Государственное санитарно-эпидемиологическое нормирование
Российской Федерации

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Определение остаточных количеств
пропилентиомочевины в луке-репке, ботве и
клубнях картофеля, томатах и томатном соке,
яблоках и яблочном соке методом
высокоэффективной жидкостной
хроматографии

Методические указания
МУК 4.1.3406-16

1. Разработаны сотрудниками ФГБНУ «Всероссийский НИИ защиты растений» и ООО «Инновационный центр защиты растений» (В.И. Долженко, И.А. Цибульская, А.С. Комарова, Т.Д. Черменская).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 22 декабря 2016 г. № 2).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 29 декабря 2016 г.

4. Введены впервые.

СОДЕРЖАНИЕ

 

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Определение остаточных количеств
пропилентиомочевины в луке-репке, ботве и клубнях
картофеля, томатах и томатном соке, яблоках и
яблочном соке методом высокоэффективной
жидкостной хроматографии

Свидетельство о метрологической аттестации № 01.5.04.232/01.00043/2016.

Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения массовой концентрации пропилентиомочевины в луке-репке, клубнях картофеля, томатах и томатном соке, яблоках и яблочном соке в диапазоне концентраций 0,01 - 0,1 мг/кг, в ботве картофеля в диапазоне концентраций 0,1 - 1,0 мг/кг.

Методические указания носят рекомендательный характер.

Пропилентиомочевина

4-Метил-2-имидазолидинтион (ИЮПАК)

Брутто формула: C₄H₈N₂S.

Молекулярная масса: 116,2.

Пропилентиомочевина является основным метаболитом при деградации пропинеба.

Белое кристаллическое вещество без запаха.

Растворима в ацетонитриле и метаноле.

K_owlogP = 0,26 (20 °С); константа Генри 8·10^-8 Па·м³/моль (20 °С). Период полураспада в почве: DT₅₀ (20 °С, аэробные условия) 2,1 день.

Гигиенические нормативы для пропилентиомочевины в России не установлены.

1. Погрешность измерений

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности Р = 0,95 не превышает значений, приведенных в таблице 1, для соответствующих диапазонов концентраций.

Таблица 1

Метрологические параметры

Таблица 2

Полнота извлечения пропилентиомочевины, стандартное отклонение,
доверительный интервал среднего результата для n = 20, Р = 0,95

2. Метод измерений

Метод основан на определении пропилентиомочевины методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием ультрафиолетового (УФ) детектора после извлечения из образцов водным метанолом и последующей очистки с использованием окиси алюминия.

Идентификация пропилентиомочевины проводится по времени удерживания, количественное определение - методом абсолютной калибровки.

Избирательность метода обеспечивается сочетанием условий подготовки проб и хроматографирования.

3. Средства измерений, реактивы, вспомогательные
устройства и материалы

3.1. Средства измерений

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

3.2. Реактивы

Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очистки растворителей.

3.3. Вспомогательные устройства и материалы

Примечание. Допускается применение оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4. Требования безопасности

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-09, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.

4.2. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией, соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и ГН 2.2.5.2308-07.

Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004-15.

5. Требования к квалификации операторов

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист-химик, владеющий методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, имеющий опыт работы, ознакомленный с руководством по эксплуатации хроматографа, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 13.

6. Условия измерений

При выполнении измерений выполняют следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 ± 5) °С и относительной влажности не более 80 %;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

7. Подготовка к определению

7.1. Кондиционирование колонки

Перед началом анализа аналитическую колонку кондиционируют в потоке подвижной фазы (0,1 - 0,2 см³/мин) до стабилизации нулевой линии.

7.2. Приготовление растворов

7.2.1. 0,005 М раствор ортофосфорной кислоты: (0,5 ± 0,01) г 98%-й ортофосфорной кислоты помещают в мерную колбу объемом 1 дм³, растворяют в бидистиллированной воде и доводят объем до метки.

7.2.2. Для приготовления 75 %-го водного метанола, в мерную колбу объемом 1 дм³ помещают 750 мл метанола и доводят объем до метки бидистиллированной водой.

