4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Определение остаточных количеств
моксидектина в молоке и мясе
методом высокоэффективной
жидкостной хроматографии

Методические указания
МУК 4.1.3244-14

Москва 2015

1. Разработаны ФБУН «Федеральный научный центр гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана» Роспотребнадзора (В.Н. Ракитский, Т.В. Юдина, Н.Е. Федорова, В.Н. Волкова).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 6 ноября 2014 г. № 2).

3. Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 29 декабря 2014 г.

4. Введены впервые.

СОДЕРЖАНИЕ

 

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Определение остаточных количеств моксидектина
в молоке и мясе методом высокоэффективной
жидкостной хроматографии

Свидетельство об аттестации № РОСС RU.0001.310430/0198.14.07.14 от 14.07.2014.

Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения массовой концентрации моксидектина в молоке и мясе в диапазоне 0,005 - 0,10 мг/кг.

Методические указания носят рекомендательный характер.

Моксидектин

(10Е,14Е,16Е)-(1R,4S,5'S,6R,6'S,8R13R20R,21R,24S)-6'-[(1E)-1,3-диметилбут-1-енил]-21,24-дигидрокси-5',11,13,22-тетраметил-(3,7,19-триоксатетрацикло [15.6.1.14,8.020,24] пентакоза-10,14,16,22-тетраен)-6-спиро-2'-(тетрагидропиран)-2,4'-дион4'-(Е)-(О-метилоксим) (ИЮПАК).

Структурная формула:

Брутто формула: С₃₇Н₅₃NO₈.

Молекулярная масса 639,82.

Белое или светло желтое кристаллическое вещество. Температура плавления 145 - 154 °С. Хорошо растворим в полярных органических растворителях. Растворимость в воде 0,51 мг/дм³. Моксидектин - слабое основание, рКа < 2.

Краткая токсикологическая характеристика. Острая пероральная токсичность (LD₅₀) для крыс > 106 мг/кг; острая дермальная токсичность (LD₅₀) для кроликов > 2000 мг/кг.

Область применения препарата. Моксидектин - полусинтетический ветеринарный препарат, обладающий инсектицидной активностью широкого спектра, рекомендуется к применению в качестве антипаразитарного и антигельминтного препарата для сельскохозяйственных животных.

1. Метрологические характеристики

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и её составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности Р = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

Таблица 1

Метрологические параметры

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для всего диапазона измерений (n = 20) приведены в табл. 2.

Таблица 2

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение,
доверительный интервал среднего результата

2. Метод измерений

Методика основана на определении моксидектина с использованием обращено-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с флуориметрическим детектором после извлечения вещества из анализируемой пробы молока и мяса ацетонитрилом, очистки экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей, превращения моксидектина во флуорогенное производное. Экстракты мяса после дериватизации подвергают дополнительной очистке на патроне для твердофазной экстракции на основе силикагеля.

Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.

3. Средства измерений, вспомогательные устройства,
реактивы и материалы

3.1. Средства измерений

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

3.2. Реактивы

Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очистки растворителей.

3.3. Вспомогательные средства измерений, устройства и материалы

Примечание. Допускается использование вспомогательных средств измерений, устройств и материалов с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4. Требования безопасности

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ Р 12.1.019-09, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и 2.2.5.2308-07. Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004-90.

5. Требования к квалификации оператора

К выполнению измерений допускают специалиста, прошедшего обучение, освоившего методику, владеющего техникой имеющего опыт работы на жидкостном хроматографе и подтвердившего соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 13.

6. Условия измерений

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 ± 5) °С и относительной влажности не более 80 %;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

7. Подготовка к выполнению измерений

Измерениям предшествуют следующие операции: очистка органических растворителей (при необходимости), приготовление реактива для дериватизации, градуировочных растворов, раствора внесения, подвижной фазы для ВЭЖХ, кондиционирование хроматографической колонки, установление градуировочной характеристики, подготовка патронов для очистки экстрактов.

7.1. Очистка органических растворителей

7.1.1. Ацетонитрил

Ацетонитрил кипятят с обратным холодильником над пентоксидом фосфора (на 1 дм³ ацетонитрила 20 г пентоксида фосфора) не менее 1 часа, после чего перегоняют, непосредственно перед употреблением ацетонитрил повторно перегоняют над прокаленным карбонатом калия (на 1 дм³ ацетонитрила 10 г карбоната калия).

7.1.2. н-Гексан

Растворитель последовательно промывают порциями концентрированной серной кислоты, до тех пор, пока она не перестанет окрашиваться в желтый цвет, затем водой до нейтральной реакции промывных вод, перегоняют над прокаленным карбонатом калия.

