4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Определение остаточных количеств
дифлуфензопира в воде, почве, зеленой массе,
зерне и масле кукурузы
методом высокоэффективной
жидкостной хроматографии

Методические указания
МУК 4.1.3235-14

Москва 2015

1. Разработаны сотрудниками ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт защиты растений» (В.И. Долженко, И.А. Цибульская, Т.Д. Черменская, А.С. Комарова, В.В. Человечкова).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 6 ноября 2014 г. № 2).

3. Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 22 декабря 2014 г.

4. Введены впервые.

СОДЕРЖАНИЕ

 

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Определение остаточных количеств дифлуфензопира
в воде, почве, зеленой массе, зерне и
масле кукурузы методом высокоэффективной
жидкостной хроматографии

Свидетельство о метрологической аттестации № 01.5.04.183/01.00043/2014.

Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения массовой концентрации дифлуфензопира в диапазоне концентраций в воде 0,001 - 0,01 мг/дм³, в почве, зерне и масле кукурузы 0,01 - 0,1 мг/кг, зеленой массе 0,05 - 0,5 мг/кг.

Методические указания носят рекомендательный характер.

Дифлуфензопир

2-{(EZ)-1-[4-(3,5-difluorophenyl)semicarbazono]ethyl}nicotinic acid (ИЮИАК).

Структурная формула:

Брутто формула: C₁₅H₁₂F₂N₄O₃.

Молекулярная масса: 334,28.

Химически чистое вещество представляет собой белое кристаллическое вещество.

Температура плавления: 135 °С.

Давление пара при 25 °С: 0,01 МПа.

Растворимость в воде: 5850 мг/дм³ (при 20 °С).

Константа диссоциации (рKа) при 25 °С: 3,18 (слабая кислота).

Стабильность к гидролизу при 20 °С: DT₅₀ = 13 дней (pH 5), 24 дня (pH 7), 26 дней (pH 9). Период полураспада в почве: DT₅₀ = 14 дней.

Краткая токсикологическая характеристика. Острая пероральная токсичность LD₅₀ для млекопитающих более 5000 мг/кг, острая дермальная токсичность LD₅₀ для млекопитающих превышает 5000 мг/кг. Оказывает раздражающее действие на слизистую глаз. Умеренно токсичен для пчел.

Область применения препарата: системный гербицид для борьбы с широким спектром сорняков в послевсходовый период.

Механизм действия: ингибирование транспорта ауксина.

Гигиенические нормативы для дифлуфензопира в России не установлены.

1. Погрешность измерений

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности Р = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1, для соответствующих диапазонов концентраций.

Таблица 1

Метрологические параметры

Таблица 2

Полнота извлечения дифлуфензопира, стандартное отклонение,
доверительный интервал среднего результата для n = 20, Р = 0,95

2. Метод измерений

Методика основана на определении дифлуфензопира методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием ультрафиолетового (УФ) детектора после его концентрирования из образцов воды на патроне с гидрофобным сорбентом с привитыми гексадецильными группами и извлечения из образцов почвы, зеленой массы, зерна и масла кукурузы щелочным водным ацетоном с последующей очисткой в системе несмешивающихся растворителей и на патронах для твердофазной экстракции.

Идентификация дифлуфензопира проводится по времени удерживания, количественное определение - методом абсолютной калибровки.

Избирательность метода обеспечивается сочетанием условий подготовки проб и хроматографирования.

3. Средства измерений, реактивы, вспомогательные
устройства и материалы

3.1. Средства измерений

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

3.2. Реактивы

Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очистки растворителей.

3.3. Вспомогательные устройства и материалы

Примечание. Допускается применение оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4. Требования безопасности

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-09, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.

4.2. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией, соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и ГН 2.2.5.2308-07.

Организация обучения работников безопасности груда - по ГОСТ 12.0.004-90.

5. Требования к квалификации операторов

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист-химик, имеющий опыт работы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, ознакомленный с руководством по эксплуатации хроматографа, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 13.

6. Условия измерений

При выполнении измерений выполняют следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 ± 5) °С и относительной влажности не более 80 %;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

7. Подготовка к определению

7.1. Кондиционирование колонки

Перед началом анализа аналитическую колонку кондиционируют в потоке подвижной фазы (0,1 - 0,2 см³/мин) до стабилизации нулевой линии.

