Приказ Минздрава РФ от 23 декабря 1998 г. № 375

"О мерах по усилению эпидемиологического надзора и профилактики
менингококковой инфекции и гнойных бактериальных менингитов"

Последний эпидемический подъем заболеваемости менингококковой инфекцией, длившийся в нашей стране более 20 лет (1968 - 1995 гг.), завершился. Последующий период спорадической заболеваемости менингококковой инфекции требует особого внимания. Успокоенность, основанная на эпидемиологическом благополучии, а также недостатки в организации и проведении эпидемиологического надзора и профилактических мероприятий, направленных на предупреждение возникновения менингококковой инфекции, снижение уровня коллективного иммунитета за счет вновь родившихся детей в стране, могут создать условия для роста заболеваемости.

Недостаточный уровень лабораторной диагностики в этиологической расшифровке гнойных бактериальных менингитов не позволяет проследить за формированием предоминирующего моноклона эпидемических штаммов менингококков (серогруппы A и C), а также исключить гипердиагностику менингококковой инфекции.

Московским научно-исследовательским институтом эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского совместно с Государственным унитарным предприятием по производству бактерийных препаратов им. Г.Н. Габричевского разработан комплексный препарат для профилактики менингита A+C, но из-за недостатка финансирования не налажен промышленный выпуск вакцин против менингококковой инфекции. По этой же причине медленными темпами проводятся клинические испытания вакцины группы B.

В целях предупреждения эпидемиологического неблагополучия в отношении менингококковой инфекции на территории Российской Федерации приказываю:

1. Руководителям органов управления здравоохранением субъектов Российской Федерации, главным врачам центров госсанэпиднадзора в субъектах Российской Федерации, регионов на транспорте организовать работу по осуществлению эпиднадзора и совершенствованию лечебно-диагностических и профилактических мероприятий по борьбе с менингококковой инфекцией и гнойными бактериальными менингитами в соответствии с инструктивно-методическими указаниями:

1.1. "По проведению эпидемиологического надзора за менингококковой инфекцией" (Приложение 1).

1.2. "По клинике, диагностике и лечению менингококковой инфекции" (Приложение 2).

1.3. "По микробиологической диагностике менингококковой инфекции и бактериальных менингитов" (Приложение 3).

1.4. "По противоэпидемическим мероприятиям при менингококковой инфекции" (Приложение 4).

1.5. "По использованию реакции непрямой гемагглютинации для выявления антител при менингококковой инфекции" (Приложение 5).

2. Управлению организации обеспечения лекарствами и медицинской техникой представить к 01.02.99 предложения об организации промышленного выпуска вакцины для профилактики менингококковой инфекции A+C.

3. Департаменту экономики планирования и финансирования здравоохранения, Департаменту госсанэпиднадзора предусмотреть первоочередное финансирование разработки менингококковой вакцины группы B в рамках Федеральной целевой программы "Вакцинопрофилактика" на 1999 - 2000 годы и на период до 2005 года.

4. Считать недействующим на территории Российской Федерации приказ Министерства здравоохранения СССР от 01.12.88 № 858 "О мерах по совершенствованию лечебно-диагностических и профилактических мероприятий по борьбе с менингококковой инфекцией и внедрению эпидемиологического надзора".

5. Контроль за выполнением настоящего приказа возложить на Первого заместителя Министра здравоохранения Российской Федерации Онищенко Г.Г.

 

Министр

В.И. Стародубов

 

Приложение 1
к приказу Минздрава РФ
от 23 декабря 1998 г. № 375

Методические указания по проведению эпидемиологического надзора
за менингококковой инфекцией

Эпидемиологический надзор за менингококковой инфекцией - комплексное динамическое наблюдение за эпидемическим процессом, включающее многолетний и внутригодовой анализ заболеваемости и летальности в разных возрастных группах и контингентах населения, клинических проявлений инфекции и факторов, способствующих ее распространению (носительство менингококка, иммунологическая структура, биологические особенности возбудителя, социальные и природные факторы и др.).

Цель эпидемиологического надзора: оценка эпидемиологической ситуации на конкретный момент времени, составление краткосрочного прогноза и рекомендаций для проведения наиболее рациональных мер борьбы с инфекцией с целью снижения заболеваемости и летальности.

Эпидемиологический надзор должен осуществляться комплексно при участии эпидемиологов, клиницистов, микробиологов, санитарных статистиков, организаторов здравоохранения.

Система эпидемиологического надзора включает:

1. Слежение за заболеваемостью и летальностью менингококковой инфекции и гнойных менингитов другой этиологии.

2. Слежение за массивностью циркуляции менингококков в населении и их свойствами.

3. Иммуно-эпидемиологические исследования с целью выявления групп наибольшего риска заболевания.

4. Эпидемиологический анализ ситуации и оценка эффективности проводимых мероприятий.

1. Слежение за заболеваемостью и летальностью менингококковой инфекции и гнойных менингитов другой этиологии

Характеристика эпидемиологической ситуации на конкретной территории складывается из анализа уровня заболеваемости в целом, а также по отдельным возрастным группам населения. Анализ проводится раздельно для генерализованных и локализованных форм менингококковой инфекции. Основным источником сведений о заболевших является экстренное извещение (Ф.058-у). Этиология заболевания определяется выделением возбудителей из ликвора или крови больных, их антигенов в ВИЭФ, ИФА, других реакциях, а также по динамике титров антител в РПГА к основным серогруппам менингококков. (Приложение 3 и 5).

2. Слежение за циркуляцией менингококков в населении и их свойствами

Характеристика циркулирующих штаммов менингококков на территории слагается из анализа следующих показателей:

2.1 серогрупповой принадлежности менингококков, выделенных от больных генерализованными формами инфекции и менингококковыми назофарингитами;

2.2 серогрупповой принадлежности менингококков, выделенных от носителей в очагах инфекции;

2.3 серогрупповой характеристики менингококков, выделенных от носителей в "индикаторных" группах, которыми являются:

- дети 6 - 8 лет, посещающие подготовительные группы детских дошкольных учреждений и 0 - 1 классы школ;

- подростки и взрослые, объединенные проживанием в общежитиях;

- учащиеся средних и высших учебных заведений, 9 - 11 классов общеобразовательных школ.

Обследование проводится в зимне-весенний период (декабрь - май) и должно охватывать от 500 до 1000 человек. Бактериологическое обследование на носительство менингококков в "индикаторных" группах рекомендуется проводить в первую очередь в коллективах, где имеют место случаи групповых заболевания острыми респираторными инфекциями (в течение 7 дней возникает 3 и более случаев заболевания);

2.4 определения чувствительности к сульфаниламидам и антибиотикам штаммов менингококков, выделенных из ликвора и крови больных, и из носоглоточной слизи носителей и больных назофарингитами. (Приложение 3).

3. Эпидемиологическая оценка иммуноструктуры населения

Иммунологические исследования в отношении менингококков ведутся баклабораториями Областных и Городских ЦСЭН с помощью РПГА с менингококковыми полисахаридными диагностикумами (Приложение 5). Серологические исследования проводятся среди детей возрастной группы 6 - 8 лет, посещающих подготовительные группы детских дошкольных учреждений, школьников первых классов общеобразовательных школ (2 % от общей их численности). Исследуются также сыворотки взрослых (кожвендиспансеры, декретированные контингенты, беременные и роженицы).

По мере необходимости исследованию должно подвергаться не менее 1000 человек в 1, 2 и 4 кварталах года.

4. Эпидемиологический анализ

Эпидемиологической оценке подлежат следующие показатели:

4.1 территориальное распределение заболевших генерализованными формами менингококковой инфекции (ГФМИ);

4.2 помесячное распределение заболевших ГФМИ в разрезе района, города, области (края), республики по каждому возрасту в абсолютных и относительных показателях;

4.3 распределение заболевших ГФМИ по клиническим формам болезни;

4.4 распределение заболевших по контингентам;

4.5 очаговость генерализованных форм инфекции в коллективах;

4.6 летальность инфекции в разных возрастных группах;

4.7 сроки госпитализации больных;

4.8 серогрупповая принадлежность менингококков, выделенных от больных;

4.9 распределение носителей менингококков по возрастам;

4.10 серологический пейзаж менингококков, выделенных от носителей в очагах инфекции и в "индикаторных" группах.

Для полноценного эпидемиологического анализа дается оценка эпидемиологической ситуации в отношении менингококковой инфекции на конкретной территории.

Для ее краткосрочного прогнозирования (на 2 - 3 года) могут быть использованы следующие признаки:

Для начала эпидемического подъема характерно:

1. Общий рост заболеваемости по сравнению с предыдущими 22 годами;

2. Преимущественное выделение из крови и ликвора больных одной (ведущей) серогруппы менингококка (A, B, C и др.);

3. Рост заболеваемости лиц старшего возраста (подростков и взрослых);

4. Появление очагов с множественными заболеваниями генерализованными формами инфекции в организованных коллективах юношей, круглосуточных группах детских дошкольных учреждений;

5. Увеличение уровня носительства одной из ведущих серогрупп менингококка;

6. Увеличение удельного веса лиц с титрами противоменингококковых антител выше 1:40 по сравнению с предыдущими 2 - 3 годами (как отражение активизации циркуляции менингококка).

Признаки завершения эпидемиологического подъема заболеваемости:

1. Постепенное снижение заболеваемости, в первую очередь, у взрослых, подростков, затем детей старших возрастных групп;

2. Возрастание удельного веса среди заболевших детей до 5 лет, особенно значительное возрастной группы до 2 лет;

3. Уменьшение этиологической роли менингококка, вызвавшего эпидемиологический подъем и увеличение возбудителей других серогрупп, в том числе редко встречающихся;

4. Отсутствие очагов с множественными заболеваниями ГФМИ;

5. Снижение в очагах инфекции циркуляции менингококка, вызвавшего подъем заболеваемости;

6. Высокий уровень противоменингококковых антител (при низком количестве отрицательных проб) к серогруппе менингококка, вызвавшего подъем заболеваемости.

Реализация результатов эпидемиологического надзора за менингококковой инфекцией

В результате анализа эпидемиологической ситуации и прогноза ее дальнейшего развития Департаментом здравоохранения планируется комплекс диагностических, лечебных и противоэпидемических мероприятий и доводится до сведения руководителей учреждений лечебно-профилактической и санитарно-эпидемической службы (обратная связь). Оценка своевременности и полноты проводимых мероприятий проводится при необходимости в течение года, обязательно в 1 квартале за отчетный год.

 

Руководитель Департамента Госсанэпиднадзора

А.А. Монисов

 

Приложение 2
к приказу Минздрава РФ
от 23 декабря 1998 г. № 375

Методические указания по клинике, диагностике и лечению менингококковой инфекции

Клиника

Инкубационный период от 1 до 10 дней (чаще 2 - 4 дня). Клинические проявления менингококковой инфекции многообразны. Различают следующие клинические формы болезни (В.И. Покровский с соавт. 1976 г.):

1. Первично-локализованные формы:

а) менингококконосительство;

б) назофарингит.

2. Генерализованные формы:

а) менингококцемия;

б) менингит, менингоэнцефалит;

в) сочетанная форма (менингококцемия + менингит, менингоэнцефалит).

Возможны: менингококковая пневмония, эндокардит, артрит, иридоциклит.

Назофарингит - наиболее распространенная форма болезни. Основными симптомами являются общая слабость, головная боль, боль в горле при глотании, сухой кашель, заложенность носа, у части больных - скудное слизисто-гнойное отделяемое из носа. Задняя стенка глотки отечна, гиперемирована, возможно наложение слизи, со 2 - 3 дня отмечается гиперплазия лимфоидных фолликулов. У детей младшего возраста нередко гиперемия миндалин и слизистой мягкого неба. Температура чаще субфебрильная, реже нормальная или достигает 38 - 39 °C. Заболевание обычно заканчивается выздоровлением в течение 3 - 7 дней. Гиперплазия лимфоидных фолликулов может сохраняться до 2-х недель. В отдельных случаях происходит генерализация инфекции.

Менингококцемия. Начинается остро, но возможен продромальный период в виде назофарингита. Появляется озноб, сильная головная боль, боль в мышцах и суставах, возможна рвота, резко повышается температура. Наиболее характерным симптомом является геморрагическая сыпь, появляющаяся через 6 - 18 часов, редко на 2-й день болезни. Элементы сыпи имеют неправильную звездчатую форму размером от мелких петехий до крупных экхимозов диаметром в несколько сантиметров. Элементы плотноваты на ощупь, слегка возвышаются над поверхностью кожи. В начальном периоде болезни сыпь может носить розеолезно-папулезный характер или сочетаться с геморрагической. Излюбленная локализация сыпи - дистальные отделы конечностей, ягодицы, боковая поверхность туловища. Розеолезные и папулезные элементы в течение 1 - 2 дней бесследно исчезают, мелкие геморрагии пигментируются, крупные элементы часто уже в первые дни болезни некротизируются, а затем покрываются корками, после отторжения которых остаются различной глубины дефекты тканей. Возможны некрозы и сухая гангрена ушных раковин, носа, фаланг пальцев, изредка кистей и стоп. Часто наблюдаются кровоизлияния в слизистые оболочки глаза, в тяжелых случаях - носовые, желудочно-кишечные, маточные, почечные кровотечения. Кровоизлияния в оболочки и вещество мозга, внутренние органы обуславливают соответствующую клиническую симптоматику.

С первого дня болезни отмечается выраженная интоксикация: бледность, сухость кожных покровов, обложенный язык, повышенная жажда, отсутствие аппетита. Нарушения деятельности сердца проявляются глухостью сердечных тонов, синусовой тахиаритмией, снижением артериального давления. Возможно развитие мио-, эндо- и перикардитов.

При тяжелом течении менингококцемии почки чаще всего поражаются по типу токсического нефроза. Суставы поражаются у 5 - 8 % больных менингококцемией. Наблюдаются моно- и полиартриты как серозные, так и гнойные. Гемограмма характеризуется резко выраженным лейкоцитозом, нейтрофильным сдвигом влево до юных, иногда и до миелоцитов, анэозинофилией, увеличением СОЭ.

Менингококцемия протекает в легкой, среднетяжелой и тяжелой формах. Особое внимание заслуживает молниеносная форма менингококцемии, протекающая с инфекционно-токсическим шоком. Болезнь в этих случаях начинается с потрясающего озноба, в течение нескольких часов температура тела достигает 39,5 - 41,0 °C. Резко выражены боли в мышцах, суставах, головная боль, часто боль в животе, рвота, возможен жидкий стул. Сыпь, как правило, появляется в первые 6 - 8 часов. Элементы крупные, быстро некротизируются. Помимо высыпаний на конечностях, сыпь появляется на животе, груди, шее, лице. Характерны множественные кровоизлияния в слизистые глаз, которые появляются раньше кожных высыпаний, возможно отделение геморрагической слезной жидкости.

