат при температуре 37 °С на 5 - 6 дн., при этом их ежедневно просматривают на овоскопе. Всех погибших эмбрионов вскрывают в день гибели, а оставшихся живыми - на 5-й день после заражения, предварительно охладив их в течение 2 - 3 ч при температуре 4 °С. В стерильные пробирки с растертым стеклом отдельно помещают измененные хорионаллантоисные оболочки вместе с эмбриональной жидкостью. Из каждого эмбриона делают высевы одновременно на МПА и МПБ.

Пораженные вирусом хорионаллантоисные оболочки после бактериологического контроля тщательно гомогенизируют в пробирках со стеклом. Гомогенат из отдельных пробирок объединяют в общий флакон, а затем расфасовывают по 1 - 2 мл в ампулы, которые хранят при температуре 10 - 12 °С. Вирус инфекционного ларинготрахеита вызывает на 4 - 5-й день инкубации на хорионаллантоисной мембране зараженных куриных эмбрионов появление многочисленных беловатых узелков или крупных некротических очагов с зоной отека на месте введения.

Специфичность вируса инфекционного ларинготрахеита определяют постановкой биопробы и реакцией нейтрализации на куриных эмбрионах с заведомо позитивными сыворотками.

Биопробу ставят на восприимчивой птице 30 - 40-дневного возраста нанесением вирусного материала по 0,5 мл на слизистую трахеи и слегка ее скарифицируя, а на 3 - 5-месячной птице - путем нанесения вируса на слизистую клоаки.

За птицей устанавливают ежедневное наблюдение в течение 10 - 14 дн., отмечая клинические признаки болезни (кашель, хрипы, поражение гортани, ринит). У птиц, зараженных в клоаку, учитывают наличие «клоачной пробы».

От павших и клинически больных кур в ранней стадии заболевания делают мазки-соскобы со слизистой пораженной трахеи, конъюнктивы. Мазки окрашивают краской Гимзы (1 капля краски на 1 мл дистиллированной воды) при 37 °С в течение 2 ч или при комнатной температуре в течение 12 - 18 ч. После этого мазки промывают водой, обесцвечивают (быстрым погружением мазка в метиловый спирт), промывают водой и просматривают под микроскопом с иммерсионной системой. Ацидофильные включения обнаруживают в ядре пораженной клетки. Обычно ядро с включением увеличено, с более темной окраской стенки. Цитоплазма зараженной клетки окрашивается в голубой цвет, ядро - в темно-фиолетовый, а включения - в красный с розовым оттенком. Вокруг включения наблюдается неокрашенная зона. Включения имеют разнообразную форму (круглую, вытянутую, треугольную).

Для исключения вируса оспы кур, вызывающего на хорионаллантоисной мембране поражения, сходные с поражениями вирусом инфекционного ларинготрахеита, заражают цыплят 30 - 60-дневного возраста (ранее непривитых против оспы птиц) в гортань, перьевые фолликулы голени и гребешок. Оспенная реакция у зараженной птицы проявляется на 6 - 8-й день припуханием и покраснением фолликул и образованием ложных дифтеритических наложений в ротовой полости. При вирусоскопии по Морозову в мазках из развившихся фолликул обычно обнаруживают оспенные элементарные тельца.

Постановка реакции нейтрализации вируса инфекционного ларинготрахеита кур. Реакцию нейтрализации при диагностике на инфекционный ларинготрахеит с испытуемыми сыворотками от переболевшей птицы применяют для установления природы наблюдавшейся инфекции, дифференциальной диагностики атипичных случаев заболевания, проявляющихся клиническими признаками поражения респираторных органов.

Для этого проводят типизирование выделяемых штаммов вируса инфекционного ларинготрахеита, используя различные гипериммунные кроличьи сыворотки.

Для постановки реакции нейтрализации требуется следующая лабораторная посуда и компоненты: пробирки Флоринского, бактериологические пробирки, резиновые пробки № 12 и 14, градуированные пипетки, штативы 100- и 40-гнездные, антибиотики (пенициллин и стрептомицин), 9 - 12-дневные куриные эмбрионы.

В штативе расставляют несколько рядов стерильных пробирок, закрытых стерильными пробками, причем количество рядов должно соответствовать числу испытуемых сывороток, а количество пробирок в одном ряду - числу разведений вируса.

Сухими стерильными пипетками в стерильные пробирки разливают испытуемые сыворотки в дозе 0,5 мл в каждую пробирку. Параллельно для контроля разливают нормальную сыворотку (кроличья или куриная в той же дозе). Предварительно все сыворотки инактивируют при 56 °С 30 мин. После того как испытуемые сыворотки разлиты, к ним и контрольным сывороткам добавляют в разном объеме (по 0,5 мл) разведения вируса: 1:10, 1:100, 1:1000, 1:10000. Вирус можно добавлять одной пипеткой при условии, если начинать разливать с наибольшего разведения.