7.2. Кондиционирование патрона № 1 с гидрофильным
слабокислотным сорбентом с постоянной активностью

Патрон промывают 2 см³ смеси № 2, затем 3 см³ этилацетата.

7.3. Кондиционирование патрона № 2 с гидрофобным сорбентом
с привитыми гексадецильными группами

Патрон последовательно промывают 2 см³ этилацетата, 2 см³ метанола, 3 см³ смеси № 3.

7.4. Приготовление растворов

7.4.1. 0,005 М раствор ортофосфорной кислоты: (0,5 ± 0,01) г 98 % ортофосфорной кислоты помещают в мерную колбу объемом 1 дм³, растворяют в бидистиллированной воде и доводят объем до метки.

7.4.2. Для приготовления подвижной фазы смешивают ацетонитрил с 0,005 М раствором ортофосфорной кислоты в соотношении 30:70 по объёму, используя мерные цилиндры.

7.4.3. 0,1 N раствор соляной кислоты: 1 см³ концентрированной соляной кислоты помещают в мерную колбу объемом 100 см³, растворяют в бидистиллированной воде и доводят объем до метки.

7.4.4. 0,5 % раствор натрия углекислого кислого: 0,5 г натрия углекислого кислого помещают в мерную колбу объемом 100 см³, растворяют в бидистиллированной воде и доводят объем до метки.

7.5. Приготовление основного и градуировочных растворов

7.5.1. Основной раствор с концентрацией 0,5 мг/см³: точную навеску дифлуфензопира (50 ± 0,5 мг) помещают в мерную колбу вместимостью 100 см³, растворяют в метаноле и доводят объем до метки метанолом.

7.5.2. Приготовление градуировочных растворов

Градуировочные растворы с концентрациями дифлуфензопира 0,05, 0,1, 0,2, 0,5 и 1,0 мкг/см³ готовят методом последовательного разбавления по объему, используя раствор подвижной фазы (смесь ацетонитрила и 0,005 М ортофосфорной кислоты в соотношении 30:70).

7.5.2.1. Раствор № 1 с концентрацией 1,0 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 100 см³ вносят 0,2 см³ основного раствора и доводят до метки подвижной фазой.

7.5.2.2. Раствор № 2 с концентрацией 0,5 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 5,0 см³ раствора № 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.5.2.3. Раствор № 3 с концентрацией 0,2 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 2 см³ раствора № 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.5.2.4. Раствор № 4 с концентрацией 0,1 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 1 см³ раствора № 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.5.2.5. Раствор № 5 с концентрацией 0,05 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 0,5 см³ раствора № 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

Основной раствор можно хранить в холодильнике при температуре 0 - 4 °С в течение 5 дней, градуировочные растворы использовать в день приготовления.

При изучении полноты определения дифлуфензопира используют ацетоновые растворы вещества, приготовленные из основного раствора методом последовательного разбавления по объему ацетоном.

7.6. Построение градуировочного графика

Для установления градуировочной характеристики (площадь пика -концентрация дифлуфензопира в растворе) в хроматограф вводят по 10 мм³ градуировочных растворов (не менее 3 параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4 точек по диапазону измеряемых концентраций). Затем измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации дифлуфензопира в градуировочном растворе.

Методом наименьших квадратов рассчитывают градуировочный коэффициент (K) в уравнении линейной регрессии:

S - площадь пика градуировочного раствора.

Градуировку признают удовлетворительной, если значение коэффициента линейной корреляции оказывается не ниже 0,99.

Градуировочную характеристику необходимо проверять при замене реактивов, хроматографической колонки или элементов хроматографической системы, а также при отрицательном результате контроля градуировочного коэффициента.

Градуировочную зависимость признают стабильной при выполнении следующего условия:

С - аттестованное значение массовой концентрации дифлуфензопира в градуировочном растворе,

С_K - результат контрольного измерения массовой концентрации дифлуфензопира в градуировочном растворе,

λ_контр. - норматив контроля градуировочного коэффициента, %. (λ_контр. = 10 % при Р = 0,95).