Признаки развивающегося шока чаще появляются одновременно или несколько позже появления сыпи, но в наиболее тяжелых случаях могут предшествовать высыпаниям.

Первая фаза шока характеризуется эйфорией, чувством тревоги, двигательным беспокойством. У детей младших возрастных групп возможны фибрильные судороги, нарушение сознания. У взрослых и детей старше 3-х лет сознание ясное. Нередко гиперестезия. Одновременно появляется бледность кожи, похолодание конечностей, цианоз губ и ногтевых пластинок, тахикардия, одышка. Температура тела начинает снижаться. Артериальное давление нормальное, иногда повышенное, ЦВД снижено. Существенных нарушений КОС не выявляется.

Возможна умеренная гипокапния, гипокалиемия, при исследовании гемостаза - гиперкоагуляция.

Во второй фазе шока больные становятся адинамичными, появляется акроцианоз, температура тела снижается до нормы, артериальное давление падает до 50 % нормы. Снижается диурез. Выявляется дальнейшее снижение ЦВД, субкомпенсированный метаболический ацидоз, гипоксемия, тенденция к гипокоагуляции, тромбоцитопения.

В третьей фазе шока больные резко заторможены, болевая чувствительность снижена, тотальный цианоз, гипотермия, артериальное давление ниже 50 % нормы, часто не определяется. Тоны сердца глухие, выраженная тахикардия и одышка, клинические признаки повышенной кровоточивости, олигурия, анурия. Полиорганная недостаточность (почечная, дыхательная, сердечно-сосудистая, надпочечниковая, отек мозга).

Смерть наступает от остановки сердечной деятельности, реже дыхания. При исследовании КЩС характерен декомпенсированный метаболический ацидоз. Нарастает гипокоагуляция, электролитные расстройства. Ранними прогностически неблагоприятными признаками являются лейкоцитоз крови менее 8 тыс./мкл и тромбоцитопения менее 80 тыс./мкл.

Хроническая менингококцемия - редкий вариант болезни, характеризуется периодически возникающей лихорадкой, высыпаниями на коже, поражением суставов, эндокардитом.

Менингит. Болезнь развивается остро, иногда на фоне назофарингита. Температура повышается с ознобом до 38 - 40 °C, рано появляется и быстро усиливается диффузная головная боль, становясь нестерпимой, возникает повторная рвота. На 1 - 2 дни болезни появляются и быстро нарастают менингеальные симптомы: ригидность мышц затылка, симптомы Кернига, Брудзинского, гиперестезия. Степень проявления отдельных менингеальных симптомов не всегда одинакова. Характерная менингеальная поза (запрокинутая голова и поджатые к животу ноги) появляется не ранее 3 - 5 дня болезни.

В большинстве случаев уже в первые дни заболевания имеется изменение сознания от легкой оглушенности до комы. Нередко наблюдается психомоторное возбуждение, бессонница или сонливость, бред, реже галлюцинации. Сухожильные рефлексы чаще повышены, возможны анизорефлексия, клонусы стоп, пирамидные знаки. Нередко выявляется поражение 3, 6, 7, 8 пар черепных нервов. При исследовании глазного дна у ряда больных обнаруживают застойные явления, мелкие кровоизлияния в сетчатку. Нарушение слуха является следствием гнойного лабиринтита, реже - неврита 8 пары. Очень редко менингококковый менингит дебютирует болями в ухе. У детей нередко наблюдаются судороги и тремор конечностей.

Изменения периферической крови аналогичны таковым при менингококцемии. Внутричерепное давление чаще выше нормы. Спинномозговая жидкость опалесцирующая или мутная, молочно-белого, реже желтовато-зеленого цвета. Количество клеток увеличивается от 0,2 - 0,5 Г/л до 3 - 10 Г/л преимущественно за счет нейтрофилов. Содержание белка ликвора повышается от 0,6 до 4,6 Г/л и больше, реакция Панди и Нонне-Апельта положительные. Количество глюкозы в спинномозговой жидкости в первый день близко к норме, затем прогрессивно снижается. При исследовании в ранние сроки воспалительные изменения могут быть выражены слабо или отсутствовать. В редких случаях воспалительный процесс в оболочках мозга носит серьезный характер.

Пульс в начале болезни учащен, при нарастании внутричерепного давления иногда отмечается относительная брадикардия. Артериальное давление умеренно повышено. Потеря аппетита и запор при менингите встречаются часто. У детей изредка бывает понос. Наблюдается рефлекторная задержка мочи. Лихорадка при менингите не имеет определенного типа и не находится в каком-либо соответствии с тяжестью течения болезни.

В настоящее время, в связи с широким амбулаторным применением антибактериальных препаратов возросло количество атипичных форм. В этих случаях возможно подострое течение с субфебрильной или даже нормальной температурой, незначительной интоксикацией. Менингеальные симптомы появляются поздно, головная боль умеренная, рвота бывает редко. У детей течение болезни волнообразное, в ряде случаев развивается менингоэнцефалит, вентрикулит, плохо поддающиеся антибактериальной терапии.

При современных методах лечения менингококковый менингит протекает благоприятно, но возможно развитие острого отека - набухания мозга, приводящего к сдавлению ствола мозга с нарушением функций жизненно важных центров. Это осложнение развивается как в первые часы болезни, так и более поздние сроки, чаще у детей 1 - 3-х лет и у лиц старше 50 лет. Отек-набухание мозга может возникнуть как при повышенном, так и сниженном люмбальном давлении.

Отек-набухание мозга всегда сопровождает развитие менингита и его клинические проявления входят в симптоматику менингита. Однако при его прогрессировании (распространении на стволовые структуры мозга, появление признаков дислокации мозга) присоединяются новые симптомы, указывающие на необходимость проведения неотложных терапевтических мероприятий. К ним относятся глубокие нарушения сознания, судорожный синдром, нарушения функции дыхательного и сосудодвигательного центра.

Чаще первым признаком прогрессирования отека-набухания мозга является нарастающая спутанность сознания, психомоторное возбуждение, сопор, быстро переходящий в кому. У части больных наблюдаются приступы генерализованных судорог, которым могут предшествовать миофибрилляции, а у детей мышечный тремор. Появляется и быстро нарастает одышка. Дыхание становится поверхностным, аритмичным, шумным с участием вспомогательных мышц и ограниченной подвижностью диафрагмы, что быстро приводит к гипоксемии и гипокапнии. Возможно дыхание Чейн-Стокса, брадипное или внезапное апноэ без видимых предшествующих нарушений дыхания.

Гемодинамические расстройства проявляются нарастающей тахикардией и тахиаритмией. Лишь у части больных удается выявить кратковременную брадикардию. Артериальное давление имеет тенденцию к повышению, особенно систолическое, реже, особенно у детей наблюдается выраженная гипотензия. При мониторировании выявляются резкие колебания АД.

Характерен внешний вид больного: лицо багрово-синюшное, лоснящееся, потоотделение усилено. У детей возможна выраженная бледность кожи.

При лабораторных исследованиях выявляется нарастающая гипоксемия, гипокапния, декомпенсированный дыхательный алкалоз. В терминальном периоде возможен дыхательный и метаболический ацидоз. Смерть обычно наступает от остановки дыхания, сердечная деятельность продолжается в течение нескольких минут.

Менингококковый менингоэнцефалит - характеризуется длительными расстройствами сознания, судорожным синдромом, стойкой очаговой симптоматикой (парезы черепных нервов и конечностей, подкорковые и мозжечковые нарушения), психическими расстройствами. При исследовании ликвора возможна белково-клеточная диссоциация.

Менингит с синдромом вентрикулита - проявляется сонливостью, расстройством психики, высоким мышечным тонусом, нарастанием белково-клеточной диссоциации. Наряду с этим возникают симптомы развивающейся гидроцефалии: сильная головная боль, рвота, застойные отеки зрительных нервов. Температура тела нормальная или понижена.

Основной особенностью клинических проявлений менингита у детей первого года жизни является отсутствие типичных признаков поражения мозговых оболочек, свойственных взрослым. Это обуславливает трудности в диагностике заболевания и наряду с возрастными особенностями реактивности организма, является важной причиной высокой летальности и остаточных явлений среди больных этой возрастной группы. Начало заболевания, как правило, острое. Появляется беспокойство, немотивированный крик, отказ от еды, срыгивание, нарушение сна, тремор ручек, затем присоединяются генерализованные судороги, высокая лихорадка, повторная рвота, которые заставляют родителей обратиться к врачу. Важное диагностическое значение имеет напряжение и выбухание большого родничка, симптомы подвешивания и посадки. Ребенок часто вскрикивает, тянет ручки к головке. Отмечается выраженная гиперестезия, стойкий красный дермографизм. Одним из ранних симптомов менингита может быть запрокидывание головки. Следует помнить, что у детей первых трех месяцев мышечный тонус физиологически повышен, это может имитировать ригидность затылочных мышц и симптом Кернига.

Нарушение церебральной гемодинамики, ликворопродукции, наряду с потерями жидкости за счет рвоты и диареи, в отдельных случаях проявляется синдромом церебральной гипотензии. Родничок становится запавшим, не пульсирует, мышечный тонус снижен, менингеальные симптомы угасают. Сухожильные рефлексы угнетены. Черты лица заострены, глаза запавшие, кожа сухая. Больные находятся в состоянии стопора или комы. Внутричерепное давление резко снижено (церебральный коллапс). Ликвор при пункции вытекает редкими каплями. Синдром церебральной гипотензии может быть следствием чрезмерной дегидратации. У детей старшего возраста и взрослых наблюдается редко.

Сочетанная форма болезни. Является наиболее частой. При этом клинические проявления менингококцемии сочетаются с менингитом. Сыпь, как правило, появляется на несколько часов - сутки раньше, чем поражение оболочек мозга.

Диагноз и дифференциальный диагноз

Диагноз менингококковой инфекции ставится на основании клинико-эпидемиологических данных. Из неспецифических лабораторных методов наибольшее значение имеет общий анализ крови и ликвора.

Из специфических методов наибольшее значение имеет метод бактериологического исследования ликвора и крови. Метод бактериоскопии имеет ориентировочное значение. Для обнаружения антигена в ликворе и крови может быть использован метод ВИЭФ, для обнаружения специфических антител РПГА.

При менингококцемии дифференциальный диагноз проводится с другими инфекционными заболеваниями, протекающими с экзантемами: сепсисом, лептоспирозом, иерсиниозом, корью, краснухой, сыпным тифом, геморрагическими лихорадками, а также с тяжелой формой гриппа, сопровождающегося геморрагическими проявлениями, но протекающим без сыпи, токсико-аллергическими (медикаментозными) дерматитами, геморрагическими диатезами (болезнь Верльгофа, геморрагические васкулиты).

При менингококковом менингите дифференциальный диагноз проводится с гнойными менингитами неменингококковой этиологии, серозными вирусными и бактериальными (туберкулезный) менингитами и менингоэнцефалитами, субарахноидальными, реже субдуральными гематомами, объемными процессами, комами различной этиологии, судорожными синдромами, острыми инфекционными болезнями, протекающими с явлениями менингизма. Важное значение имеет исследование ликвора (табл. 1).

Таблица 1

Важнейшие ликворологические дифференциально-диагностические признаки

 

При формулировке диагноза указывается нозология - менингококковая инфекция, затем клиническая форма в соответствии с классификацией, тяжесть течения болезни (легкая, средней тяжести, тяжелая), осложнения, сопутствующие заболевания.

Лечение

Больные назофарингитом госпитализируются по эпидемиологическим показаниям. Проводится симптоматическая терапия, а при выраженной интоксикации и лихорадке применяют ампициллин, левомицетин или рифампицин в течение 3 - 5 дней в возрастной дозировке. Показаны полоскания ротоглотки дезинфицирующими растворами.

Больные генерализованными формами менингококковой инфекции подлежат экстренной госпитализации на врачебных машинах службы скорой помощи, а при наличии признаков шока и дыхательных расстройств - реанимационной службой. На дому следует ввести разовую дозу пенициллина, а при тяжелой менингококцемии предпочтительнее введение левомицетинасукцината. В этих случаях целесообразно ввести преднизолон (0,5 - 1,0 мг/кг), а при наличии признаков менингита - лазикс (детям 1 мг/кг, взрослым - 20 - 40 мг). По показаниям назначают противосудорожные средства.

Больные менингококковой инфекцией, осложненной инфекционно-токсическим шоком, отеком-набуханием мозга, а также с тяжелым менингоэнцефалитом в состоянии комы, при наличии судорожного синдрома и стволовых нарушений госпитализируются в отделение реанимации или палату интенсивной терапии.

Рекомендуемые этиотропные средства представлены в таблице 2.

Таблица 2

Основные антибактериальные препараты для лечения генерализованных форм менингококковой инфекции

 

Назначается один из препаратов. Основным является бензил-пенициллин, применяемый в массивных дозах в связи с низким пассажем в субарахноидальное пространство. Антибиотик обладает бактерицидным действием, что обуславливает быструю гибель микробов, которая может усилить интоксикацию. Поэтому при молниеносных формах болезни, осложненных инфекционно-токсическим шоком и отеком-набуханием мозга, предпочтительнее использовать левомицетин-сукцинат. Левомицетин лучше других антибиотиков проникает в субарахноидальное пространство и медленней выводится. В связи с бактериостатическим действием препарата клинический эффект выявляется в среднем на сутки позже, чем при лечении пенициллином. При позднем поступлении, наличии энцефалита и вентрикулита целесообразней назначение пенициллина.

При первичных гнойных менингитах, этиология которых не установлена, этиотропную терапию следует проводить ампиоксом в дозе 200 - 300 мг/кг в сутки, цефтриаксоном в дозе 100 мг/кг в сутки или цефотаксимом в дозе 150 - 200 мг/кг в сутки. Цефтриаксон высоко эффективен и при менингококковой инфекции.

Антибиотикотерапия у больных менингококцемией (без менингита) проводится в течение 4 - 5 дней, при менингите - от 5 до 10 дней. Показанием для отмены антибактериальной терапии являются данные исследования ликвора (цитоз менее 0,1 г/л при содержании лимфоцитов не менее 80 %). Контрольная пункция проводится на 6 - 8 день лечения. При менингоэнцефалите, вентрикулите, позднем поступлении следует учитывать выраженность неврологической симптоматики и по показаниям продлевать курс лечения до 10 - 14 дней.