7.2.3. Для приготовления подвижной фазы смешивают ацетонитрил с 0,005 М раствором ортофосфорной кислоты в соотношении 1:99 по объему, используя мерные цилиндры.

7.3. Приготовление основного и градуировочных растворов

7.3.1. Основной раствор с концентрацией 0,5 мг/см³: точную навеску пропилентиомочевины (50 ± 0,5 мг) помещают в мерную колбу вместимостью 100 см³, растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки ацетонитрилом.

7.3.2. Приготовление градуировочных растворов

Градуировочные растворы с концентрациями пропилентиомочевины 0,05; 0,1; 0,2; 0,5 и 1,0 мкг/см³ готовят методом последовательного разбавления по объему, используя 0,005 М раствор ортофосфорной кислоты.

7.3.2.1. Раствор № 1 с концентрацией 1,0 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 100 см³ вносят 0,2 см³ основного раствора и доводят до метки 0,005 М раствором ортофосфорной кислоты.

7.3.2.2. Раствор № 2. с концентрацией 0,5 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 5 см³ раствора № 1 и доводят объем до метки 0,005 М раствором ортофосфорной кислоты.

7.3.2.3. Раствор № 3 с концентрацией 0,2 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 2 см³ раствора № 1 и доводят объем до метки 0,005 М раствором ортофосфорной кислоты.

7.3.2.4. Раствор № 4 с концентрацией 0,1 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 1 см³ раствора № 1 и доводят объем до метки 0,005 М раствором ортофосфорной кислоты.

7.3.2.5. Раствор № 5 с концентрацией 0,05 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 0,5 см³ раствора № 1 и доводят объем до метки 0,005 М раствором ортофосфорной кислоты.

Основной раствор можно хранить в холодильнике при температуре 0 - 4 °С в течение 7 дней, градуировочные растворы использовать в день приготовления.

При изучении полноты определения пропилентиомочевины используют растворы вещества, приготовленные из основного раствора методом последовательного разбавления по объему 0,005 М раствором ортофосфорной кислоты.

7.4. Построение градуировочного графика

Для установления градуировочной характеристики (площадь пика - концентрация пропилентиомочевины в растворе) в хроматограф вводят по 10 мм³ градуировочных растворов (не менее 3 параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4 точек по диапазону измеряемых концентраций). Затем измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации пропилентиомочевины в градуировочном растворе.

Методом наименьших квадратов рассчитывают градуировочный коэффициент (K) в уравнении линейной регрессии:

S - площадь пика градуировочного раствора.

Градуировку признают удовлетворительной, если значение коэффициента линейной корреляции оказывается не ниже 0,99.

Градуировочную характеристику необходимо проверять при замене реактивов, хроматографической колонки или элементов хроматографической системы, а также при отрицательном результате контроля градуировочного коэффициента.

Градуировочную зависимость признают стабильной при выполнении следующего условия:

С - аттестованное значение массовой концентрации пропилентиомочевины в градуировочном растворе;

С_k - результат контрольного измерения массовой концентрации пропилентиомочевины в градуировочном растворе;

λ_контр. - норматив контроля градуировочного коэффициента, % (λ_контр. = 10 % при Р = 0,95).

8. Отбор проб и хранение

Отбор проб производится в соответствии с «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов» (№ 2051-79 от 21.08.79), а также в соответствии с ГОСТ Р 51783-01 «Лук репчатый свежий, реализуемый в розничной торговой сети. Технические условия»; ГОСТ 7194-81 «Картофель свежий. Правила приемки и методы определения качества»; ГОСТ 1725-85 «Томаты свежие. Технические условия»; ГОСТ 27572-87 «Яблоки свежие для промышленной переработки». Пробы овощей хранят до анализа в герметичной полиэтиленовой упаковке в морозильной камере при -18 °С в течение 6 месяцев. Перед анализом пробы измельчают, не размораживая. Пробы яблок хранят до анализа в герметично закрытом двойном полиэтиленовом пакете в морозильной камере при температуре не выше -18 °С в течение 6 месяцев. Пробы яблочного и томатного сока хранят в холодильнике при температуре 0 - 4 °С в стеклянной таре с притертой пробкой в течение недели.