7.7. Проверка хроматографического поведения
дифлуфензопира на патроне № 1

В круглодонную колбу емкостью 10 см³ отбирают 1 см³ стандартного раствора дифлуфензопира с концентрацией 1 мкг/см³. Отдувают растворитель током азота. Остаток растворяют в 1 см³ этилацетата и переносят на подготовленный патрон (п. 7.2.). Колбу обмывают 1 см³ этилацетата и смыв тоже переносят на патрон. Промывают патрон 10 см³ смеси № 1, элюат отбрасывают. Затем элюируют дифлуфензопир смесью № 2 со скоростью 1 - 2 капли в секунду. Отбирают фракции по 2 см³, упаривают досуха, растворяют в 1 см³ подвижной фазы и анализируют по п. 9.6.

Фракции, содержащие дифлуфензопир, объединяют и вновь анализируют.

Устанавливают уровень вещества в элюате, определяют полноту вымывания с патрона и необходимый для очистки объем элюата.

7.8. Проверка хроматографического поведения
дифлуфензопира на патроне № 2

В кругло донную колбу емкостью 10 см³ отбирают 1 см³ стандартного раствора дифлуфензопира с концентрацией 1 мкг/см³. Отдувают растворитель током азота. Остаток растворяют в 10 см³ смеси № 3 и переносят на подготовленный патрон (п. 7.3). Колбу обмывают 5 см³ смеси № 3 и смыв тоже переносят на патрон. Патрон просушивают в течение 2 мин, затем элюируют дифлуфензопир порциями этилацетата по 2 см³ со скоростью 1 - 2 капли в секунду. Отбирают фракции, упаривают досуха, растворяют в 1 см³ подвижной фазы и анализируют по п. 9.6.

Фракции, содержащие дифлуфензопир, объединяют и вновь анализируют.

Устанавливают уровень вещества в элюате, определяют полноту вымывания с патрона и необходимый для очистки объем элюата.

Примечание. Проверку хроматографического поведения дифлуфензопира следует проводить обязательно, поскольку профиль вымывания может изменяться при использовании новой партии патронов и растворителей.

8. Отбор проб и хранение

Отбор проб производится в соответствии с «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов» (№ 2051-79 от 21.08.79), а также в соответствии с ГОСТ Р 51592-2000 «Вода. Общие требования к отбору проб»; ГОСТ 28168-89 «Почвы. Отбор проб»; ГОСТ 13634-90 «Кукуруза. Требования при заготовках и поставках» и ГОСТ 8808-91 «Масло кукурузное. ТУ».

Зерно кукурузы хранят в полотняных мешочках при комнатной температуре. Для исследовательских целей допускается получение масла в лаборатории из проб измельчённого зерна методом экстракции органическим растворителем при температуре не выше 40 °С. Пробы масла хранят при 4 - 6 °С в закрытой стеклянной или полиэтиленовой таре не более 30 суток.

Для длительного хранения пробы почвы подсушиваются при комнатной температуре в отсутствие прямого солнечного света. Сухие почвенные образцы могут храниться в течение года. Перед анализом сухую почву доводят до стандартной влажности, просеивают через сито с отверстиями диаметром 1 мм.

Зеленую массу для хранения помещают в герметичной полиэтиленовой упаковке в морозильную камеру с температурой -18 °С.

9. Проведение определения

9.1. Экстракция дифлуфензопира из воды

К 50 см³ воды добавляют 0,25 см³ трифторуксусиой кислоты и наносят на подготовленный по п. 7.3 патрон № 2. Патрон просушивают 2 мин, затем элюируют дифлуфензопир тремя порциями этилацетата по 2 см³. Растворитель упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 40 °С. Сухой остаток растворяют в 1 см³ подвижной фазы и 10 мм³ вводят в хроматограф.

9.2. Экстракция дифлуфензопира из почвы,
зеленой массы и зерна кукурузы

Навеску измельченной пробы (10 ± 0,1) г, зеленой массы 5 г помещают в полипропиленовую центрифужную пробирку вместимостью 50 см³, добавляют 10 см³ 0,5 %-го раствора натрия углекислого кислого и 30 см³ ацетона. Пробирку плотно закрывают и помещают в перемешивающее устройство на 10 мин, затем центрифугируют. Надосадочную жидкость декантируют в круглодонную колбу. Экстракцию повторяют 5 см³ 0,5 %-го раствора натрия углекислого кислого и 15 см³ ацетона. Объединенные фракции упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 40 °С до водного остатка. Остаток доводят до 50 см³ 0,5 %-м раствором натрия углекислого кислого, переносят в делительную воронку и очищают по п. 9.4.