При отсутствии заметного клинического эффекта в течение трех суток лечения необходимо исследование ликвора для решения вопроса о смене антибактериального препарата. Исследование с этой целью ликвора в более ранние сроки нецелесообразно, так как возможно ухудшение его состава по сравнению с исходным. При позднем поступлении больных, энцефалите, вентрикулите дозу пенициллина следует повышать до 400 - 1 млн. ед./кг массы в сутки, при вентрикулитах рекомендуется сочетать внутримышечное введение препарата и внутривенное введение препарата. Для борьбы с токсикозом необходимо обеспечить достаточное количество жидкости с учетом электролитного баланса (обильное питье, внутривенное введение полиионных растворов, кровезаменителей, сывороточного альбумина, плазмы). При неосложненных формах болезни инфузионная терапия проводится в течение 1 - 3 суток. Одновременно проводится дегидратация (лазикс, фуросемид, диакарб и др.). По показаниям назначаются сердечные, анальгетики, седативные, противосудорожные средства.

Для улучшения микроциркуляции в остром периоде менингококковой инфекции может быть использован трентал. Трентал вводят внутривенно капельно в первые сутки - 100 - 200 мг. (1 ампула - 100 мг), разведенных в 250 - 500 мл физиологического раствора, 5 % глюкозы или другого кровозамещающего раствора в течение 90 - 180 мин. При хорошей переносимости доза увеличивается в зависимости от тяжести течения до 300 - 400 мг/сутки. Инфузионную терапию проводят в среднем при тяжелом течении - 5 суток, затем переходят на пероральный прием в суточной дозе 400 - 600 мг до ликвидации всех остаточных клинических и лабораторных признаков артериальных и артериовенозных нарушений кровообращения.

Лечение менингококковой инфекции, осложненной инфекционно-токсическим шоком, представлена в таблице 3, отеком мозга - в таблице 4. В ряде случаев эффективна краниоцеребральная гипотермия, эндолюмбальное введение физиологического раствора.

Таблица 3

Лечение инфекционно-токсического шока

Таблица 4

Лечение отека-набухания мозга

 

Для профилактики пневмоний, кроме удаления секрета из дыхательных путей, необходимо интратрахеальное введение бронхолитиков, ферментных препаратов, массаж грудной клетки, горчичники.

При церебральной гипотензии наряду с регидратацией показано эндолюмбальное или интравентрикулярное (у детей до года) введение подогретого до 37 °C физраствора в количестве 3 - 20 мл в зависимости от возраста.

Для лечения судорожного синдрома применяют фенобарбитал, литическую смесь 3 - 4 раза в сутки, оксибутират натрия до 100 - 150 мг/кг массы в сутки, седуксен до 50 - 100 мг/кг в сутки взрослым и 10 - 30 мг/кг - детям. Эффективно применение фенобарбитала из расчета 0,001 на кг массы детям, взрослым по 0,1 на прием 2 - 4 раза в сутки. При отсутствии эффекта - тиопентал, гексенал в дозе до 10 мг/кг.

При гипертермии применяют физические методы охлаждения (обнажение больного, пузыри со льдом на голову и магистральные сосуды, обдувание при помощи настольного вентилятора, протирание кожных покровов ментоловым спиртом), введение антипиретиков.

При острой почечной недостаточности необходим переход на минимальный водный режим, снижение дозировок медикаментов, выводимых почками, коррекция метаболических нарушений, ограничение калия, назначение препаратов кальция. Для профилактики ОПН показано применение маннитола, лазикса: при развитии олигоанурии - глюкозо-новокаиновой смеси, но-шпа, эуфиллина. Отсутствие эффекта от консервативной терапии в течение 2 - 3 суток является показанием для экстракорпорального гемодиализа, т.к. вследствие тяжелой токсинемии смерть наступает на 4 - 5 дни олигоанурии при относительно невысоком уровне гиперкалиемии и азотемии.

Бесспорно значение хорошего ухода, правильного санитарно-гигиенического режима, полноценного питания, богатого витаминами. При глубоких расстройствах сознания, парезах глотательной мускулатуры необходимо парентеральное и зондовое питание в составе питательной смеси, содержащей 1/2 общей калорийности - 6280 кДж - 7540 кДж (126 - 167 кДж на кг массы тела), в том числе белка 50 - 60 г, жира - 100 г, углеводов - 350 - 400 г, объем смеси - 1,5 л.

Использование любой смеси должно проводиться в 5 - 6 приемов в теплом виде. После восстановления сознания и функций глоточной мускулатуры больные переводятся на пероральное питание.

С целью профилактики трофических расстройств целесообразно использование противопролежневых матрасов.

Течение и прогноз

Введение в клиническую практику пенициллина, а позднее и других антибиотиков резко изменило течение и прогноз болезни. При рациональном лечении состояние, как правило, значительно улучшается в течение первых двух суток. Худшие результаты наблюдаются при позднем начале лечения. Регресс клинических симптомов болезни и санация ликвора при менингите, вызванном менингококком серогруппы B, происходит медленнее.

При назначении антибиотиков в недостаточной дозе, при ранней их отмене или снижении дозы в процессе лечения, когда в ликворных путях сохраняется возбудитель, возможны обострения болезни. Они обычно протекают с повышением температуры, ухудшением общего состояния. Менингеальная симптоматика, как правило, выражена слабо. При люмбальной пункции получают опалесцирующий, реже - мутный ликвор со смешанным лимфоцитарно-нейтрофильным плеоцитозом и увеличением содержания белка. Для лечения обострения необходимо увеличить дозу пенициллина или назначить другой антибактериальный препарат.

Остаточные явления при менингите встречаются чаще и бывают более выражены у лиц, лечение которых было начато в поздние сроки болезни. Наиболее частым является астенический синдром. Больные жалуются на повышенную утомляемость, частую головную боль. Продуктивная деятельность снижается за счет неустойчивого внимания и неспособности к длительному напряжению. Взрослые и дети старшего возраста раздражительны, младшие - капризны и плаксивы.

Другие осложнения при правильном лечении встречаются редко. У 3 % больных менингитом отмечается глухота, приводящая у детей раннего возраста к глухонемоте. В исключительно редких случаях, протекающих с энцефалитом, могут наблюдаться стойкие параличи и парезы. Развитие гидроцефалии в настоящее время, как правило, наблюдается при поздно начатом и нерациональном лечении (заниженные дозы, перерывы в лечении и пр.).

Все больные, перенесшие менингит, должны находиться под наблюдением районного невропатолога и участкового врача не менее 2-х лет. При благоприятном исходе болезни обследование проводится в течение первого года один раз в 3 месяца, в течение второго года - 1 раз в 6 месяцев. При наличии остаточных явлений назначается соответствующее лечение.

Приложение

Показатели КЩС: рН - 7,35 - 7,45; рСО₂ артерии - 35 - 45 мм рт. ст.; рСО₂ вены - 46 - 48 мм рт. ст.; BE - ± 2,3 ммоль/л; р_аО₂ - 85 - 100 мм рт. ст.

Для приблизительного расчета необходимого количества бикарбоната натрия при лечении метаболического ацидоза пользуются следующими формулами:

 

 

	ЦВД новорожденных	- 40 - 45,
	до 3-х лет	- 45 - 55,
	старше 3-х лет	- 60 - 65 мм водн. ст.

 

Величина гематокрита в зависимости от возраста

 

	Взрослые:	мужчины	42 - 48
		женщины	40 - 45

 

Физиологические потребности в жидкости

 

Выделение воды осуществляется путем мочеотделения (1300 - 1500 мл), с фекалиями (около 100 мл), перспирационным путем - испарением с поверхности тела (около 500 мл), через дыхательные пути (около 500 мл). При гипертермии с повышенным отделением пота потери воды составляют 400 - 500 мл на 1° сверх 37 °C. При лихорадочных состояниях организм может терять до 3 - 8 л жидкости в сутки.

Лица, повторно болеющие ГФМИ (менингит, менингококцемия) с высокой вероятностью имеют наследственную патологию - дефицит терминальных компонентов комплемента.

Больные с подобной патологией обладают повышенной (в 1000 раз) чувствительностью к менингококковой инфекции по сравнению с лицами с нормальной системой комплемента. Поэтому сыворотка крови больных, перенесших повторные заболевания менингококковой инфекцией и не имеющих черепно-мозговой травмы или назальной ликвореи, а также сыворотки крови их родных братьев и сестер следует, по возможности, исследовать с помощью гемолитического теста на общую активность комплемента. Если исследовать комплемент на месте невозможно, сыворотки таких больных следует пересылать в ЦНИИЭ МЗ РФ.

Аналогичному исследованию рекомендуется подвергать и больных менингококковой инфекцией, в семьях которых уже регистрировались ранее не связанные между собой эпизоды менингококковой инфекции.

Полное отсутствие гемолитической активности комплемента является прямым указанием на дефицит одного из терминальных компонентов комплемента.

Информация о подобных больных с указанием их почтового адреса пересылается в лабораторию менингококковой инфекции ЦНИИЭ МЗ РФ (111123, г. Москва, Новогиреевская ул., д. 3-а), где они при необходимости будут подвергнуты дальнейшему обследованию и профилактической вакцинации.

 

Руководитель Департамента организации медицинской помощи населению	А.И. Вялков
Начальник Управления охраны здоровья матери и ребенка	Д.И. Зелинская

 

Приложение 3
к приказу Минздрава РФ
от 23 декабря 1998 г. № 375

Методические указания по микробиологической диагностике менингококковой инфекции и бактериальных менингитов

1. Показания к лабораторному исследованию

Лабораторная диагностика менингококковой инфекции и гнойных менингитов осуществляется бактериологическим методом путем выделения и идентификации возбудителя, серологическим путем выявления специфических антигенов в жидкостях организма (ликвор, кровь, синусоидальная жидкость и др.) или антител в сыворотке крови (Приложение 5). Лабораторное обследование проводят с диагностической целью и по эпидемиологическим показаниям. С диагностической целью обследуют больных с клинически выраженной формой заболевания, стертой формой (назофарингит) и с подозрением на менингококковую инфекцию и менингиты иной этиологии.

По эпидемиологическим показаниям обследуют лиц, бывших в контакте с больными менингококковой инфекцией.

2. Микробиологическая диагностика менингококковой инфекции и других гнойных бактериальных менингитов

В связи с тем, что наряду с менингококками, наиболее частыми этиологическими факторами гнойных бактериальных менингитов (ГБМ) могут быть пневмококки, а у детей младшего возраста H.influencae и др. возбудители, представляется целесообразным изложение основных дифференциально-диагностических признаков и методов выделения этих микроорганизмов. По классификационной систематике бактерий Bergey (1 том, 1984 г.), менингококки принадлежат к семейству Neisseriaceae роду Neisseria. Род нейссерий включает два вида патогенных микроорганизмов: N.meningitidis и N.gonorrhoeae, остальные представители этого рода являются резидентной флорой слизистых оболочек. К последним относятся пигментообразующие, объединенные в один вид N.subflava, а также N.sicca, N.mucosa, N.flavescens, N.lactamica. Катаральный диплококк выделен в род Branhamella, включающий: B.catarrhalis, B.caviae, B.ovis и B.cuniculi.

Менингококки требовательны к условиям культивирования. При росте требуют повышенной влажности и 5 - 10 % содержания СО₂ в воздухе, чувствительны к малейшим отклонениям температуры. В качестве источника нативного белка рекомендуется применять сыворотку крупного рогатого скота, лошадиную или кровь любого другого животного. Основой для приготовления сред могут служить бульоны на основе гидролизата мяса по Хоттингеру, эритрит-агар, агар АГВ, сухой питательный агар специального назначения, выпускаемый Дагестанским институтом питательных сред или "Аминопептид для микробиологических питательных сред" (жидкий, производства Ставропольского мясоконсервного комбината, ТУ-92-14/356-80). Сухие питательные агары, а также сыворотка крови должны быть обязательно проверены на пригодность для культивирования менингококка. Проверку производить со свежевыделенной культурой или эталонным штаммом менингококка, хранившемся в высушенном состоянии.

Идентификация вида N.meningitidis основана на комплексе морфологических, тинкториальных, культуральных и биохимических признаков (табл. 1).

Таблица 1

Культуральные и биохимические свойства нейссерий и Br.catarrhalis

 

	Обозначения:	К	- образование кислоты
		(-)	- редко
		**	- тест используют как дополнительный при дифференциации непатогенных нейссерий.

Примечание: приготовление некоторых питательных сред, приготовление реактивов для исследования редукции нитратов и нитритов, постановка этих реакций и учет см. приказ МЗ СССР № 535 от 22 апреля 1985 г. "Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений".

При первом выделении клеткам менингококков свойственен полиморфизм, который проявляется в различной величине и разной интенсивности окрашивания микробных клеток. Колонии менингококков на сывороточном агаре бесцветны, круглые с ровным краем, опалесцирующие, выпуклые, имеют маслянистую консистенцию, легко снимаются петлей со среды, что отличает их от колоний непатогенных нейссерий, имеющих крошащуюся или тянущуюся консистенцию. Некоторые штаммы, выделенные из СМЖ, могут обладать слабой ферментативной активностью в отношении глюкозы или мальтозы или обоих углеводов. Большинство непатогенных видов нейссерий, в отличие от патогенных, способны при выращивании на сывороточном arape с 5 % сахарозы образовывать крахмалоподобное вещество (полисахарид), выявляемое с помощью водного раствора Люголя, в виде появления бурого окрашивания культуры.

Менингококки делятся на следующие серогруппы: A, B, C, X, Y, Z, 29E, D, W135, К, H, L, У. Проведение серологического группирования менингококков является обязательным для практических лабораторий, как одна из мер эпидемиологического надзора за менингококковой инфекцией.

Наличие ферментов оксидазы и каталазы присуще всем нейссериям и B.catarrhalis в отличие от гемофилов и пневмококков, что может служить дифференцирующим признаком при их идентификации в сочетании с другими (табл. 2).

Таблица 2

Свойства основных возбудителей менингитов, учитываемые через 24 часа от начала бактериологического исследования

Примечание: ^* В каплю 3 % раствора КОН вносят петлю (колонию) культуры, эмульгируют. Образование в капле студенистой массы, тянущейся за петлей указывает на наличие грамотрицательной флоры (-), крошащуюся консистенцию образует грамположительная флора (+).

^** Постановка реакции на оксидазу, каталазу, уреазу (см. приказ МЗ СССР № 535 от 22.04.85).

Заболевания, где этиологическим агентом являются гемофилы, характеризуются воздушно-капельным механизмом передачи, что обеспечивает им широкое распространение. Из всех представителей этого рода наибольшей патогенностью обладают H.influenzae, впервые описанные Пфейффером в 1892 г. Этот возбудитель имеет несколько специфических серотипов (a, b, c, d, e, f), из которых тип "b" (Hib) является наиболее частым агентом тяжелых генерализованных форм заболеваний, особенно у детей до 5 лет. ГБМ у взрослых могут быть обусловлены другими серологическими типами.

Пневмококки и гемофилы, как и менингококки, являются высокотребовательными к культивированию микроорганизмами. В качестве фактора, способствующего их росту, используют кровь различного происхождения. Поэтому универсальной средой для всех возбудителей может служить "шоколадный" агар.