7.2. Подготовка подвижной фазы для ВЭЖХ

7.2.1. Приготовление 0,1 %-го раствора ортофосфорной кислоты.

В мерную колбу вместимостью 500 см³ помещают 250 - 300 м³ деионизованной воды, вносят 0,5 см³ ортофосфорной кислоты, доводят водой до метки, перемешивают.

7.2.2. Приготовление подвижной фазы.

В мерную колбу вместимостью 1000 см³ помещают 950 см³ ацетонитрила и 50 см³ 0,1 %-го раствора ортофосфорной кислоты, перемешивают, фильтруют и дегазируют.

Подвижную фазу хранят в темном месте (в емкости из темного стекла) не более 30 дней.

7.3. Приготовление реактива для дериватизации

Смешивают трифторуксусный ангидрид и свежеперегнанный ацетонитрил в объемном соотношении 1:2. Реактив годен в течение рабочего дня.

7.4. Кондиционирование хроматографической колонки для ВЭЖХ

Промывают колонку подвижной фазой (приготовленной по п. 7.2.) при скорости подачи растворителя 1,0 см³/мин до установления стабильной базовой линии.

7.5. Приготовление градуировочных растворов и раствора внесения

7.5.1. Исходный раствор моксидектина для градуировки (концентрация 100 мкг/см³). В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 0,0100 г моксидектина, растворяют в 50 - 60 см³ ацетонитрила, доводят ацетонитрилом до метки, тщательно перемешивают.

Раствор хранят в холодильнике (защищенном от света месте) при температуре 5 °С в течение месяца.

Растворы № 1 - 6 готовят объемным методом путем последовательного разбавления исходного раствора для градуировки.

7.5.2. Раствор № 1 моксидектина для градуировки и внесения (концентрация 1 мкг/см³). В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 1 см³ исходного раствора моксидектина с концентрацией 100 мкг/см³ (п. 7.5.1), разбавляют ацетонитрилом до метки.

Раствор хранят в холодильнике (защищенном от света месте) при температуре (4 ± 2) °С в течение месяца.

Этот раствор используют для приготовления проб мяса и молока с внесением моксидектина при оценке полноты извлечения вещества методом «внесено-найдено», а также контроле качества результатов измерений методом добавок.

7.5.3. Рабочие растворы № 2 - 6 моксидектина для градуировки (концентрация 0,005 - 0,1 мкг/см³). В 5 мерных колб вместимостью 100 см³ помещают по 0,5, 1,0, 2,0, 5,0 и 10 см³ градуировочного раствора № 1 с концентрацией 1 мкг/см³ (п. 7.5.2), доводят до метки ацетонитрилом, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы № 2 - 6 с концентрацией моксидектина 0,005, 0,01; 0,02; 0,05 и 0,1 мкг/см³ соответственно.

Растворы хранят в холодильнике (защищенном от света месте) при температуре (4 ± 2) °С в течение месяца.

7.5.4. Рабочие растворы № 2а - 6а флуорогенного производного моксидектина для градуировки (соответствуют содержанию моксидектина 0,005 - 0,1 мкг). В 5 градуированных пробирок вместимостью 5 см³ вносят по 1 см³ каждого из 5 рабочих растворов моксидектина № 2 - 6 (п. 7.5.3), прибавляют по 0,1 см³ 1-N-метилимидазола, перемешивают. Смесь охлаждают до 0 - 5 °С, помещая пробирки в ледяную баню, добавляют по каплям 0,3 см³ реактива для дериватизации (приготовленного по п. 7.3), перемешивают и выдерживают час при комнатной температуре. Затем в каждую пробирку вносят по 2 см³ ацетонитрила, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы № 2а - 6а флуорогенного производного с содержанием моксидектина 0,005, 0,01; 0,02; 0,05 и 0,1 мкг соответственно.

Растворы хранят в холодильнике (защищенном от света месте) при температуре (4 ± 2) °С в течение месяца. Срок хранения растворов при комнатной температуре в темноте - не более суток.

7.6. Установление градуировочной характеристики

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пика (единицы люминесценции - ЕЛ⋅с) от содержания моксидектина в растворе (мкг), устанавливают методом абсолютной калибровки по 5 растворам флуорогенного производного моксидектина № 2а - 6а для градуировки.

В инжектор хроматографа вводят по 50 мм³ каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.4. Осуществляют не менее 3 параллельных измерений.

7.7. Подготовка патрона для очистки экстрактов

Патрон для твердофазной экстракции устанавливают на аллонж с прямым отводом для вакуума*, сверху в патрон вставляют шприц с разъемом Льюера объемом не менее 10 см³, используемый в качестве емкости для элюента.

