Государственное
санитарно-эпидемиологическое нормирование 4.2.
МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ Методы идентификации и Методические
указания Москва • 2015 1. Разработаны ФГБНУ «НИИ питания» (В.А. Тутельян, Н.В. Тышко, Э.О. Садыкова, А.К. Голомидова); Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (А.Ю. Попова, И.В. Брагина); Российской академией наук (Г.Г. Онищенко); Институтом биоинженерии, ФИЦ Биотехнологии РАН (К.Г. Скрябин, Б.Б. Кузнецов, М.С. Сухачева, И.В. Яковлева); МГУ им. М.В. Ломоносова (М.П. Кирпичников). 2. Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека - Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 2 ноября 2015 г. 3. Введены впервые. Содержание
4.2.
МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ Методы
идентификации и количественного Методические указания I. Область применения1.1. Настоящие методические указания (далее - МУК) определяют методы идентификации и количественного определения генно-инженерно-модифицированных организмов (далее - ГМО) растительного происхождения в пищевых продуктах и носят рекомендательный характер. 1.2. В настоящих МУК представлены методы, направленные на идентификацию и количественное определение рекомбинантной ДНК, характерной для уникальных трансформационных событий, для осуществления окончательной идентификации новых линий ГМО растительного происхождения. 1.3. Настоящие МУК предназначены для использования лабораториями Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, а также другими испытательными лабораториями, аккредитованными в установленном порядке на проведение исследований продовольственного сырья и пищевых продуктов. II. Методы количественного определения линий ГМ сои2.1. Метод количественного определения сои линии FG72. Метод основан на ПЦР в реальном времени с определением гена, кодирующего синтез лектина (lectin1), присущего для всех линий сои, и области ДНК, специфичной для трансформационного события FG72 на границе генома сои и элемента генетической конструкции. Для построения калибровочной прямой используются стандартные образцы состава ГМ сои FG72 (кат. номер AOCS 0610-А3) - 99,9 % и ее традиционный аналог (кат. номер AOCS 0707-А6). Праймеры для идентификации рекомбинантной ДНК сои FG72: МАЕ071 5’ - AGA ТТТ GAT CGG GCT GCA GG-3’ SHA097 5’ - GCA CGT ATT GAT GAC CGC ATT A-3’ TM325 FAM-5’ - AAT GTG GTT CAT CCG TCT Т-3’ - MGBNFQ Праймеры для идентификации ДНК сои (lectin1): KVM164 5’ - CTTTCTCGCACCAATTGACA-3’ KVM165 5’ - ТСА AAC ТСА АСА GCG ACG AC-3’ TM021 VIC - 5’ - CCA CAA АСА CAT GCA GGT TAT CTT GG-3’ - TAMRA Реакционная смесь для определения рекомбинантной ДНК сои FG72
Реакционная смесь для определения ДНК сои (lectin1)
Условия амплификации
2.2. Метод количественного определения сои линии SYHT0H2. Метод основан на ПЦР в реальном времени с определением гена, кодирующего синтез лектина (lectin1), присущего для всех линий сои, и области ДНК, специфичной для трансформационного события SYHT0H2 на границе генома сои и элемента генетической конструкции. Для построения калибровочной прямой используются стандартные образцы состава ГМ сои SYHT0H2 (кат. номер AOCS 0411-D) - 99,9 % и ее традиционный аналог (кат. номер AOCS 0411-В). Праймеры для идентификации рекомбинантной ДНК сои SYHT0H2: FE08316 forward primer 5’-GGGAATTGGGTACCATGCC-3’ FE08317 reverse primer 5’-TGTGTGCCATTGGTTTAGGGT-3’ FE08318 probeFAM-5’-CCAGCATGGCCGTATCCGCAA-3’-BHQ Праймеры для идентификации ДНК сои (lectin1): Lecfor2 5’-CCAGCTTCGCCGCTTCCTTC-3’ GMO3-126Rev 5’-GAAGGCAAGCCCATCTGCAAGCC-3’ Lec probe FAM-5’-CTTCACCTTCTATGCCCCTGACAC-3’-TAMRA Реакционная смесь для определения рекомбинантной ДНК сои SYHT0H2