Для проведения бактериологической диагностики гнойных бактериальных менингитов необходимо обеспечить забор материала от больных в полном объеме с соблюдением: сроков забора, доставки патологического материала и условий транспортировки.

В бактериологическую лабораторию доставляется материал в следующем объеме:

1. Ликвор для первичного посева, бактериоскопии и серологических исследований в количестве не менее 1,0 мл.

2. Ликвор в 0,1 % полужидком агаре (среда "обогащения") для бактериологического накопления культуры. 0,5 мл ликвора засевается в 5,0 мл полужидкого агара немедленно у постели больного.

3. "Толстая капля" крови для бактериоскопии.

4. Кровь в жидкой питательной среде (10.4.4) или в 0,1 % полужидком агаре (среда обогащения) для бактериологического накопления культуры. 5,0 мл крови засевают в 50,0 мл среды обогащения.

5. Кровь в количестве не менее 2-х мл для серологических исследований (РПГА, ВИЭФ, ЛА и др.).

Материал для бактериологических и серологических исследований доставляется в бактериологическую лабораторию немедленно после забора в теплом виде (t = 37 °C) в специально оборудованных контейнерах.

При невозможности немедленной доставки допускается хранение патологического материала в условиях термостата при 37 °C в течение 18 часов.

3. Бактериологическое исследование спинномозговой жидкости больного

3.1. 1-й день исследования. Спинномозговую жидкость (СМЖ) в количестве 2 - 5 мл берут у больного сразу же при поступлении в стационар (желательно до начала антибактериальной терапии) с соблюдением всех правил асептики. Взятие ликвора проводится персоналом в масках.

Первую порцию СМЖ (около 1,0 мл) берут в отдельную пробирку для проведения общего ликворологического исследования. Вторую порцию, предназначенную для бактериологического исследования, наливают в стерильную пробирку (не менее 1,0 мл) и частично засевают в 0,1 % полужидкий агар (0,5 мл СМЖ добавляют в 5 мл 0,1 % полужидкого агара). Касаться руками краев канюли, иглы и краев пробирок нельзя. Ватно-марлевую пробку полагается держать на весу за ее наружную часть.

СМЖ исследуют немедленно при доставке в лабораторию. Стерильной пастеровской пипеткой со дна пробирки берут 0,3 - 0,5 мл материала и по 2 - 3 капли засевают на поверхность 2-х чашек Петри с подогретой питательной средой, растирая шпателем. Одна чашка содержит "шоколадный" агар, вторая - сывороточный. Посевы ставят в термостат при 37 °C и создают условия повышенного содержания СО₂ в атмосфере термостата. Пробирка с ликвором в полужидком агаре инкубируется в термостате.

Нативная спинномозговая жидкость, оставшаяся в пробирке, исследуется в серологических реакциях и используется для приготовления мазков¹.

Отношение к окраске по Граму у нейссерий выражено недостаточно четко, поэтому они окрашиваются метиленовым синим или по Граму в модификации Калины. Прямая микроскопия окрашенных мазков спинномозговой жидкости в известной части случаев позволяет установить наличие бактерий, вызывающих гнойный менингит. Морфология менингококков описана выше. H.influenzae видна в виде мелких полиморфных грамотрицательных палочек и нитей, окруженных еле заметной нежной капсулой.

Пневмококки имеют вид ланцетовидных диплококков и коротких цепочек, образуют капсулу. Они грамположительны, хорошо красятся всеми анилиновыми красителями, при этом капсула остается неокрашенной и заметна только на окрашенном фоне². Результаты бактериоскопии немедленно сообщают лечащему врачу в виде предварительного ответа. При достаточном количестве исследуемого материала рекомендуется 2 - 3 капли засеять в чашку с питательной средой для определения чувствительности к антибиотикам.

_______________

¹ Группоспецифические сыворотки производит Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт вакцин и сывороток.

² Описание морфологии колоний и морфологии культуры других бактерий см. в соответствующих методических рекомендациях.

3.2. 2-й день исследования. Независимо от результатов бактериоскопии ликвора просматривают засеянные чашки. Просмотр чашек ведут визуально и с помощью бинокулярного стереоскопического микроскопа, лупы МБС. Во внимание принимают все колонии. Чашки с отсутствием роста инкубируют одни сутки. Готовят препараты-мазки, окрашивают, ставят реакцию с 3 % раствором КОН и биохимические тесты - на оксидазу, каталазу, уреазу. Гемофилам присущ резкий специфический запах, исходящий от посевов.

Морфология менингококковых колоний на сывороточном агаре описана во всех руководствах по микробиологии. На "шоколадном" arape колонии нежные, сероватого цвета, с блестящей поверхностью и ровными краями, имеют маслянистую консистенцию, размерами от 0,1 до 3,0 мм. Менингококки не меняют цвета среды. На основании микроскопии мазков из колоний и результатов первичных биологических тестов возможна выдача предварительного ответа. Если в мазках обнаружены грамотрицательные кокки, это дает право отнести их к роду нейссерий и провести дифференциацию видов.

Гемофилы на "шоколадном" агаре дают довольно обильный рост. Колонии серого цвета, плоские диаметром 0,2 - 2,0 мм легко снимаются со среды. В мазках, окрашенных по Граму, видны мелкие короткие грамотрицательные палочки с капсулой разной степени выраженности, а также нити разной длины и короткие цепочки. На сывороточном arape H.influenzae не растет³. Крупные 3 - 5 мм колонии, содержащие грамотрицательные палочки, подозрительны на энтеробактерии. Candida и P.aeruginosa растут обильно на всех средах, не изменяя цвета "шоколадного" агара.

Колонии пневмококков на обеих средах - мелкие (диаметром 0,1 - 1,0 мм), иногда плоские, с вдавлением в центре. На "шоколадном" агаре они окружены зоной желто-зеленого гемолиза (тип альфагемолиза). По внешнему виду колонии пневмококков на обеих средах трудно отличить от колоний стрептококков группы B, зеленящих стрептококков, энтерококков (S.feacalis), которые в редких случаях могут вызвать менингит, особенно у детей 1 года.

В мазках из колоний пневмококки имеют овальную или шаровидную форму, располагаются парами или в виде коротких цепочек из 2 - 3 пар. Если имеется обильный рост одинаковых колоний, то допустим одномоментный отсев на дифференциально-диагностические среды, изучение культуры по ряду признаков и антибиотикочувствительности (табл. 1, 2). Определение чувствительности энтеробактерий и стафилококков проводят на среде АГВ. Эта среда служит основой для определения чувствительности к антибиотикам менингококков при добавлении 20 % сыворотки. H.influenzae и пневмококков - при добавлении соответствующего количества крови. Приготовление питательных сред и постановка теста на антибиотикочувствительность производится в соответствии с действующими указаниями⁴.

В таблице 2 суммировано минимальное число признаков, достаточное для того, чтобы выделенные из СМЖ бактерии предположительно отнести к тому или иному таксону (от семейства до вида) и избрать дальнейший путь идентификации. На этом этапе возможна выдача окончательного ответа, при положительной реакции со специфическими антисыворотками для H.inftuenzae, N.meningitidis и Str.pneumoniae.

Колонии, подозрительные на менингококки, отсевают на скошенный сывороточный агар или сектор чашки и инкубируют при 37 °C.

Колонии, подозрительные на пневмококки, стрептококки и др. отсевают на 2 сектора кровяного агара (с 5 % крови) для последующего определения чувствительности к желчи и постановки тестов на лекарственную чувствительность.

Если число выросших колоний мало (1 - 2), то их отсевают на чашку с сывороточным или "шоколадным" агаром для накопления микробной массы, а идентификацию микроба проводят еще через одни сутки.

При менингитах новорожденных и детей раннего возраста, а также изредка и в других возрастных группах, помимо трех перечисленных видов микроорганизмов этиологическими факторами могут быть энтеробактерии (E.coli, S.marcescens, K.pneumoniae, Salmonella, Citrobacter, Enterobacter), синегнойная палочка (P.aeruginosa), Acinetobacter calcoaceticum, Listeria monocytogenes, различные стрептококки - гемолитические группы B, "зеленящие" и энтерококки, а также стафилококки (золотистый и эпидермальный) и грибы рода Candida.

При подозрении на энтеробактерии⁵, синегнойную палочку⁶, стафилококк⁷ и Ac.calcoaceticum проводят исследования в соответствии с имеющимися методическими материалами⁸.

При подозрении на листерии в этот день, если число колоний позволяет, ставят ряд проб, а также тест на чувствительность к антибиотикам. Для L.monocytogenes помимо признаков, указанных в табл. 2 характерно: подвижность при комнатной температуре, разложение мальтозы, глюкозы, инактивность по отношению к дульциту, манниту, сорбиту и арабинозе. Сахароза и глицерин разлагаются медленно. L.monocytogenes образует краевую зону гемолиза на агаре с 5 % бараньей крови, разлитом слоем 3 мм.

Для идентификации Candida albicans делают посев из подозрительных белых выпуклых колоний, состоящих из дрожжевых клеток, на среду Сабуро или мясо-пептонный агар, содержащий по 100 Me/мл пенициллина и стрептомицина.

Если прямой посев на чашки с питательной средой не дал роста колоний, то делается высев на чашки с сывороточным, "шоколадным" агаром из инкубированной в термостате смеси ликвора с полужидким агаром (среда "обогащения").

При отрицательных результатах высев со среды "обогащения" повторяют через 1 - 2 дня в течение 5 дней инкубации в термостате.

При получении роста колоний исследование их проводят тем же путем, что и при прямом посеве спинномозговой жидкости.

_______________

³ Подробная идентификация микробов рода H.influenzae изложена в Методических рекомендациях "Современные методические подходы к микробиологической диагностике гемофильной инфекции". Утверждены МЗ России, Санкт-Петербург, 1992 г.

⁴ "Методические указания по определению чувствительности микроорганизмов к антибиотикам методом диффузии в агаре с использованием дисков". Утверждены МЗ СССР в 1983 г. № 2675-83.

⁵ Методические указания по микробиологической диагностике заболеваний, вызванных энтеробактериями", утвержденные МЗ СССР, 1984 г.

⁶ Методические рекомендации "Обнаружение и идентификация синегнойной палочки в объектах окружающей среды", утвержденные МЗ СССР, 1982 г.

⁷ Инструкция по бактериологическому обследованию на выявление носителей патогенного стафилококка и проведение санации. Приложение к приказу МЗ СССР № 720, утверждено в 1978 г.

⁸ Приказ МЗ СССР № 535 от 22 апреля 1985 г.

3.3. 3-й день исследования. Культуры, отсеянные из отдельных колоний, просматривают под МБС и ставят пробу с 3 % раствором КОН. Для оценки чистоты выросшей культуры готовят мазки и просматривают. При обнаружении морфологически типичных грамотрицательных кокков, проводят идентификацию (см. табл. 1), серогруппирование идентифицированной культуры, а также используют эту культуру для определения лекарственной устойчивости (если эти тесты не были сделаны на 2-й день).

Учитывают результаты посевов, сделанных на 2-й день исследования. На этом этапе возможна выдача окончательного положительного ответа для менингококков и др. микроорганизмов (кроме пневмококков и стрептококков).

Для дифференциации пневмококков, зеленящих и фекальных стрептококков (энтерококков) по микроскопии чистых культур на секторах кровяного агара учитывают характер гемолиза вокруг выросших колоний и ставят дополнительные пробы⁹ (см. табл. 3).

_______________

⁹ Методические рекомендации "Микробиологические методы обследования пульмонологических больных" утвержденные МЗ СССР, 1981 г.

Таблица 3

Дифференцирующие свойства стрептококков, вызывающих менингит

Примечание:

^* В группу "зеленящих" стрептококков относятся 9 видов малоизученных стрептококков.

^** Приказ МЗ СССР № 535 от 22 апреля 1985 г.

На один из двух секторов кровяного агара с ростом колоний накладывают диск из фильтровальной бумаги, пропитанной 20 % раствором желчи (на физиологическом растворе), после чего чашку помещают при 37 °C на 1 - 2 часа. По истечении этого времени вокруг диска колонии пневмококков лизируются, образуя зону отсутствия роста шириной 1 - 2 мм, в то время как рост прочих стрептококков остается интактным. При положительной пробе чувствительности к желчи, при условии типичной морфологии клеток и колоний, можно дать положительный ответ о выделении пневмококков. Рост культуры на 2-м секторе кровяного агара используют для постановки пробы на чувствительность к лекарственным препаратам (если это не было сделано ранее).

При отрицательных результатах пробы на чувствительность к желчи, рост на 2-м секторе используют не только для испытания чувствительности к химиопрепаратам, но и для постановки ряда тестов, дифференцирующих стрептококки (см. табл. 3).

В этот же день ставят пробы для идентификации других возможных возбудителей, а также тест на лекарственную чувствительность (если это не было сделано на 2-й день).

3.4. 4-й день исследования. Учитывают результаты посевов с целью дифференциации менингококков от непатогенных нейссерий и Br.catarrhalis и чувствительности к химиопрепаратам (если это не было сделано на 3-и сутки). Возможна выдача положительного ответа. Культуру менингококков, выросшую на сывороточном агаре при температуре 37 °C, можно использовать для серологической идентификации менингококков в реакции агглютинации или в реакции преципитации в arape, а также для определения лекарственной устойчивости.

Учитывают результаты проб на лекарственную чувствительность и прочие свойства у других возбудителей, выдают окончательный положительный ответ.

4. Бактериологическое исследование крови

При подозрении на менингококцемию или сепсис проводят бактериологическое исследование крови. В качестве экспресс-метода диагностики рекомендуется приготовление мазка "толстой капли" из крови, взятой из вены или пальца.

В препарате "толстой капли" менингококки имеют преимущественно такую же морфологию, как в спинномозговой жидкости, но чаще располагаются поодиночке, имеют более круглую форму. В мазке, имеющем голубой фон, хорошо видны окрашенные в темно-синий цвет лейкоциты и между ними множество мелких, темно-синих, располагающихся кучками, парно и по одному, кокков. Результаты бактериоскопии немедленно сообщают лечащему врачу в виде предварительного ответа.

Кровь, взятую стерильно из вены, засевают на 0,1 % полужидкий агар или жидкую питательную среду в отношении 1:10, т.е. 1 - 2 мл крови можно посеять в пробирку с 7 - 10 мл полужидкого агара или 5 - 10 мл крови засеять во флакон с 50 мл среды (10.4.4). После суточной инкубации материал высевают на сывороточный агар и "шоколадный" в чашки Петри. При наличии роста готовят препараты для микроскопии. При отрицательном результате рекомендуется инкубация в течение недели с высевами через день. Выделение и идентификацию гемокультур проводят также, как при исследовании спинномозговой жидкости.

5. Бактериологическое исследование экссудата из петехий

При менингококцемии иногда удается обнаружить менингококки непосредственно в экссудате кожных петехий.