9. Проведение определения

9.1. Определение пропилентиомочевины в ботве и клубнях
картофеля, луке-репке, плодах томата и яблок

Навеску исследуемого материала 20 г помещают в полипропиленовую центрифужную пробирку, добавляют 50 см³ 75 %-го водного метанола и экстрагируют в ультразвуковой ванне 10 мин. Растворитель декантируют и экстракцию повторяют еще с 50 см³ 75 %-го водного метанола. 35 см³ объединенного экстракта переносят в чистую пробирку и добавляют 10 см³ окиси алюминия. Пробирку помещают в перемешивающее устройство на 10 мин, затем центрифугируют при 4000 об./мин 10 мин. После этого отбирают 25 см³ экстракта (аликвота, соответствующая 5 г) в круглодонную колбу и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 40 °С. Сухой остаток растворяют в 1 см³ подвижной фазы и 10 мм³ вводят в хроматограф.

Пробы ботвы растворяют в 10 см³ подвижной фазы и 10 мм³ вводят в хроматограф.

9.2. Определение пропилентиомочевины в томатном
и яблочном соках

Из представительной пробы сока отбирают 10 г и переносят в пробирку с 3 см³ окиси алюминия. Пробирку помещают в перемешивающее устройство на 10 мин, затем центрифугируют при 4000 об./мин 10 мин. После чего отбирают 5 см³ (аликвота, соответствующая 5 г) в круглодонную колбу и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 40 °С. Сухой остаток растворяют в 1 см³ подвижной фазы и 10 мм³ вводят в хроматограф.

9.3. Условия хроматографирования

Ультраэффективный жидкостный хроматограф с УФ-детектором, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки. Аналитическая колонка, заполненная сорбентом с привитыми монофункциональными полярными группами С18, (100×2,1) мм, 1,7 мкм. Температура колонки (30 ± 1) °С. Подвижная фаза: ацетонитрил и 0,005 М ортофосфорная кислота в соотношении 1:99. Скорость потока элюента: 0,2 см³/мин. Рабочая длина волны УФ-детектора 233 нм. Объем вводимой пробы 10 мм³. Время удерживания пропилентиомочевины (3,7 ± 0,1) мин.

10. Обработка результатов анализа

Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки. Содержание пропилентиомочевины в пробе (X, мг/кг) вычисляют по формуле:

S_x - площадь пика пропилентиомочевины на хроматограмме испытуемого образца, (AU);

K - градуировочный коэффициент, найденный на стадии построения соответствующей градуировочной зависимости;

V - объем пробы, подготовленной для хроматографического анализа, см³;

Р - навеска анализируемого образца, г.

Содержание остаточных количеств пропилентиомочевины в образце вычисляют как среднее из двух параллельных определений.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор пропилентиомочевины с концентрацией 1,0 мкг/см³, разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ.

11. Проверка приемлемости результатов
параллельных определений

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости:

X₁, Х₂ - результаты параллельных определений, мг/кг;

r - значение предела повторяемости (r = 2,8σ_r).

При невыполнении условия выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

12. Оформление результатов

Результат анализа представляют в виде:

 - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

Δ - граница абсолютной погрешности, мг/кг:

δ - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

В случае если содержание компонента меньше нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

«содержание вещества в пробе менее нижней границы определения» (например: менее 0,01 мг/кг, где 0,01 мг/кг - предел обнаружения пропилентиомочевины в луке).

13. Контроль качества результатов измерений

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1 - 6-02 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

Величина добавки C_д должна удовлетворять условию:

±Δ_л,Х (±Δ_л,Х′) - характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно), мг/кг, при этом:

Δ - граница абсолютной погрешности, мг/кг:

δ - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

Результат контроля процедуры К_к рассчитывают по формуле:

, , С_д - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки соответственно, мг/кг.

Норматив контроля К рассчитывают по формуле:

Проводят сопоставление результата контроля процедуры (К_к) с нормативом контроля (К).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предел воспроизводимости (R):

X₁, Х₂ - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.