Методические указания Министерства сельского хозяйства и продовольствия РФ
от 19 марта 1996 г. № 13-7-2/555

«По лабораторной диагностике трихомоноза крупного рогатого скота»

1. Общие положения

1.1. Трихомоноз - протозойная болезнь крупного рогатого скота, вызываемая Trichomonas foetus, характеризуется поражением и функциональным расстройством половой сферы. Течение болезни преимущественно хроническое, но у коров и нетелей бывает острое.

1.2. Диагноз на трихомоноз устанавливают на основании результатов микроскопического, культурального исследований с учетом клинических и эпизоотологических данных.

1.3. Лабораторные исследования на трихомоноз включают:

микроскопию нативного материала;

посев материала на питательную среду;

дифференциацию возбудителей.

2. Отбор и пересылка материала для исследования

2.1. Для исследования в лабораторию направляют: слизь из влагалища или шейки матки от подозреваемого в заболевании животного; соскобы со слизистой оболочки препуциального мешка, секрет придаточных половых желез, сперму быка, выделения из половых органов; абортированный плод целиком или сычуг с содержимым, паренхиматозные органы плода и часть плаценты.

2.2. Перед отбором материала для исследования моют наружные половые губы у коров, область препуциального отверстия у быков тёплой водой и вытирают чистым полотенцем.

2.3. Вагинально-цервикальную слизь берут в период течки. За день до отбора материала рекомендуется вводить животным подкожно 1,5 - 2,0 см³ 0,5 %-ного водного раствора прозерина или 1 %-ного раствора карбохолина.

2.4. При отборе материала и его разведении используют водный раствор хлорида натрия массовой концентрацией 8,5 г/дм³, рН 7,0 - 7,2 (далее раствор хлорида натрия).

2.5. Вагинально-цервикальную слизь берут полистироловыми пипетками. Для этого к шприцу при помощи резиновой муфты присоединяют полистироловую пипетку, набирают 5 см³ раствора хлорида натрия и через раскрытое зеркалом влагалище вводят его под давлением в шейку матки на глубину 3 - 4 см. Затем, не извлекая пипетки, шприцем насасывают раствор хлорида натрия со слизью, переносят в стерильную пробирку, которую закрывают резиновой пробкой.

Вагинальную слизь можно брать ложкой-катетером, которую вводят во влагалище животного без зеркала. При этом положение ложки должно быть боковым, а ее стержня - горизонтальным. Ложкой делают соскобы из различных мест слизистой оболочки влагалища и через канал стержня переливают в пробирку. Если соскоб густой консистенции, через канал стержня вводят 5 см³ раствора хлорида натрия, затем насасывают, выливают в пробирку и закрывают пробкой.

2.6. От быков станций (предприятий) по искусственному осеменению животных берут сперму и препуциальную слизь; от быков, используемых для естественного спаривания, - препуциальную слизь и секрет придаточных половых желез.

Сперму у быков получают при помощи искусственной вагины и переливают в стерильные флаконы и пробирки.

Секрет придаточных половых желез у быков получают путем их массажа через прямую кишку в стерильные пробирки или флаконы.

Слизь из различных мест слизистой оболочки препуция берут с помощью прибора ПСБ-1. Смонтированный прибор вводят в полость препуция до ее середины. Затем выдвинутым стержнем с наконечником и впитывающим тампоном делают 3 - 4 возвратно-поступательных движения от свода препуциальной полости до трубки прибора. Стержень втягивают в трубку, осторожно извлекают, опускают в пробирку с 3 см³ раствора хлорида натрия, тампон отжимают и извлекают, пробирку закрывают резиновой пробкой.

2.7. Материал для исследования отбирают не раньше, чем через 6 дней после профилактических орошении и через 10 дней после лечения трихомонадоцидными препаратами.

2.8. Пробы секрета придаточных половых желез, неразбавленной спермы, препуциальной, влагалищной слизи, патологических выделений в пробирках или флаконах помещают в термос со льдом и нарочным доставляют в лабораторию не позднее 4 ч после отбора.

2.9. Абортированный плод целиком или сычуг с содержимым, паренхиматозные органы плода, часть плаценты во влагонепроницаемой таре доставляют в лабораторию не позднее 12 ч после аборта. В холодное время года плоды рекомендуется замораживать.

3. Микроскопическое исследование

3.1. С измененных участков плаценты делают соскобы и опускают во флаконы.

Соскобы густой консистенции разбавляют раствором хлорида натрия температуры 37 °C в 2 - 5 раз.

3.2. Из доставленного для исследования патологического материала делают по 2 препарата из каждого объекта. Жидкий материал (соскобы, слизь препуциальная, влагалищная, секрет, патологические выделения) берут пастеровской пипеткой со дна флакона или пробирки, каплю наносят на чистое предметное стекло и накрывают покровным. Готовый препарат, исследуют методом раздавленной капли под малым (×8 - 10), затем под средним увеличением микроскопа (×40) в затемненном поле зрения.

3.3. В положительных случаях в препаратах обнаруживают живых трихомонад с ундулирующей мембраной и аксостилем, движения их скачкообразно-поступательное или поступательно-вращательное. Дифференциацию трихомонад проводят как указано в п. 5.1.

4. Культуральное исследование

4.1. При Отсутствии трихомонад в исходных мазках проводят культуральные исследования, используя среду Петровского или пептонно-агаровую (приложение).

4.2. Каждую пробу (сперму, секрет, препуциальную, влагалищную слизь, патологические выделения) от животного высевают в две пробирки со средой. При исследовании абортированного плода пастеровской пипеткой делают посевы из смеси содержимого грудной, брюшной полостей, сычуга, из печени, легких, сердца, соскобов с измененных участков плаценты, околоплодной жидкости в две пробирки со средой. В пробирки со средой вносят по 0,3 - 0,5 см³ материала.