________

* В отсутствии специального аллонжа, жидкость продавливают через патрон с помощью шприца медицинского, скорость продавливания раствора не должна превышать 1 - 2 капли в секунду.

Концентрирующий патрон промывают 5 см³ метанола, высушивают пропусканием воздуха (с использованием вакуума) в течение 5 мин. Затем через патрон пропускают 5 см³ гексана. Процедуру проводят с использованием вакуума, скорость потока растворов через патрон не должна превышать 5 см³/мин, при этом нельзя допускать высыхания поверхности патрона.

8. Отбор и хранение проб

Отбор проб продуктов питания осуществляется в соответствии с требованиями ГОСТ на исследуемые продукты: ГОСТ 7269-79 «Мясо. Методы отбора образцов и органолептические методы определения свежести», ГОСТ 3622-68 «Молоко и молочные продукты. Отбор проб и подготовка их к испытанию».

Обобранные образцы продуктов герметично упаковывают в полиэтиленовые мешки, стеклянные банки с притертыми крышками. Образцы анализируют непосредственно после отбора проб или хранят в морозильной камере при -20 °С.

Перед анализом образцы мяса массой 200 - 300 г тщательно измельчают с использованием гомогенизатора. Пробу гомогенизированного образца массой 10 г, а также молока массой 5 г взвешивают на аналитических весах в плоскодонных колбах вместимостью 250 см³.

9. Выполнение определения

9.1. Экстракция

К пробе гомогенизированного образца мяса массой 10 г или молока массой 5 г, помещенной в колбу вместимостью 250 см³, приливают 100 см³ ацетонитрила, тщательно перемешивают путем встряхивания, выдерживают на ультразвуковой бане 5 мин, помещают на встряхиватель на 30 мин, дополнительно выдерживают на ультразвуковой бане 5 мин и снова помещают на встряхиватель на 30 мин.

Колбы с экстрактами помещают на 30 мин в морозильную камеру. Затем надосадочную жидкость переносят в делительную воронку вместимостью 250 см³, фильтруя ее через тампон из стекловаты, помещенный в конусную химическую воронку. Добавляют 70 см³ гексана, интенсивно встряхивают в течение 1 мин. После полного разделения фаз нижний ацетонитрильный слой сливают в круглодонную колбу и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не более 40 °С. Сухой остаток растворяют в смеси 14 см³ ацетонитрила и 56 см³ воды, помещая на ультразвуковую баню на 1 мин. Раствор переносят в делительную воронку вместимостью 250 см³, добавляют 70 см³ гексана, интенсивно встряхивают воронку в течение 1 мин. Верхний органический слой собирают в круглодонную колбу вместимостью 250 см³. Водно-ацетонитрильную фазу вновь переносят в делительную воронку и повторяют операцию экстракции, используя 70 см³ гексана.

Объединенную органическую фазу упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не более 40 °С. Сухой остаток растворяют в 5 см³ ацетонитрила. Аликвоту раствора объемом 1 см³, (1/5 часть пробы, эквивалентная 1 г молока и 2 г мяса) переносят в градуированную пробирку на 5 см³ и подвергают дериватизации по п. 9.2.

9.2. Дериватизации

К ацетонитрильному раствору прибавляют 0,1 см³ 1-N-метилимидазола, перемешивают. Смесь охлаждают до 0 - 5 °С, помещая колбу в ледяную баню, добавляют по каплям 0,3 см³ реактива для дериватизации (п. 7.3), перемешивают и выдерживают час при комнатной температуре. Затем в пробирку вносят по 2 см³ ацетонитрила, тщательно перемешивают.

Дериватизированные экстракты проб молока анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.4.

Дериватизированные экстракты проб мяса подвергают дополнительной очистке по п. 9.3.

9.3. Очистка экстракта

Аликвоту раствора после дериватизации объемом 1,7 см³ переносят в градуированную пробирку вместимостью 10 см³, добавляют 5 см³ гексана, интенсивно встряхивают в течение 1 мин, верхний гексановый слой отбирают с помощью пипетки, перенося в колбу вместимостью 25 см³, операцию экстракции повторяют новой порцией гексана объемом 5 см³. Верхний гексановый слой также переносят в колбу, объединяя с первым экстрактом. Объединенный гексановый экстракт вносят на патрон для твердофазной экстракции, подготовленный по п. 7.7. Скорость прохождения раствора через патрон не должна превышать 1 - 2 капли в секунду. Элюат собирают непосредственно в круглодонную колбу.