Реакционная смесь для определения ДНК сои (lectin1)
Условия амплификации
III. Методы количественного определения линий ГМ кукурузы3.1. Метод количественного определения кукурузы линии MON89034. Метод основан на ПЦР в реальном времени с определением гена hmgA, присущего для всех линий кукурузы, и области ДНК, специфичной для трансформационного события MON89034 на границе генома кукурузы и элемента генетической конструкции. Для построения калибровочной прямой используются стандартные образцы состава ГМ кукурузы MON89034 (кат. номер AOCS 0906-Е) - 99,4 % и ее традиционный аналог (кат. номер AOCS 0906-А). Праймеры для идентификации рекомбинантной ДНК кукурузы MON89034: MON89034 primer 1 5’-TTCTCCATATTGACCATCATACTCATT-3’ MON89034 primer 2 5’-СGGТАТСTАТААТАССGТGGTTTTТААА-3’ MON89034 (Probe) FAM-5’-ATCCCCGGAAATTATGTT3’-MGBNFQ Праймеры для идентификации ДНК кукурузы (hmgA): hmg primer 1 5’-TTG GAC TAG AAA TCT CGT GCT GA-3’ hmg primer 2 5’-GCT АСА TAG GGA GCC TTG ТСС T-3’ hmg (Probe) FAM-5’-CAATCCACACAAACGCACGCGTA-3’-TAMRA Реакционная смесь для определения рекомбинантной ДНК кукурузы MON89034
Реакционная смесь для определения ДНК кукурузы
Условия амплификации
3.2. Метод количественного определения кукурузы линии 5307. Метод основан на ПЦР в реальном времени с определением гена, кодирующего синтез алкогольдегидрогеназы 1 (adhl 1), присущей для всех линий кукурузы, и области ДНК, специфичной для трансформационного события 5307 на границе генома кукурузы и элемента генетической конструкции. Для построения калибровочной прямой используются стандартные образцы состава ГМ кукурузы 5307 (кат. номер AOCS 0411-D) - 99,88 % и ее традиционный аналог (кат. номер AOCS 0411-С). Праймеры для идентификации рекомбинантной ДНК кукурузы 5307: 5307i3’ forward primer 5’-CAT GGC CGT АТС CGC AAT GTG-3’ 5307i3’ reverse primer 5’-TGC ACC CTT TGC CAG TGG-3’ 5307i3’-s2 probe FAM-5’-ACC АСА АТА TAC CCT CTT CCC TGG GCC AG-3’-TAMRA Праймеры для идентификации ДНК кукурузы (adhl 1): Zm adhl primer F5’-CGT CGT TTC CCA TCT CTT CCT CC-3’ Zm adhl primer R5’-CCA CTC CGA GAC CCT CAG TC-3’ Zm adhl probe VIC-5’-AATCAGGGCTCATTTTCTCGCTCCTCA-3’-TAMRA Реакционная смесь для определения рекомбинантной ДНК кукурузы 5307
Реакционная смесь для определения ДНК кукурузы
Условия амплификации
3.3. Метод количественного определения кукурузы линии ТС 1507. Метод основан на ПЦР в реальном времени с определением гена hmgA, присущего для всех линий кукурузы, и области ДНК, специфичной для трансформационного события ТС 1507 на границе генома кукурузы и элемента генетической конструкции. Для построения калибровочной прямой используются стандартные образцы состава ГМ кукурузы ТС 1507 ERM-BF418a (< 0,1 % (m/m); ERM-BF418b (1,0 % (m/m); ERM-BF418c (9,9 % (m/m); ERM-BF418d (98,6 % (m/m). Праймеры для идентификации рекомбинантной ДНК кукурузы ТС 1507: 1) MaiY-F15’-TAGTCTTCGGCCAGААТGG-3’ 2) MaiY-R35’-CTTTGCCAAGATCAAGCG-3’ 3) MaiY-SIFAM-5’-TAACTCAAGGCCCTCACT CCG-3’-TAMRA Праймеры для идентификации ДНК кукурузы (hmgA): 4) MaiJ-F25’-TTGGACTAGAAATCTCGTGCTGA-3’ 5) mhmg-rev5’-GCT АСА TAG GGA GCC TTG ТСС T-3’ 6) Mhmg-probe FAM-5’-CAATCCACACAAACGCACGCGTA-3’-TAMRA Реакционная смесь для определения рекомбинантной ДНК кукурузы ТС 1507
Реакционная смесь для определения ДНК кукурузы
Условия амплификации