9.3. Экстракция дифлуфензопира из масла кукурузы

К навеске масла (10 ± 0,1) г добавляют 10 см³ гексана и переносят в делительную воронку. Дифлуфензопир дважды экстрагируют порциями 0,5 %-го раствора натрия углекислого кислого по 25 см³. Объединенные щелочные экстракты очищают по п. 9.4.

9.4. Очистка в системе несмешивающихся растворителей

Щелочной экстракт последовательно промывают двумя порциями по 10 см³ гексана и двумя порциями по 10 см³ хлористого метилена. В случае плохого разделения слоев можно перенести эмульсию в центрифужную пробирку и центрифугировать в течение 5 мин при скорости 4000 об./мин. Водный слой подкисляют 0,1 N соляной кислотой до pH = 1 и дифлуфензопир экстрагируют двумя порциями по 30 см³ хлористого метилена. Метиленовые фракции собирают в круглодонную колбу, пропуская через слой безводного сульфата натрия, и растворитель упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 40 °С. Сухой остаток подвергают очистке на патроне № 1 по п. 9.5.

9.5. Очистка на патроне № 1

Сухой остаток, полученный по п. 9.4, растворяют в 1 см³ этилацетата, наносят на предварительно кондиционированный патрон (п. 7.2), колбу ополаскивают 1 см³ этилацетата и также наносят на патрон. Патрон промывают 10 см³ смеси № 1, элюат отбрасывают. Дифлуфензопир элюируют 5 см³ смеси № 2, элюат собирают, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе, остаток растворяют в 1 см³ подвижной фазы и 10 мм³ вводят в хроматограф.

Примечание. Ввиду нестабильности аналита хранение экстрактов подготовленных проб не допускается. Пробоподготовку и анализ следует проводить в один день.

9.6. Условия хроматографирования

Ультраэффективный жидкостный хроматограф с быстросканирующим УФ-детектором, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки. Аналитическая колонка, заполненная сорбентом с привитой фазой, включающей гидрофильную карбаматную группу в цепи С18, (100×2,1) мм, 1,7 мкм. Температура колонки (30 ± 1) °С. Подвижная фаза: ацетонитрил и 0,005 М ортофосфорная кислота в соотношении 30:70 (от 0 до 1 мин); далее градиент от 30:70 до 70:30 (от 1 до 8 мин). Скорость потока элюента: 0,2 см³/мин. Рабочая длина волны УФ-детектора 287 нм. Объем вводимой пробы 10 мм³. Время удерживания дифлуфензопира (5,1 ± 0,1) мин.

10. Обработка результатов анализа

Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки. Содержание дифлуфензопира в пробе (X, мг/кг) вычисляют по формуле:

S_x - площадь пика дифлуфензопира на хроматограмме испытуемого образца, мм² (AU);

K - градуировочный коэффициент, найденный на стадии построения соответствующей градуировочной зависимости;

V - объём пробы, подготовленной для хроматографического анализа, см³;

Р - навеска анализируемого образца, г;

f - полнота извлечения дифлуфензопира, приведенная в табл. 2, %.

Содержание остаточных количеств дифлуфензопира в образце вычисляют как среднее из двух параллельных определений.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор дифлуфензопира с концентрацией 1,0 мкг/см³, разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ.

11. Проверка приемлемости результатов
параллельных определений

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

X₁, Х₂ - результаты параллельных определений, мг/кг;

r - значение предела повторяемости (r = 2,8σ_r).

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

12. Оформление результатов

Результат анализа представляют в виде:

 - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

Δ - граница абсолютной погрешности, мг/кг;

δ - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

В случае если содержание компонента меньше нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

«содержание вещества в пробе «менее нижней границы определения» (например: менее 0,01 мг/кг*, где * - 0,01 мг/кг - предел обнаружения дифлуфензопира в почве).

13. Контроль качества результатов измерений

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-02 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

Величина добавки С_д должна удовлетворять условию:

±Δ_л,Х (±Δ_л,Хʹ) - характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой, соответственно), мг/кг; при этом:

Δ - граница абсолютной погрешности, мг/кг:

δ - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

Результат контроля процедуры К_к рассчитывают по формуле:

Xʹ, X, С_д - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки, соответственно, мг/кг.

Норматив контроля К рассчитывают по формуле:

Проводят сопоставление результата контроля процедуры (К_к) с нормативом контроля (К).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

X₁, Х₂ - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций), %.