Флуорогенное производное моксидектина дополнительно элюируют с патрона 5 см³ гексана, также объединяя элюат с первой порцией в круглодонной колбе. Раствор упаривают досуха при температуре не выше 35 °С. Остаток в колбе растворяют в 1,7 см³ ацетонитрила и анализируют на содержание моксидектина по п. 9.4.

9.4. Условия хроматографирования

Измерения выполняют при следующих режимных параметрах.

Жидкостный хроматограф с флуориметрическим детектором с переменной длиной волны, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником, термостатом колонки.

Длина волны: возбуждение 365 нм;

эмиссия 470 нм.

Хроматографическая колонка стальная длиной 150 мм, внутренним диаметром 4,6 мм, заполненная обращенно-фазным сорбентом с привитыми монофункциональными полярными группами С18, зернением 5 мкм.

Температура колонки: 35 °С.

Скорость потока элюента: 1,0 см³/мин.

Объем вводимой пробы: 50 мм³.

Подвижная фаза: ацетонитрил - 0,1 % ортофосфорная кислота (95:5, по объему).

Линейный диапазон детектирования 0,25 - 2,5 нг.

Пробу вводят в инжектор хроматографа. Устанавливают площадь пика флуорогенного производного моксидектина.

Образцы, дающие пики большие, чем градуировочный раствор флуорогенного производного моксидектина с содержанием 0,1 мкг, разбавляют ацетонитрилом (не более чем в 50 раз).

10. Обработка результатов анализа

Содержание моксидектина в пробах (X, мг/кг) рассчитывают по формуле:

S_пp. - площадь пика флуорогенного производного моксидектина в анализируемом образце (ЕЛ⋅с);

С - содержание моксидектина в градуировочном растворе, мкг;

S_np. - площадь пика флуорогенного производного моксидектина в градуировочном растворе (ЕЛ⋅с);

m - масса анализируемого образца, г;

D - коэффициент, учитывающий объем экстракта, взятого для анализа, D = 5 (молоко); D = 10 (мясо).

11. Проверка приемлемости результатов
параллельных определений

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предел повторяемости:

X₁, Х₂ - результаты параллельных определений, мг/кг;

r - значение предела повторяемости (табл. 1), при этом r = 2,8σ_r.

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

12. Оформление результатов

Результат анализа представляют в виде:

 - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

Δ - граница абсолютной погрешности, мг/кг:

δ - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

Если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

«содержание моксидектина в пробах молока и мяса - менее 0,005 мг/кг»*.

________

* - 0,005 мг/кг - предел обнаружения.

13. Контроль качества результатов измерений

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-02 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».

13.1. Контроль стабильности градуировочной характеристики.

Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят в начале и по окончании каждой серии анализов.

При контроле стабильности градуировочной характеристики проводят измерения не менее двух образцов концентраций для градуировки, содержание моксидектина в которых должно охватывать весь диапазон от 0,005 до 0,1 мкг.

Градуировочная характеристика считается стабильной, если для каждого градуировочного раствора, используемого для контроля, сохраняется соотношение:

X - содержание моксидектина в пробе при контрольном измерении, мкг;

С - известное содержание моксидектина в градуировочном растворе, взятом для контроля стабильности градуировочной характеристики, мкг;

В - норматив контроля погрешности градуировочной характеристики, % (равен 10 % при Р = 0,95).

Если величина расхождения (А) превышает 10 %, делают вывод о невозможности применения градуировочной характеристики для дальнейших измерений. В этом случае выясняют и устраняют причины нестабильности градуировочной характеристики и повторяют контроль ее стабильности с использованием других градуировочных растворов флуорогенного производного моксидектина, предусмотренных МВИ. При повторном обнаружении нестабильности градуировочной характеристики устанавливают ее заново согласно п. 7.6.

Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом добавок.

Величина добавки С_д должна удовлетворять условию:

 - характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно), мг/кг.

Допустимо характеристику погрешности результатов анализа при внедрении методики в лаборатории устанавливать на основе выражения Δ_л = ±0,84Δ с последующим уточнением по мере накопления информации:

Δ - граница абсолютной погрешности, мг/кг:

δ - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

Контроль проводят путем сравнения результата контрольной процедуры К_к с нормативом контроля К.

Результат контрольной процедуры К_к рассчитывают по формуле:

, С_д - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки соответственно, мг/кг.

Норматив контроля К рассчитывают по формуле:

Проводят сопоставление результата контрольной процедуры (К_к) с нормативом контроля (К).

Если результат контрольной процедуры удовлетворяет условию

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (3) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (3) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), не должно превышать предел воспроизводимости (R):

X₁, Х₂ - результаты измерений, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), мг/кг;

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.