Для этого вначале обтирают кожу вокруг петехий 70 % спиртом. В случае образования некроза в центре петехии экссудат можно взять прокаленной и остуженной бактериологической петлей из некротизированных участков. При неповрежденной коже экссудат берут стерильной тонкой иглой, соединенной со шприцем, в котором имеется 0,1 - 0,2 мл физиологического раствора. Физиологический раствор вводят в толщу петехии и отсасывают обратно.

Посев экссудата производят в чашки Петри с сывороточным агаром, содержащим антибиотики ристомицин или линкомицин (п.п. 10.1, 10.2) для подавления кожной флоры. Из остатка экссудата готовят препараты-мазки. Мазки из содержимого петехий можно приготовить в виде отпечатков. Для этого стерильной петлей осторожно скарифицируют поверхность петехий, затем прикладывают несколькими местами предметное стекло (стерильное), фиксируют пламенем горелки, окрашивают. На основании данных микроскопии возможна выдача предварительного ответа.

Засеянные чашки инкубируют при 37 °C 24 часа (в случае отсутствия роста 48 часов); подозрительные на менингококки колонии отсевают и изучают по описанной схеме (п. 3).

6. Бактериологическое исследование носоглоточной слизи на менингококк

1-й день исследования. Исследуемый материал - слизь с задней стенки глотки - берут натощак или через 3 - 4 часа после еды стерильным ватным тампоном, укрепленным на изогнутой проволоке. Материал берут с обязательным надавливанием шпателем на корень языка. Тампон вводят концом кверху за мягкое небо в носоглотку и проводят 2 - 3 раза по задней стенке. При извлечении тампон не должен касаться зубов, слизистой щек, языка и язычка.

Материал может быть засеян на месте его взятия на чашку Петри с питательной средой, или средой обогащения¹⁰, или взят смоченным тампоном, который затем доставляют в лабораторию (п. 10.6). При посеве на чашку материал втирают на поверхности небольшого участка (1 × 2 см) среды всеми сторонами тампона, затем этим же тампоном засевают штрихами (с отрывом) по всей площади, отведенной для посева.

Используют сывороточный агар с добавлением в него антибиотиков, подавляющих рост грамположительных кокков. Для этой цели применяется ристомицин или линкомицин в оптимальной концентрации (п.п. 10.2, 10.3). На одну чашку можно засеять две пробы. Однако встречаются отдельные штаммы менингококков, более чувствительные к линкомицину, поэтому те же пробы одновременно засевают на половину чашки с сывороточным агаром без линкомицина.

При отсутствии линкомицина или ристомицина можно использовать диски с этими антибиотиками. Диски (не более 2-х) накладывают непосредственно на поверхность засеянного сывороточного агара. В этом случае на 1 чашку сеют только одну пробу. Через одни сутки вокруг диска, в зоне 1 см, рост грамположительной флоры будет подавлен, что увеличивает возможность выделения колоний нейссерий.

Засеянные чашки доставляют в лабораторию, тщательно защищая их от охлаждения, в зимнее время применяя грелки (35 - 40 °C) и немедленно помещают в термостат при температуре 37 °C.

Тампоны с исследуемым материалом, погруженные в полужидкую или транспортную среду, доставляют в лабораторию, также тщательно защищенными от охлаждения. Тампоны в 0,1 % полужидком агаре (обогащения) помещают в термостат для подращивания флоры. Смоченные тампоны или тампоны в транспортной бульонной среде засевают на чашку с сывороточным агаром, лишенным ингибитора, без предварительного подращивания. Посев делают отжатым тампоном, как описано выше. Засеянные чашки помещают в термостат.

При транспортировке материала на короткие расстояния (1 - 2 часа езды до лаборатории) применение транспортных сред не рекомендуется. При транспортировке в течение 2 - 4 часов уместно применение тампонов, смоченных питательной средой. При транспортировке в течение 3-х часов и более тампоны перевозят погруженными в транспортную среду.

Полужидкая среда обогащения может использоваться независимо от сроков транспортировки.

2-й день исследования. Просматривают чашки, засеянные накануне, визуально и под лупой - микроскопом МБС, подозрительные колонии отсевают на секторы чашки с сывороточным агаром (не менее 3 - 5 колоний). Внешний вид колоний менингококков описан выше. На средах с ингибиторами вырастают только грамотрицательные бактерии, преимущественно представители нейссерий. При отсутствии роста в чашках с антибиотиками проводят повторный просмотр их через 40 - 48 часов после посева. В эти же сутки делают высев из полужидкой (0,1 %) среды обогащения на чашку с сывороточным агаром без ингибитора.

3-й день исследования. Изучают рост чистых культур, отсеянных из отдельных колоний в предыдущий день. Культуры, колонии которых имеют желтый пигмент различной интенсивности, а также характеризующиеся "сухим" ростом, отбрасывают. Следует иметь в виду, что на сывороточном агаре колонии менингококков могут выглядеть желтоватыми из-за оттенка среды. Поэтому для обнаружения пигмента их необходимо просматривать при дневном освещении.

Для дальнейшего исследования на менингококки оставляют только непигментированные культуры, дающие нежный влажный рост. Из них готовят мазки, проводят микроскопию чистой культуры. В первых генерациях для менингококков характерны полиморфизм и вариабельность окраски, что не наблюдается у непатогенных нейссерий. После микроскопии дальнейшую идентификацию культур проводят по выше описанным тестам (п. 3.1, 3.2)

Если рост культуры из отсеянных колоний достаточно обильный, то в эти сутки ставят реакцию агглютинации с группоспецифическими сыворотками (п. 2).

4-й день исследования. Просматривают посевы, сделанные в предыдущий день. Учитывают результаты роста на бессывороточном и желчном агаре (при температуре 37 °C), сахаролитическую активность, ставят реакцию с водным раствором Люголя на продукцию полисахарида, проводят окончательную серологическую идентификацию менингококков по реакции агглютинации.

В этот же день выдают окончательный положительный или отрицательный ответ. Результаты бактериологического исследования с полужидкой среды, соответственно, будут получены на сутки позднее.

_______________

¹⁰ Материал можно исследовать в соответствии с методическими рекомендациями "Выделение менингококка от больных и бактерионосителей" (Оренбург, 1984 г.) № 3083, утвержденными МЗ СССР 15.08.84. Для этого тампон погружают в среду Игла или среду 199, без антибиотиков.

7. Исследование трупного материала

Патологоанатомическое вскрытие желательно проводить в наиболее ранние сроки после смерти. Для бактериологического исследования направляют кровь, ликвор, кусочки головного мозга (или гной, взятый тампоном с мягкой мозговой оболочки, в случаях менингококцемии - из печени, селезенки, легкого, надпочечников и т.д.). Кровь берут стерильно из правого сердца, после вскрытия скальпелем, с помощью стерильной пипетки с грушей в количестве 7 - 10 мл. Из них 2 - 3 мл засевают в 25 мл 0,1 % полужидкого агара, а оставшиеся - 5 - 7 мл используют для других исследований (серологических, в ВИЭФ и т.д.). Для посевов можно использовать, также сгустки крови из крупных сосудов.

Ликвор берут стерильной пипеткой из околооболочечного пространства (во время извлечения головного мозга из полости черепа), в стерильную пробирку в количестве 3 - 5 мл и немедленно высевают на чашки с питательными средами. В количестве 0,1 мл исследуемый материал наносят в центр чашки и распределяют по ее поверхности покачиванием, растирать шпателем не рекомендуется. Бактериологическое исследование ликвора и крови проводят в соответствии с п.п. 3.1 и 3.2. Надо иметь в виду, что рост на чашках может быть смешанным из-за попадания непатогенной микрофлоры, поэтому к общепринятому набору питательных сред следует добавить чашку сывороточного агара с антибиотиком (ристомицин, линкомицин) (п.п. 10.2, 10.3).

Гной с мозговых оболочек берут стерильным ватным тампоном и засевают газоном или штрихами на чашки с шоколадным сывороточным агаром и в пробирку со средой обогащения, делают 2 мазка на предметных стеклах, один из которых красят метиленовым синим, другой - по Граму.

Для взятия материала из мозга и других органов к месту разреза прикасаются раскаленным шпателем, материал берут из глубины разреза стерильным ватным тампоном. Посев производят обычным способом на те же плотные и жидкие питательные среды. Выросшие культуры дифференцируют в соответствии с п.п. 3.1 и 3.4.

Помимо посевов из мозга, целесообразно проводить изучение мазков отпечатков с поверхности мягких мозговых оболочек. После подсушивания и фиксации над пламенем горелки (при длительном хранении - в ацетоне) мазки окрашивают и просматривают.

8. Сохранение и транспортировка выделенных культур

Идентифицированные культуры уничтожают или передают по требованию в специализированные НИИ или опорные базы.

N.meningitidis, Str.pneumonie быстро гибнут во внешней среде. Их можно сохранить в течение 5 - 6 недель методом посева на столбики из оптимальных для каждого микроорганизма питательных сред: для N.meningitidis - сывороточный агар, для Str.pneumonien - кровяной агар. Культуру засевают уколом в столбики и ставят в термостат при температуре 37 °C. Через 24 часа при появлении роста культуры по ходу укола и в виде бляшки на поверхности среды в пробирку наливают 1,5 - 2 мл стерильного вазелинового масла и в таком виде хранят, транспортируют, не допуская охлаждения. Засеянный материал из одной пробирки можно использовать многократно для пересева. Для сохранения культуры пневмококков ее засевают на скошенный кровяной агар, без инкубации при 37 °C, и держат в течение 4 - 6 дней при температуре от +4 °C до +22 °C. Для получения свежей культуры с поверхности засеянного агара делают соскоб и пересевают на свежую среду такого же состава, ставят в термостат на сутки при температуре 37 °C.

Группоспецифическая активность менингококков сохраняется в течение 2-х недель, а пневмококков - 1 неделю.

H.influenzae также быстро гибнет. Жизнеспособность гемофилов можно продлить до 1 месяца, для чего делают обильный посев на скошенный "шоколадный" агар и после суточной инкубации создают полную герметизацию. Такую культуру для пересева используют только однократно. Дегерметизация приводит к гибели субкультуры.

9. Сроки выдачи ответов и их формулировка

9.1. При бактериологическом обследовании ликвора и крови сроки выдачи и формулировка ответов таковы:

на 1-й день на основании прямой бактериоскопии ликвора и толстой капли крови дают предварительный ответ, в зависимости от результата формируется в трех вариантах:

а) при наличии в мазках большого числа морфологически типичных бактерий пишут: "В спинномозговой жидкости (крови) при прямой бактериоскопии обнаружены грамотрицательные кокки (или грамположительные палочки), сходные по морфологии с менингококками, или пневмококками, или H.influenzae. Исследование продолжается.";

б) при наличии в мазках единичных бактерий пишут: "В спинномозговой жидкости (крови) при прямой бактериоскопии обнаружены единичные (или парные) клетки кокков (или палочек и т.д.). Исследование продолжается.";

в) при отсутствии каких-либо бактериальных клеток пишут: "В спинномозговой жидкости (крови) при прямой бактериоскопии бактерий не обнаружено.".

На основании результатов серологических реакций (ВИЭФ, ЛА и др.) ликвора дают ответ, который в зависимости от результатов формулируют следующим образом:

а) при выявлении специфического антигена пишут: "В спинномозговой жидкости выявлен специфический антиген (менингококковый, пневмококковый и H.influenzae тип "B" и др.).";

б) при отрицательном результате пишут: "В спинномозговой жидкости специфические антигены не выявлены.";

на 2-й день выдают ответ также предварительного характера, который в зависимости от результатов бактериологического исследования формулируют следующим образом:

а) при росте бактерий, типичных по морфологическим и культуральным свойствам для нейссерий и других родов, пишут: "При прямом посеве спинномозговой жидкости (крови) получен рост нейссерий (или стафилококков, стрептококков, грамотрицательных палочек и др.). Изучение культуры продолжается.";

б) при наличии четко выраженной реакции агглютинации выросшей культуры с одной из специфических сывороток (табл. 2) и положительной бактериоскопии мазка может быть дан окончательный положительный ответ: "При исследовании спинномозговой жидкости (кровь) получен рост (H.influenzae, N.meningitidis, Str.pneumoniae и др.).";

в) при отсутствии роста пишут: "При прямом посеве спинномозговой жидкости (крови) роста бактерий не обнаружено. Исследование продолжается.";

на 3-й день на основании культурально-биохимических свойств бактерий, отсеянных с чашки на 2-й день, выдают окончательный ответ: "Из спинномозговой жидкости (крови) выделена культура менингококков серогруппы A, B и т.п. (или негруппируемая)". В редчайших случаях "M.catarrhalis или непатогенные нейссерии".

В этот же день может быть дан предварительный ответ о росте (или его отсутствии) бактерий в результате высева из среды обогащения. Формулировка та же, что и при оценке результатов прямого посева с чашки. В этот же день выдают окончательный положительный ответ на пневмококки, который формулируют: "Из спинномозговой жидкости (крови) выделена культура Str.pneumoniae.";

на 4-й день может быть выдан окончательный положительный ответ о видовой принадлежности нейссерий, выросших при прямом посеве, а также других бактерий.

На этом же этапе, как и в следующие дни (вплоть до 5-го дня), может быть выдан окончательный положительный ответ, полученный в результате высева из среды обогащения. Формулировка та же (см. 3-й день).

Окончательный отрицательный ответ выдают не ранее 5-го дня, когда при последнем высеве из среды обогащения (на 5-й день ее инкубации) не обнаруживают роста бактерий. Его формулировка: "При инкубации спинномозговой жидкости (крови) на среде обогащения в течение 5 дней бактерий выделить не удалось.".

9.2. При бактериологическом исследовании отпечатков-мазков из петехий больного или кусочков ткани трупного материала дают предварительный ответ, который в зависимости от результатов формулируется в трех вариантах (п. 9.1).

При бактериологическом исследовании трупного материала, кусочков тканей, крови, жидкости из полостей и т.д. в зависимости от результатов, формулировку ответа см. п. 9.1. Окончательный отрицательный ответ выдается не ранее 5-го дня с момента посева исследуемого материала.

9.3. При бактериологическом исследовании слизи из носоглотки выдают только окончательные ответы. Сроки выдачи и формулировки следующие: на 4-й день при выделении культуры менингококка выдают положительный ответ: "В носоглоточной слизи обнаружены менингококки определенной серогруппы или негруппируемые."

В случаях добавочного отсева колоний с чашек, а также при использовании полужидкой среды обогащения сроки выдачи ответа соответственно отодвигаются на сутки. При отсутствии роста менингококков в посевах выдают отрицательный ответ: "В носоглоточной слизи менингококк не обнаружен."