4.3. Засеянные пробирки инкубируют в термостате при 37 ± 1 °С в течение 10 дн.

Посевы просматривают визуально на 3, 5, 7, 9 дн. При обнаружении помутнения среды стерильной пипеткой берут каплю среды со дна пробирки и готовят препарат. Если в препарате обнаруживают живых трихомонад, исследование прекращают.

5. Дифференциальная диагностика и оценка результатов

5.1. Для дифференциации из материала или среды, содержащих трихомонад, готовят по 2 мазка. Материал берут стерильной пастеровской пипеткой со дна пробирки, наносят на чистое обезжиренное предметное стекло и распределяют тонким слоем. Мазки высушивают на воздухе, фиксируют этиловым ректификованным спиртом 96-градусным в течение 20 - 25 мин, окрашивают азур-эозином по Романовскому-Гимзе (краску разводят дистиллированной водой рН 7,0 - 7,2 в соотношении 1:10) - 40 - 90 мин. (в зависимости от качества краски и температуры), промывают дистиллированной или водопроводной водой рН 7,0 - 7,2 до исчезновения следов краски на фильтровальной бумаге, высушивают и исследуют под иммерсионной системой микроскопа (×90).

5.2. При микроскопии обнаруживают трихомонад округлой, овальной, грушевидной, ланцетовидной, палочковидной форм. Цитоплазма трихомонад окрашивается в голубой цвет различной интенсивности, ядро - в красно-фиолетовый или красный, жгутики - в красный или розовый цвет.

От переднего конца Т. foetus отходят 4 жгутика, из которых три направлены вперед, а четвертый, окаймляя ундулирующую мембрану, идет назад и оканчивается свободно. Вдоль всего тела расположен аксостиль. Ядро овальной формы, чаще расположено ближе к передней части тела возбудителя.

5.3. Трихомонад необходимо дифференцировать от других жгутиковых простейших. Дифференциация основана на наличии характерных морфологических признаков возбудителей. У непатогенных жгутиковых родов Oicomonas, Cercomonas, Bodo ундулирующая мембрана и аксостиль отсутствуют и имеются 1 или 2 жгутика.

5.4. Результат исследований считают положительным при обнаружении в препарате из нативного материала или посевов возбудителя трихомоноза.

6. Сроки исследований

Микроскопического - 1 дн,

Культурального - 10 дн.

С утверждением настоящих Методических указаний на территории Российской Федерации утрачивает силу «Методические указания по лабораторной диагностике трихомоноза крупного рогатого скота», одобренные Главветупром МСХ СССР 29.12.85 г.

Рецепты питательных сред

1. Среда Петровского. Свежую печень крупного рогатого скота освобождают от жира, пленок, канальцев и измельчают в мясорубке. 1 кг фарша заливают 1 дм³ водопроводной воды рН 7,0 - 7,2, настаивают в течение 1 ч и кипятят при помешивании 1 ч. После отстаивания фарш удаляют, а жидкость доливают дистиллированной водой рН 7,6 - 7,2 до первоначального объема и фильтруют через ватно-марлевый фильтр.

Берут 500 см³ печеночной воды и 500 см³ дистиллированной воды рН 7,0 - 7,2 добавляют 10 г пептона, 5 г хлорида натрия (химически чистого) и доводят до кипения. Бульон охлаждают, определяют рН и доводят 1 %-ным водным раствором едкого натра до 8,2 - 8,4. Бульон повторно кипятят в течение 30 мин. Затем добавляют 10 г мальтозы или глюкозы, 0,3 г растворимого крахмала. Среду разливают в стерильные пробирки по 8 см³, заливают вазелиновым маслом по 0,3 - 0,5 см³, стерилизуют при 112 ± 1 °С в течение 30 мин.

Полученная среда светло-коричневого или светло-соломенного цвета, рН готовой среды 7,2 - 7,4.

Срок хранения среды в холодильнике до 6 мес.

2. Пептонно-агаровая среда. К 900 см³ кипяченой дистиллированной воды рН 7,0 - 7,2 добавляют 0,5 г агар-агара и смесь кипятят до полного растворения компонента. В горячий раствор последовательно вносят 20 г пептона, 10 г глюкозы, 7 г хлорида натрия (химически чистого.), постоянно встряхивая колбу. После растворения компонентов среду в горячем виде фильтруют через слой фильтровальной бумаги, в фильтрат добавляют кипяченную дистиллированную воду до первоначального объема, закрывают резиновой пробкой с инъекционной иглой, а горлышко с пробкой перевязывают двумя слоями марли и ставят в кипящую баню на 1 ч, рН среды 6,9 - 7,2. Если рН среды ниже, добавляют по каплям 1 %-ный водный раствор едкого натра.

Охлажденную среду разливают в стерильные пробирки по 8 см³, наслаивают вазелиновое или растительное масло по 0,5 см³, закрывают ватными пробками и стерилизуют при 112 ± 1 °С в течение 30 мин. Среда светло-соломенного цвета, содержит небольшую взвесь из частиц агар-агара.

Срок хранения среды в холодильнике до 3 мес.

Перед посевом в каждую пробирку со средами добавляют стерильную сыворотку крови лошади или крупного рогатого скота без признаков гемолиза - 1 см³ и антибиотики из расчета на 1 см среды: стрептомицин - 1 мг, пенициллин - 1000 ед., а в пептонно-агаровую среду дополнительно нистатит - 250 ед. После чего пробирки помещают в термостат при 37 ± 1 °С на 1 - 1,5 ч.

СОДЕРЖАНИЕ