IV. Метод приготовления растворов стандартных образцов для построения калибровочной прямой4.1. Образец приготовления стандартов для построения калибровочной прямой на примере кукурузы MON89034. 4.1.1. Для построения калибровочной прямой необходимо приготовить образцы с 5,0; 1,0 и 0,1 %-м содержанием ГМ кукурузы MON89034. Для этого следует использовать стандартные образцы состава ГМ кукурузы MON89034 (кат. номер AOCS 0906-Е), содержание ГМ кукурузы 99,4 %, и ее традиционного аналога (кат. номер AOCS 0906-А). 4.1.2. Приготовление 5 %-го образца: смешать 5,03 г муки ГМ кукурузы и 94,97 г муки ее традиционного аналога. Приготовление 1 %-го образца: смешать 2,0 г 5 %-й смеси ГМ кукурузы MON89034 и 8,0 г муки ее традиционного аналога. Приготовление 0,1 %-го образца: смешать 1,0 г 1,0 %-й ГМ кукурузы MON89034 и 9,0 г муки ее традиционного аналога. 4.1.3. Из полученных смесей выделить ДНК (выделение ДНК - глава IV МУК 4.2.2304-07), полученные растворы ДНК будут содержать ГМ ДНК в количестве 5,0; 1,0 и 0,1 % соответственно. 4.2. Расчет количества рекомбинантной ДНК на основании калибровочной прямой. 4.2.1. Образец расчета количества рекомбинантной ДНК на примере ГМ сои FG72. Определить пороговый цикл для каждой ПЦР (Сt) по кривой амплификации. Рассчитать разность между Ct, специфичным для трансформационного события FG72 (линии сои FG72), и Ct, специфичным для гена lec. Относительное количество рекомбинантной ДНК в пробе определяется по формуле:
∆Ctsam - разность между значениями Ct для трансформационного события FG72 или SYHT0H2 и гена leс в исследуемом образце; ∆Ctref - разность между значениями Ct для трансформационного события FG72 или SYHT0H2 и гена lес в стандартном образце; cref - концентрация стандартного образца. Предел детекции метода составляет 0,01 %. Рис. 1. Кривая зависимости величины сигнала
флуоресценции (Rn) Рис. 2. Зависимость величины сигнала флуоресценции (Rn)
4.2.2. Образец расчета количества рекомбинантной ДНК на примере ГМ кукурузы MON89034. Определить пороговый цикл для каждой ПЦР (Ct) по кривой амплификации. Рассчитать разность между Ct, специфичным для трансформационного события MON89034 (линии кукурузы MON89034), и Ct, специфичным для гена hmgA. Относительное количество рекомбинантной ДНК в пробе определяется по формуле, представленной в п. 4.2.1. Предел детекции метода составляет 0,01 %. Рис. 3. Зависимость величины сигнала флуоресценции (Rn)
Рис. 4. Зависимость величины сигнала флуоресценции (Rn)
V. Правила оформления протокола исследованийПротокол исследований должен содержать следующие пункты. Название организации, проводившей анализ, адрес, контактный телефон. Аттестат аккредитации, № __. Наименование исследуемого образца. Название организации заявителя. Нормативная документация, в соответствии с которой проводилась оценка результатов (ТР ТС), ссылка на раздел нормативной документации, в соответствии с которым проводилось измерение. Сведения об используемых средствах измерения и испытательном оборудовании. Фактические и нормативные значения измеряемых показателей. Протокол должен быть заверен печатью организации, проводившей анализ. Пример.
Выводы. «В исследованном образце продукции не выявлено присутствие рекомбинантной ДНК сои линии 40-3-2», или «В исследованном образце продукции выявлено присутствие рекомбинантной ДНК сои линии 40-3-2 в количестве 10 % в расчете на общую ДНК сои в образце». Соя линии 40-3-2 разрешена для использования в пищевой промышленности и для реализации населению на территории Евразийского экономического союза. Испытания (исследования) провели: должность и Ф. И. О. оператора, подписи. Также необходимо указать, что результаты испытаний (исследований), представленные в данном Протоколе, относятся только к представленной пробе (образцу).
|