10. Приготовление красок, питательных сред, описание методов

Приготовление агаровых питательных сред кровяного, шоколадного, полужидкого агара, "обогащения" ликвора (см. приказ МЗ СССР № 535 от 22 апреля 1985 г.).

10.1. Сывороточный агар.

В качестве основы используют 1,2 - 1,5 % агар /рН = 7,4/, приготовленный на бульоне из рыбного гидролизата, бульоне из перевара Хоттингера/аминный азот в бульоне 150 - 180 мг/мл/ или на сухом питательном агаре специального назначения. К 80 мл расплавленного и остуженного до температуры 50 °C агара добавляют 20 мл инактивированной при температуре 56 °C в течение 30 минут сыворотки, консервированной хлороформом, или без консерванта (при инактивировании сыворотки консервант улетучивается). После перемешивания среду разливают в чашки. Среда годна к употреблению только в течение 48 часов при хранении ее в холодильнике. Перед посевом чашки, хранившиеся в холодильнике, должны быть подсушены и подогреты до температуры 37 °C.

10.2. Сывороточный агар с ристомицином.

К 80 мл расплавленного и остуженного агара (такого же, как и для приготовления сывороточного агара) добавляют 20 мл сыворотки и 0,1 мл раствора ристомицина, содержащего 20000 ед./мл (конечная концентрация антибиотиков 20 ед./мл питательной среды).

В связи с испытываемыми трудностями в снабжении ристомицином рекомендуется простой метод, позволяющий экономно расходовать антибиотик. Препарат разводят стерильным физиологическим раствором до рабочей концентрации и затем разливают по стерильным пенициллиновым флаконам или центрифужным пробиркам под ватными или резиновыми пробками и замораживают в морозильной камере. Количество рабочего раствора во флаконах или пробирках зависит от потребности лаборатории.

Рабочий раствор сохраняют в морозильной камере до момента использования. В случае необходимости раствор оттаивают и добавляют в среду. Например, во флакон, содержащий 100 мг (100000 ед.) ристомицина, вносят 5 мл стерильного физиологического раствора. Полученное разведение препарата является рабочим. Его удобно разлить по 0,5 мл и заморозить. В таком состоянии препарат может храниться несколько месяцев.

10.3. Сывороточный агар с линкомицином.

К 80 мл расплавленного и остуженного агара добавляют 20 мл сыворотки и 0,5 мл раствора линкомицина в концентрации 1000 мкг/мл.

Конечная концентрация антибиотика в среде - 5 мкг/мл питательной среды. Раствор линкомицина можно хранить при температуре +4 °C в течение 6 месяцев.

10.4. Желчно-сывороточный агар.

5,0 мл сухой бычьей желчи¹¹ растворяют в 100,0 мл дистиллированной воды, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, доводят рН до 7,2 - 7,4, стерилизуют текучим паром 3 дня подряд. К 80 мл расплавленного и охлажденного до 50 °C питательного агара добавляют 4,0 мл стерильного раствора желчи, перемешивают, затем добавляют 20,0 мл сыворотки животных, снова хорошо перемешивают и разливают по чашкам Петри. Конечная концентрация желчи в среде - 0,2 %. Посев испытуемых культур нейссерий производят штрихами на сектора чашки.

_______________

¹¹ Желчь сухая, выпускается Московским мясокомбинатом.

10.5. Плотные среды с углеводами.

Готовят на той же питательной основе, что и предыдущие. К 75 мл агаровой основы добавляют 0,9 г одного из углеводов (глюкоза, мальтоза, сахароза, лактоза, фруктоза) и 3,9 мл раствора индикатора фенолового красного. Агар стерилизуют текучим паром 3 дня по 30 минут или однократно в течение 30 минут при 0,5 атм.

Перед употреблением среду растапливают в водяной бане, охлаждают до температуры 48 - 50°, добавляют 20 мл инактивированной нормальной сыворотки и разливают в чашки. На 1 чашку можно посеять не более 6 культур. Сектор с посевом должен быть узким, у основания не более 1 см, а расстояние между ними не менее 2 - 3 см.

Таким образом, каждую культуру засевают на 1/4 - 1/8 пяти чашек с различными углеводами. Учет результатов производят через 24 часа инкубации в термостате. При разложении какого-либо углевода с образованием кислоты красный цвет среды в секторе посева меняется на ярко-желтый.

Приготовление раствора индикатора фенолового красного (фенол-рот).

Смешивают 0,4 г порошка фенол-рот с 16 мл 0,1 N NaOH и выдерживают в термостате до полного растворения при частом встряхивании. Затем раствор доводят до объема 200 мл дистиллированной водой, разливают во флаконы и стерилизуют при 1 атм. в течение 20 минут.

10.6. Транспортные среды для выделения менингококков из носоглоточной слизи.

10.6.1. Бульон для приготовления смоченных тампонов.

Бульон готовят на любой питательной основе с добавлением 20 % сыворотки животных и ристомицина из расчета 20 ед./мл среды. Используют ватные тампоны на алюминиевых стержнях, вмонтированные в пробирку (п. 6.6). Перед выездом за материалом тампоны пропитывают бульоном из расчета 10 - 12 тампонов в 5 мл бульона, соблюдая стерильность. Тампоны к месту взятия материала и обратно в лабораторию доставляют, предохраняя их от холода. Длительность транспортировки материала с момента взятия до посева в питательную среду не должна превышать 3-х часов.

10.6.2. Приготовление жидких транспортных сред с линкомицином.

Используют любой питательный бульон или 2 % пептонную воду, рН = 7,2 - 7,6. К 100 мл стерильного бульона добавляют 0,5 мл линкомицина в концентрации 1000 мкг/мл. Конечная концентрация линкомицина - 5 мкг/мл. Среда сохраняется в холодильнике не более 2-х суток. Непосредственно перед взятием носоглоточной слизи (можно в помещении, где находятся обследуемые лица) среда без огня разливается по 1,0 мл в стерильные пробирки. Перед погружением тампона пробку извлекают, тампон вставляют в пробирку так, чтобы материал был погружен в среду; пробирку со вставленным тампоном снова закрывают. Пробирки транспортируют в вертикальном положении при температуре не ниже 22 °C. По доставке в лабораторию тампоны отжимают о стенки пробирки и производят посев на сывороточный агар без антибиотиков в чашки Петри. На одной чашке можно разместить 2 посева. Транспортные среды с линкомицином применяют при необходимости транспортировки материала в течение более 3-х часов.

10.6.3. Приготовление полужидкой среды обогащения для носоглоточной слизи.

К 80 мл полужидкого питательного агара добавляют 20 мл любой сыворотки и 0,1 мл раствора ристомицина, содержащего 20000 ед./мл (конечная концентрация 20 ед./мл питательной среды). Среду разливают в пробирки по 3 мл, выдерживают 2 суток в термостате для контроля и затем хранят в холодильнике.

10.7. "Двухфазная " питательная среда.

Питательная среда содержит не только х, гамма факторы, необходимые для роста Н.influenzae, но витамины, что способствует росту других микроорганизмов, в том числе менингококков и пневмококков.

В этой связи среда может быть использована только для посева "стерильного" материала, взятого из закрытых полостей (СМЖ, кровь, эксудат и т.п.) со всеми предосторожностями от возможного загрязнения.

В основу двухфазной среды взята питательная среда "шоколадный агар" на триптическом переваре (Хоттингера, триптикоза-соевый и др.). При добавлении крови животного среда прогревается в течение 10 мин. при 65 - 80 °C двукратно, употребление крови человека требует прогревания среды в течение 15 мин. при температуре 100 °C (что разрушает анти-Y фактор в этой крови). Среда разливается в пробирки по 5,0 мл или флаконы по 50,0 мл и скашивается.

После затвердения "косяков" в пробирки добавляют по 3,0 - 5,0 мл, а во флаконы по 50,0 мл бульона на переваре "Хоттингера", к которому добавляется гретая кровь и экстракт пекарских дрожжей¹².

Среда для употребления хранится в холодильнике, перед внесением в нее патологического материала согревается в термостате. Засеянные у постели больного пробирки тотчас доставляются в лабораторию. При невозможности осуществить доставку немедленно они помещаются в термостат с последующей передачей в лабораторию. В лаборатории из "двухфазной" среды делают посев на чашки с агаром. Уже через 3 - 4 часа жидкая часть среды мутнеет от роста в ней культуры, из которой можно сделать мазок для микроскопирования.

_______________

¹² Методические рекомендации "Современные методические подходы к микробиологической диагностике гемофильной инфекции." Утверждены Минздравом России, 1992 г.

11. Методы серологической идентификации менингококков или их антигенов

11.1. Реакция агглютинации на стекле (см. Инструкцию по применению сывороток).

11.2. Реакция агглютинации в полистироловых пластинах.

При постановке реакции агглютинации (РА) используют полистироловые пластины или большие стекла. Для каждой испытуемой культуры менингококков используют один ряд лунок пластины. Число горизонтальных лунок соответствует числу агглютинирующих группоспецифических сывороток. Жидкую сыворотку каждой серогруппы в лунке разводят вдвое (1 капля сыворотки плюс 1 капля взвеси культуры). В отдельной лунке каждого ряда готовят взвесь испытуемых культур. Для этого запаянной изогнутой пастеровской пипеткой бактериальную массу снимают с чашки Петри и тщательно эмульгируют в физиологическом растворе. Для получения оптимальной рабочей густоты к взвеси добавляют по 1,0 мл физиологического раствора. Взвесь разносят по 1 капле в горизонтальные лунки. Пластины встряхивают в течение 1 мин. руками или шуттеле-аппарате.

Учитывают реакцию в течение первых 3-х мин. Контролем служит лунка, в которой готовят исходную взвесь бактерий в физиологическом растворе.

11.3. Реакция преципитации для определения серогруппы менингококков и метод встречного иммуноэлектрофореза (ВИЭФ) для определения специфического антигена в СМЖ (экспресс-диагностика¹³).

_______________

¹³ Используют только те коммерческие сыворотки в "Наставлении" к которым сказано, что они пригодны для постановки реакции преципитации.

11.3.1. Приготовление агара.

Из дальневосточных сортов агар-агара готовят 2 % взвесь на дистиллированной воде. В случае непрозрачного раствора агара, в него добавляют 10 % раствор NaCl: из расчета 50 мл на 1 л раствора агара. Профильтрованный растопленный агар разливают в ванночки слоем в 1 см, в застывшем состоянии нарезают квадраты размером 1 × 1 см и завязывают в марлю. Сначала его промывают проточной водопроводной водой в течение 24 - 48 часов, затем сутки - дистиллированной, которую заменяют 3 - 4 раза. Отмытый агар отжимают от воды, помещают в колбу и разогревают на кипящей водяной бане, фильтруют через ватно-марлевый фильтр и добавляют дистиллированную воду до первоначального объема, т.е. до концентрации, равной 2 %. К горячему 2 % агару добавляют равный объем "камерного" веронал-мединалового буфера, разведенного в 2 раза дистиллированной водой, и кипятят в водяной бане до полной гомогенизации смеси. К остывшему до 60 °C агару добавляют тимол или крезол из расчета 1:10000. Полученный 1 % раствор агара на веронал-мединаловом буфере используют для постановки реакции ВИЭФ. Для реакции микропреципитации используют 1 % агар, приготовленный на физиологическом растворе.

11.4. Реакция микропреципитации для определения серогруппы менингококков.

В чашку Петри или стеклянную пластинку размером 9 × 12 см наливают 20 мл, а на предметное стекло - 5 мл расплавленного 1 % агара на физиологическом растворе. В застывшем arape с помощью металлических трубок просекают отверстия (лунки) диаметром 3 мм, из которых агаровые пробки удаляют путем отсоса этой же трубкой или острием иглы. Расстояние между центрами лунок 0,5 см.

Лунки в агаре располагают следующим образом: в центральную лунку пастеровской пипеткой наливают сыворотку, в периферические - прогретые при температуре 100 °C в течение 15 минут взвеси испытуемых культур. Микробную кипяченую взвесь можно хранить в холодильнике в течение 2-х недель. Для реакции микропреципитации используют не разведенные сыворотки.

Концентрация испытуемой суточной культуры менингококка, выращенной на 20 % сывороточном агаре, должна составлять 30 - 60 единиц, т.е. быть в 3 - 6 раз гуще оптического стандарта мутности в 10 единиц. Чашки Петри или стеклянные пластины с лунками, заполненными сывороткой и антигенами, помещают во влажную камеру (эксикатор с водой) на 24 - 48 часов при температуре 20 - 22 °C. По окончании срока учитывают реакцию. Реакция проявляется только со штаммами менингококков гомологичной серогруппы в виде линии преципитации.

11.5. Метод ВИЭФ.

У больного гнойным менингитом, желательно до применения химиотерапии, берут СМЖ, которую исследуют на присутствие специфического полисахаридного антигена. Для этого используют аппарат для иммуноэлектрофореза ПЭФ-3 или другой любой марки. В аппарат заливают "камерный" вероналмединаловый буфер, содержащий в 1 л дистиллированной воды 21,9 г мединала и 3,45 веронала (веронал надо греть на водяной бане до полного его растворения) рН = 8,6. Приготовленный 1 % агар (п. 11.3.1), растопленный и остуженный до 60 °C, наносят в количестве 20 мл на поверхность стеклянной пластинки, размером 9 × 12 см, помещенную на горизонтальный столик. После застывания агара пробойником или металлической трубкой, диаметр которой равен 3 мм, высекают 2 параллельных ряда отверстии на расстоянии 3 мм друг от друга, по числу групповых сывороток. Ряды располагают перпендикулярно к направлению силы тока.

Антисыворотки вносят в лунки, расположенные со стороны анода (+), а спинномозговую жидкость в лунки со стороны катода (-). Сыворотку вносят в отдельную лунку. В отдельную лунку помещают заведомо положительный контроль, который позволяет оценить правильность постановки теста. В качестве контроля используют менингококковую вакцину серогруппы A или C с гомологичной сывороткой, в концентрации 10 - 20 мкг/мл. Приготовленную пластинку помещают в аппарат для иммуноэлектрофореза на 20 - 30 мин. при силе тока 12 - 15 МА на 1 стекле. Аппарат работает при комнатной температуре. При положительной реакции через 10 мин. после выключения тока, между лунками (с одной из сывороток и ликвором) появляются линии преципитации, которые хорошо видны в проходящем свете. В случае, когда антигена мало, линии преципитации проявляются на следующие сутки (пластинка находится во влажной камере). Для ускорения этого процесса в тот же день, можно 2 - 3 раза пропускать ток через пластину в течение 5 - 10 минут, т.е. время анализа увеличивается до 60 мин. Формулировку ответа на ВИЭФ см. п. 9.1.

12. Приготовление и стерилизация тампонов для взятия носоглоточной слизи

Для взятия носоглоточной слизи используют ватные тампоны, укрепленные на металлической проволоке. Лучше всего применять проволоку из малоокисляемого металла (алюминия) диаметром 2 - 3 мм. Проволоку изгибают под углом 135° на расстоянии 1 - 2 см от конца, на который накручивают ватный тампон; 5 - 10 таких проволок завертывают в бумагу и стерилизуют сухим жаром или в автоклаве. Можно использовать также стерильные ватные тампоны на проволоках, вмонтированных в пробирку.

13. Создание повышенной концентрации углекислоты при культивировании посевов на чашках Петри и в пробирках (рекомендуется при первичном выделении менингококков из ликвора, крови и получении биомассы)

Для создания повышенной концентрации СO₂ можно использовать любой сосуд с притертой крышкой, например, эксикатор. Засеянные чашки помещают внутрь сосуда вверх дном, там же укрепляют зажженную свечу высотой 2 - 3 см и закрывают крышкой, которой может служить и простое большое стекло. К моменту затухания свечи в сосуде создается повышенная концентрация СO₂ (7 - 10 %). После этого сосуд с посевами помещают в термостат.

 

Руководитель Департамента Госсанэпиднадзора

А.А. Монисов

 

Приложение 4
к приказу Минздрава РФ
от 23 декабря 1998 г. № 375

Методические указания по противоэпидемическим мероприятиям при менингококковой инфекции

Источником менингококковой инфекции является больной человек или бактерионоситель; заражение происходит капельным (аэрозольным) путем. Различают 3 группы источников инфекции:

1. Больные генерализованными формами - (ГФМИ) (около 1 % от общего числа инфицированных лиц).

2. Больные острым менингококковым назофарингитом (до 30 % от общего числа инфицированных лиц).

3. "3доровые" носители - лица, выделяющие менингококки и не имеющие воспалительных изменений в носоглотке.

Наиболее опасным источником инфекции является больной генерализованной формой - ГФМИ (менингитом, менингококцемией, менингоэнцефалитом и др.) в продромальном периоде, продолжительность которого составляет в среднем 4 - 6 дней.

Определенное эпидемиологическое значение принадлежит больным менингококковым назофарингитом, длительность заразного периода - около двух недель.

"Здоровый" носитель имеет значительно меньшую заражающую способность. Вместе с тем, число носителей в сотни раз превышает число больных: эпидемический процесс при менингококковой инфекции поддерживается последовательным состоянием носительства. Длительность носительства менингококков составляет в среднем 2 - 3 недели, у 2 - 3 % лиц носительство может продолжаться в течение 6 и более недель. Есть отдаленные сведения о более длительном носительстве, особенно при наличии хронического воспалительного состояния носоглотки.

Очаг менингококковой инфекции характеризуется появлением в семье, детском учреждении, школе и других коллективах больного ГФМИ. Граница очага определяется эпидемиологом в каждом конкретном случае, выявляются все общавшиеся с заболевшим лица для более полной диагностики больных менингококковым назофарингитом и носителей.

В эпидемиологической практике очаги подразделены на две категории: с небольшим числом общающихся между собой лиц и четко очерченными границами (семейные очаги, очаги в группах детских коллективов, классах школ) или очаги, где определение границ затруднено в связи со значительным числом лиц, находящихся в тесном общении (учащиеся различного рода училищ, работники предприятий и учреждений и пр.).

Переуплотнение, повышенная влажность воздуха в помещении, нарушение санитарно-гигиенического режима способствуют распространению инфекции и возникновению групповых заболеваний менингококковой инфекцией. Вспышки происходят чаще в организованных коллективах детей и подростков, как правило, в течение первых недель после их формирования или в период сезонного подъема заболеваемости.

Противоэпидемические мероприятия в очаге менингококковой инфекции

Обязательной регистрации и подаче экстренного извещения в Центр Государственного санитарно-эпидемиологического надзора подлежат случаи генерализованной формы менингококковой инфекции (ГФМИ): менингококковый (эпидемический цереброспинальный) менингит, менингококцемия (сепсис, без поражения мозговых оболочек), их сочетанные формы, а также при подозрении на эти заболевания и бактериологически подтвержденные менингококковые назофарингиты. При наличии групповых заболеваний ГФМИ с числом 5 и более случаев подается внеочередное донесение в Минздрав России в соответствии с приказом "О повышении готовности органов и учреждений Госсанэпидслужбы России к работе в чрезвычайных ситуациях" № 230 от 29.07.98.

Больные генерализованной формой менингококковой инфекции или при подозрении на нее немедленно госпитализируются в специализированные отделения инфекционных больниц, а при их отсутствии - в боксы или полубоксы.

Больные с бактериологически подтвержденным менингококковым назофарингитом, выявленные в очагах инфекции, в зависимости от тяжести клинического течения, помещаются в инфекционные больницы или в специальные развернутые стационары. Они могут быть изолированы на дому, если в семье или квартире нет больше детей дошкольного возраста и лиц, работающих в детских дошкольных учреждениях, а также при условии проведения регулярного медицинского наблюдения и лечения.

Больные острым назофарингитом (бактериологически не подтвержденным), выявленные в очаге менингококковой инфекции, подлежат лечению по назначению врача, установившего диагноз. Из детских дошкольных коллективов эти больные изолируются на время лечения и допускаются в коллектив только после исчезновения острых явлений.

Контактные с больным, оставленным на дому, дети, посещающие детские дошкольные учреждения и лица, работающие в этих учреждениях, допускаются в коллектив только после медицинского осмотра и однократного бактериологического обследования с отрицательным результатом.

Выписка из стационара больных ГФМИ и назофарингитом производится после полного клинического выздоровления, без бактериологического обследования на носительство менингококков.

Реконвалесценты менингококковой инфекции допускаются в детские дошкольные учреждения, школы, школы-интернаты, санатории и учебные заведения после одного отрицательного результата бактериологического обследования, проведенного не ранее, чем через 5 дней после выписки из стационара или выздоровления больного назофарингитом на дому.

Различные профилактические прививки реконвалесцентам, перенесшим генерализованную форму менингококковой инфекции, проводят через 6 месяцев после выздоровления, переболевшим менингококковым назофарингитом - через 2 месяца, носителям - через 1 месяц после элиминации возбудителя.

После госпитализации больного ГФМИ осуществляют следующие мероприятия:

- определяются границы очага, выявляются лица, контактные с больными с учетом продолжительности и близости общения;

- в детских дошкольных учреждениях, домах ребенка, школах-интернатах, детских санаториях, школах (классах) устанавливается карантин сроком на 10 дней с момента изоляции последнего больного. В течение этого срока запрещается прием новых и временно отсутствующих детей, а также переводы детей и персонала из одной группы (класса) в другую;

- все лица, общавшиеся с больным в коллективе, семье (квартире) подвергаются медицинскому осмотру (в коллективах обязательно с участием отоляринголога). Особое внимание уделяется выявлению лиц с хроническими воспалительными явлениями в носоглотке и лиц, имеющих неясные "аллергические" высыпания на коже. При наличии патологических изменений в носоглотке больные изолируются из коллектива, а контактные в семье (квартире) не допускаются в детские коллективы и школы до установления диагноза. Лица с подозрительными высыпаниями на коже госпитализируются для исключения менингококцемии.

- В очаге проводится клиническое наблюдение с осмотром носоглотки, кожных покровов и ежедневной термометрией в течение 10 дней (срок карантина).

- Детям в возрасте до 1 года, общавшимся с больными генерализованной формой менингококковой инфекции, с профилактической целью вводят нормальный иммуноглобулин в дозе 1,5 мл, а в возрасте от 2-х до 7 лет включительно - 3,0 мл. Препарат вводят внутримышечно, однократно, не позднее седьмого дня после регистрации первого случая заболевания.

Бактериологическому обследованию подлежат:

а) в детских учреждениях - дети, бывшие в общении с больными, и обслуживающий персонал всего учреждения;

б) в школах - учащиеся и преподаватели класса, где зарегистрирован больной;

в) в школах-интернатах (круглосуточное пребывание детей) - учащиеся, общавшиеся с больным в классе и в спальной комнате, а также преподаватели и воспитатели данного класса;

г) в семьях, квартирах - все лица, общавшиеся с больными;

д) в ВУЗах, средних учебных заведениях, ПТУ, спецучилищах, колледжах при возникновении случая заболевания на первом курсе - преподаватели и студенты всего курса; на старших курсах - только общавшиеся с больным в учебной группе и комнате общежития;

е) в других организованных коллективах - лица, проживающие в общежитии.

В детских дошкольных учреждениях бактериологические обследования контактных проводятся не менее двух раз с интервалом в 3 - 7 дней, в остальных коллективах - однократно.

Носители менингококков, выявленные при бактериологическом обследовании в детских дошкольных коллективах, школах-интернатах и др. детских учреждениях выводятся из коллектива на срок проведения санации. Из коллектива взрослых, в том числе учебных заведений, носители не изолируются.

Носители менингококков - дети и взрослые, выявленные в семейных очагах, в детские дошкольные учреждения, школы, школы-интернаты, санатории, оздоровительные лагеря и др. детские учреждение не допускаются. Бактериологическое обследование коллективов, которые посещали эти носители, не проводится.

При выявлении носителя менингококков среди больных соматических стационаров, его следует изолировать в бокс или полубокс. Вопрос о санации решается в зависимости от основного заболевания. При отсутствии возможности изоляции носителя курс санации проводится обязательно. Персонал отделения подвергается однократному бактериологическому обследованию, выявленные носители отстраняются от работы на время проведения санации.

Выявленные носители менингококков санируются на дому или в специально развернутых для этих целей отделениях: взрослые - ампициллином или левомицетином по 0,5 × 4 раза в день в течение 4-х дней. Детям эти препараты назначают по той же схеме в возрастных дозировках. Для санации носителей в закрытых коллективах взрослых рекомендуется рифампицин по 0,3 через 12 часов в течение 2-х дней.

Через 3 дня после окончания курса санации носители, независимо от примененного препарата, подвергаются однократному бактериологическому обследованию и при наличии одного отрицательного бактериологического анализа они допускаются в коллективы.

При длительном носительстве (свыше 1 месяца) и отсутствии воспалительных изменений в носоглотке носитель допускается в коллектив, где он был выявлен.

Заключительная дезинфекция в очагах не проводится. Не подлежит дезинфекции и транспорт по перевозке больных. В помещении проводится ежедневная влажная уборка, максимальное разуплотнение в спальных помещениях, частое проветривание помещения, облучение ультрафиолетовыми и бактерицидными лампами.

В период эпидемического подъема заболеваемости запрещается большое скопление детей на зрелищных мероприятиях, удлиняются перерывы между сеансами в кинотеатрах.

Среди населения постоянно проводится широкая разъяснительная работа о необходимости раннего обращения к врачу.

Специфическая профилактика

Менингококковая вакцина серогруппы A и B (производства Московского НИИЭМ им. Г.Н. Габричевского) слабо реактогенна, безвредна, иммунологически активна, вызывает нарастание антител с 5 для после однократного введения и через 2 недели антитела достигают максимального уровня. Заболеваемость, вызываемая менингококком группы С в России на протяжении последних 100 лет находится на спорадическом уровне. Менингококк серогруппы А является причиной эпидемических подъемов, требующих для их ликвидации проведения специфической вакцинопрофилактики.

Вакцина применяется с профилактической целью и с целью экстренной профилактики в очагах менингококковой инфекции, в соответствии с Наставлением по применению препарата.

1. С профилактической целью вакцинация проводится:

а) По решению местных органов здравоохранения на территориях при угрозе развития эпидемического подъема (по данным эпидемиологического анализа за последние 2 года).

Прививкам подлежат:

- дети от 1 года до 8 лет включительно;

- учащиеся первых курсов институтов, техникумов, ПТУ, временные рабочие и др. лица, приехавшие из разных местностей в организованные коллективы и объединенные совместным проживанием в общежитиях (желательно в период формирования коллективов);

- дети, принимаемые в детские дома, учащиеся первых классов школ-интернатов.

б) При резком подъеме заболеваемости и показателе свыше 20,0 на 100000 населения проводится массовая вакцинация всего населения с охватом не менее 85 %.

2. С целью экстренной профилактики (для предотвращения вторичных заболеваний) вакцина вводится в очаге инфекции в первые 5 дней после выявления первого случая заболевания генерализованной формой менингококковой инфекции. Вакцинации подлежат:

- лица, находившиеся в контакте с больным в детском учреждении, школьном классе, семье, квартире, спальном помещении общежития и дружественные контакты;

- лица, вновь поступающие в коллектив - очаг инфекции (вакцина вводится им за неделю до поступления);

- учащиеся всего первого курса средних и высших учебных заведений при возникновении заболеваний ГФМИ на первом курсе или на старших курсах;

- учащиеся старших курсов, общавшиеся с больным в группе или комнате общежития;

- проживающие в сельской местности дети, школьники, учащиеся СПТУ и пр., а также все лица, находившиеся в любой степени общения с больным в населенном пункте, где в течение последних 3-х лет не регистрировались заболевания.

Иммунизация осуществляется в соответствии с наставлением по применению полисахаридной менингококковой вакцины с предварительным обязательным медицинским осмотром и не ранее чем через 2 месяца после введения других вакцин, а в очагах инфекции - независимо от срока их введения¹⁴.

Повторная вакцинация одним и тем же лицам проводится не чаще одного раза в 3 года.

В иммунизированных коллективах карантин не устанавливается, бактериологическое обследование и иммуноглобулинопрофилактика контактным старше 1 года не проводится.

_______________

¹⁴ В нашей стране кроме отечественной вакцины зарегистрирована и разрешена к применению полисахаридная менингококковая вакцина А+С (менинго А+С) производства "Пастер Мерье Коннот" Франция.

 

Руководитель Департамента Госсанэпиднадзора

А.А. Монисов

 

Приложение 5
к приказу Минздрава РФ
от 23 декабря 1998 г. № 375

Методические указания по использованию реакции непрямой гемагглютинации для выявления антител при менингококковой инфекции

1. Показания к проведению серологических исследований

Реакцию непрямой гемагглютинации (РНГА) с менингококковыми эритроцитарными диагностикумами¹⁵ серогрупп A, B и C проводят в следующих случаях:

а) как дополнительный метод диагностики менингококковой инфекции. Обязательным требованием является исследование сывороток крови от больных, взятых в разные сроки от начала заболевания, т.е. в динамике (в начале заболевания, на 7 и 15 день болезни).

б) для ретроспективного выявления локализованных форм менингококковой инфекции в очагах заболевания;

в) при проведении иммуно-эпидемиологических исследований среди населения с целью определения соотношения серонегативных и серопозитивных контингентов;

г) при оценке иммунологической эффективности противоменингококковой вакцинации.

_______________

¹⁵ Характеристика эритроцитарных менингококковых диагностикумов, выпускаемых производственным предприятием МНИИ-ЭМ им. Г.Н. Габричевского Минздрава РФ, условия их хранения и техника постановки реакции непрямой (пассивной) гемагглютинации подробно изложены в Наставлении по применению диагностикумов, которое вложено в упаковку препаратов.

2. Методика постановки реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) с эритроцитарными менингококковыми диагностикумами

Реакцию непрямой гемагглютинации можно ставить как макро-, так и микрометодом, причем, в последнем случае используют только микротитраторы системы "Такачи".

Различия между этими методами заключаются лишь в объемах используемых ингредиентов и сроках учета результатов реакции. При макрометоде реагирующая смесь в каждой лунке состоит из 0,5 мл соответствующего разведения сыворотки крови и 0,25 мл диагностикума. В микрометоде объемы соответственно уменьшаются: 0,05 мл сыворотки и 0,025 мл диагностикума.

Учет результатов исследования в микротитраторе проводят спустя 2 часа инкубации в термостате; при макрометоде иногда требуется дополнительная экспозиция в течение 1 - 2 часов при комнатной температуре.

При постановке РНГА можно использовать многоканальные пипетманы с указанными объемами ингредиентов.

2.1. Необходимые реагенты и приборы:

- эритроцитарные менингококковые серогруппы A, B и C диагностикумы;

- сыворотки диагностические менингококковые группоспецифические A, B и C¹⁶;

- нормальная кроличья сыворотка¹⁷, сухая кроличья плазма или бычий сывороточный альбумин¹⁸;

- исследуемый материал (сыворотка крови человека);

- полистироловые пластины с лунками, серологические пробирки или микротитраторы с V-образными лунками (системы "Такачи");

- термостат для поддержания температуры 37 °C;

- водяная баня для поддержания температуры 56 °C;

- потенциометр для измерения pH растворов;

- пипетки стеклянные мерные (ГОСТ 20-292-74);

- дозаторы пипеточные П1 на 0,5; 0,05 (2Т2.933.053 ТО);

- хлорид натрия (NaCl),

- натрий фосфорно-кислый двузамещенный (Na₂HPO₄-12H₂O);

- калий фосфорно-кислый однозамещенный (KH₂PO₄);

- дистиллированная вода.

2.2. Подготовка ингредиентов.

2.2.1. Приготовление исходного забуференного физиологического раствора рН 7,2 (ЗФР).

В 0,5 л дистиллированной воды растворяют:
хлорида натрия (NaCl)	- 8,65 г
натрия фосфорно-кислого двузамещенного (Na2HPO4 × 2Н2О) калия фосфорно-кислого	- 1,92 г
однозамещенного (KH2PO4)	- 0,44 г
Объем раствора доводят до 1 л дистиллированной водой.

После растворения солей проверяют рН раствора, который должен быть равен 7.2. Раствор фильтруют через бумажный фильтр, разливают во флаконы и стерилизуют при 0,5 атм. 30 минут.

ЗФР необходим для приготовления стабилизирующего буфера, в котором проводят титрование исследуемых сывороток крови.

2.2.2. Стабилизирующий буфер.

В качестве стабилизатора можно применять нормальную кроличью сыворотку (НКС), сухую кроличью плазму или бычий сывороточный альбумин (БСА).

Используемая НКС не должна давать неспецифической (спонтанной) реакции гемагглютинации с эритроцитарными диагностикумами. Инактивированную при +56 °C в течение 30 минут НКС или плазму добавляют к ЗФР из расчета 1,0 мл на 100,0 мл (получают 1 % раствор), БСА не инактивируют. Концентрация БСА в ЗФР - 0,5 %.

2.2.3. Взятие крови.

Для проведения серологических исследований кровь от больных ГФМИ или с подозрением на эту инфекцию забирают из локтевой вены с соблюдением обычных правил асептики: при массовых серологических исследованиях кровь берут из пальца.

После образования сгустка, полученную сыворотку отсасывают стерильной пипеткой в стерильную посуду (пробирки, ампулы). Хранят сыворотку крови в холодильнике при +4 °C. В реакции исследуют сыворотки крови без признаков пророста.

Перед постановкой РНГА сыворотки разводят 1:5 исходным буфером (ЗФР). Титрование сывороток проводят в стабилизирующем буфере.

_______________

¹⁶ Входят в набор эритроцитарных менингококковых диагностикумов.

¹⁷ Нормальную кроличью сыворотку получают от здоровых кроликов.

¹⁸ Кроличья плазма и бычий сывороточный альбумин - коммерческие препараты.

3. Учет реакции

Реакцию оценивают по общепринятой 4-х плюсовой системе (см. Наставление по применению эритроцитарных менингококковых диагностикумов).

За титр противоменингококковых антител принимают максимальное разведение сыворотки крови, в котором наблюдают четко выраженную агглютинацию эритроцитов с интенсивностью не менее чем на 2+, при условии, что в предыдущих лунках реакция шла на 4+ или 3+. Сыворотки крови с разведения 1:5 и выше с четко выраженной агглютинацией эритроцитов, оценивают как положительные.

4. Рекомендуемые сроки, кратность обследования и трактовка серологических результатов

При выборе оптимальных сроков и кратности обследования больных ГФМИ и для правильной трактовки серологических результатов необходимо принимать во внимание ряд факторов, влияющих на уровень антител: возраст больного, преморбидный фон, клиническую форму, тяжесть и период болезни; сопутствующие заболевания, серологические особенности возбудителя. При менингококковой инфекции, также как и при других инфекционных заболеваниях, правильная оценка результатов серологических исследований может быть дана только при их сопоставлении с эпидемиологическими и клиническими данными.

Оптимальные сроки взятия крови у больного ГФМИ - первые дни болезни (1 - 3 день), вторая третья и последующие недели болезни. Первую сыворотку крови необходимо брать сразу же при поступлении больного в стационар, последующие через 7 - 10 дней.

4.1. РНГА при генерализованных формах менингококковой инфекции.

4.1.1. РНГА с диагностикумами А и С.

Антитела к группоспецифическим полисахаридам менингококков серогрупп A и C при ГФМИ можно выявить уже в первые дни болезни. Число серопозитивных лиц среди взрослых больных составляет в эти сроки около 40 %. Максимальный уровень антител отмечается на 2 - 3-ей неделях болезни, с 4 - 5 недели уровень антител постепенно снижается.

За условно-диагностический титр антител к полисахаридам менингококков серогрупп А и С у детей старше 3-х лет и взрослых принимают положительную реакцию в разведении сыворотки крови 1:40 - 1:80, т.к. у лиц, не инфицированных менингококками в момент обследования, антитела в таких титрах встречаются сравнительно редко (9 - 11 %).

У детей в возрасте до 1 года продукция антител выражена слабо, в связи с чем положительные реакции наблюдают обычно в более поздние сроки (со 2 недели болезни).

У детей моложе 3-х лет за условно-диагностический титр антител к полисахаридам A и C принимают положительную реакцию в разведении 1:20 и выше, т.к. при отсутствии менингококковой инфекции у детей этого возраста антитела или не обнаруживаются, или встречаются в единичных случаях в титрах не выше чем 1:5 - 1:10.

Интенсивность антителообразования не одинакова при различных клинических формах менингококковой инфекции. При менингококцемии и сочетанных формах (менингококцемия + менингит) уровень антител обычно выше, чем при других формах болезни.

При тяжелом течении ГФМИ и особенно при инфекционно-токсическом шоке противоменингококковые антитела обнаруживаются в низких титрах, а в отдельных случаях не выявляются вообще. При очень тяжелом течении болезни особенно при наличии тяжелых осложнений (отек и набухание мозга) антителообразование выражено слабо: в остром периоде болезни обнаруживают около 10 % серопозитивных проб с низкими титрами (1:5 - 1:10). В дальнейшем, при улучшении состояния больных титры антител и число серопозитивных проб может возрастать.

Обнаружение уже на 1 неделе болезни антител к полисахаридам менингококков серогрупп A и C в титре 1:160 и выше подтверждает менингококковую этиологию заболевания. В некоторых случаях такие титры антител, обнаруженные на 1 неделе болезни, могут сохраняться и в более поздние сроки заболевания. Хотя у данных больных не наблюдается сероконверсии, высокие показатели РНГА могут служить достаточным основанием для серологического подтверждения диагноза ГФМИ.

Диагноз ГФМИ определяется как этиологически подтвержденный при наличии динамики (четырехкратного и более) нарастания уровня антител. При двукратном нарастании титра антител - диагноз оценивается как подтвержденный лишь при выраженной клинической картине.

Число этиологически подтвержденных случаев ГФМИ методом РНГА может достигать: у взрослых 80 %, у детей, в среднем 70 % (в возрастной группе детей до 3-х лет - 60 %, в старших возрастных группах - 80 %).

4.1.2. РНГА с диагностикумом серогруппы B.

При интерпретации серологических данных, полученных при работе с эритроцитарным диагностикумом на основе полисахарида менингококков серогруппы B, необходимо учитывать следующие моменты.

Изучение иммуноструктуры населения с помощью РНГА с диагностикумом серогруппы B представляет определенные сложности из-за сходства химической структуры B-полисахарида менингококка и капсульного полисахарида E.coli K1. Существует возможность наличия перекрестных реакций, что усложняет интерпретацию результатов относительно менингококка серогруппы B. Диагностикум может быть использован для подтверждения диагноза ГФМИ при исследовании сывороток крови в динамике - взятой в начале заболевания и через 2, 3 недели.

Генерализованные формы менингококковой инфекции, обусловленные менингококками серогруппы B, наиболее часто (до 60 %) диагностируются у детей первых трех лет жизни, у которых антителообразование выражено слабо. При ГФМИ у взрослых, в большинстве случаев, в первые дни болезни уровень антител к менингококкам серогруппы B составляет 1:20 - 1:40, с последующей сероконверсией на 2 - 3 неделях. В отдельных случаях (14 %) содержание антител на 2 - 3 неделях болезни может достигать титров 1:640 - 1:1280 и выше.

4.1.3. Групповая специфичность РНГА.

При постановке РНГА с набором эритроцитарных диагностикумов может выявляться одновременное присутствие антител к нескольким полисахаридам. В таких случаях серогруппу менингококков, вызвавших заболевание у данного больного, определяют по динамике нарастания уровня антител к одному из полисахаридов. При этом разница показателей парных сывороток должна быть не меньше чем на два разведения. При получении одинаковых титров антител к двум полисахаридам в условно-диагностических титрах, диагностируется ГФМИ без установления серогруппы возбудителя.

4.2. РНГА при локализованных формах менингококковой инфекции (назофарингит и бактерионосительство).

При локализованных формах менингококковой инфекции серологические исследования не следует рассматривать как метод диагностики, поскольку вопрос о носительстве или менингококковом назофарингите решается на основании бактериологического обследования. Но в ряде случаев при проведении исследований в очагах ГФМИ серологические данные могут послужить дополнительным тестом, ретроспективно подтверждающим клинико-эпидемиологический диагноз менингококковой инфекции. При этом следует проводить обязательное исследование парных образцов сывороток крови, полученных с 10 - 14 дневным интервалом.

При назофарингите антителообразование более выражено, чем при бактерионосительстве. У больных назофарингитом менингококковой этиологии в 90 % случаев выявляются противоменингококковые антитела, причем в 50 % случаев с титрами от 1:40 и выше. Среди бактерионосителей независимо от серогруппы выделенного возбудителя специфические антитела определяют в 65 % случаев, а с титрами от 1:40 и выше у 30 % носителей.

В сыворотках крови, полученных от носителей, так же как и от больных (см. п. 4.1.3), могут выявляться антитела к нескольким полисахаридам менингококков. Нарастание антител к гомологичной серогруппе чаще отмечают при носительстве менингококков серогруппы A. В отдельных случаях динамика антител (сероконверсия) не позволяет серологически установить доминирующую серогруппу менингококков. В этом случае определяют носительство без установления серогруппы.

4.3. РНГА при иммуно-эпидемиологических исследованиях.

Целью иммуно-эпидемиологических исследований является определение числа лиц вероятно восприимчивых к менингококковой инфекции и групп риска. Анализ проводят по числу серопозитивных и серонегативных лиц с учетом существующей эпидемической ситуации.

Например, в период эпидемического неблагополучия увеличивается число серопозитивных лиц и соответственно уменьшается число серонегативных к эпидемической серогруппе менингококков. В период спорадической заболеваемости, наоборот, растет число серонегативных лиц.

При проведении иммуно-эпидемиологических исследований среди населения объем репрезентативных выборок устанавливается эпидемиологом в соответствии с численностью и возрастным составом коллектива, района, населенного пункта.

Определяемый фоновый уровень противоменингококковых антител связан с заболеваемостью менингококковой инфекцией на данной территории и уровнем носительства. Наиболее высокий уровень антител в разные эпидемические периоды определяют к менингококкам серогруппы B, что, возможно, отражает их серологическое родство с E.coli K1, моракселлой, непатогенными нейссериями. При этом число серопозитивных проб с титрами антител 1:20 и выше может достигать 90 %.

К менингококкам серогруппы C уровень антител наименьший, число серопозитивных сывороток с титром антител 1:20 и выше составляет 8 %.

Уровень антител к менингококкам серогруппы A дает достаточно четкую характеристику эпидемиологической ситуации и отражает широту циркуляции возбудителя.

Анализ серологических результатов эпидемиологических исследований проводят на основании расчета следующих показателей:

а) процента серонегативных проб, полученных с каждым из эритроцитарных диагностикумов (A, B и C), который может отражать число вероятно восприимчивых лиц к менингококковой инфекции;

б) процента серопозитивных проб (все серопозитивные сыворотки крови, начиная с разведения 1:5 и выше), из числа которых выделяют пробы с титрами антител:

- в возрастной группе до 3-х лет с 1:10 и выше к полисахаридам A и C, с 1:20 и выше к полисахариду B;

- в старших возрастных группах детей и у взрослых с 1:20 и выше к полисахаридам A и C, с 1:80 и выше к полисахариду B. Процент сывороток крови с указанными выше уровнями антител отражает доминирующие на данной территории серогруппы менингококков.

4.4. Применение РНГА для оценки эффективности вакцинопрофилактики менингококковой инфекции.

Формирование поствакцинального иммунитета носит группоспецифический характер. В связи с этим, в зависимости от используемой для профилактики менингококковой вакцины, серологические исследования для оценки эффективности вакцинации проводят с применением РНГА с гомологичным эритроцитарным диагностикумом.

При вакцинации взрослых специфические противоменингококковые антитела к полисахариду A выявляют в высоких титрах (1:40 - 1:640 и выше) не менее чем у 80 % привитых уже на 3 - 4 неделе после вакцинации. На протяжении последующих 6 - 8 месяцев у привитых титры антител несколько снижаются, но сохраняются на повышенном уровне не более двух лет.

 

Руководитель Департамента Госсанэпиднадзора

А.А. Монисов