4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Определение остаточных количеств
индоксакарба в зеленой массе, зерне и
масле кукурузы, в семенах и масле
подсолнечника, в зеленой массе и
корнеплодах сахарной свеклы методом
высокоэффективной жидкостной
хроматографии

Методические указания
МУК 4.1.3206-14

Москва 2015

1. Разработаны Российским государственным аграрным университетом - МСХА им. К.А. Тимирязева, Учебно-научный консультационный центр «Агроэкология пестицидов и агрохимикатов» Минсельхоза России (В.А. Калинин, Е.В. Довгилевич, А.В. Довгилевич, Е.Н. Тестова).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 26 июня 2014 г. № 1).

3. Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 30 июля 2014 г.

4. Введены впервые.

СОДЕРЖАНИЕ

 

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Определение остаточных количеств индоксакарба
в зеленой массе, зерне и масле кукурузы, в семенах и
масле подсолнечника, в зеленой массе и корнеплодах
сахарной свеклы методом высокоэффективной
жидкостной хроматографии

Свидетельство о метрологической аттестации № 01.00282-2008/0168.27.05.13 от 27.05.2013.

Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения уровня остаточных количеств индоксакарба в зеленой массе кукурузы в диапазоне 0,1 - 1,0 мг/кг, в зерне и масле кукурузы в диапазоне 0,01 - 0,10 мг/кг, в семенах и масле подсолнечника в диапазоне 0,02 - 0,20 мг/кг, а также в корнеплодах сахарной свеклы в диапазоне 0,05 - 0,50 мг/кг и в зеленой массе сахарной свеклы в диапазоне 0,5 - 5,0 мг/кг.

Методические указания носят рекомендательный характер.

Название действующего вещества по ИСО: индоксакарб.

Название действующего вещества по ИЮПАК: Метил(S)-N-[7-хлоро-2,3,4а,5-тетрагидро-4а-(метоксикарбонил)индено[1,2-е] [1,3,4] оксадиазин-2-илкарбонил]-4'-(трифторметокси) карбанилат.

Структурная формула:

Эмпирическая формула: C₂₂H₁₇ClF₃N₃O₇.

Молекулярная масса: 527,8.

Агрегатное состояние: порошок.

Цвет, запах: белого цвета.

Давление паров: 2,5×10^-5 мПа (25 °С).

Коэффициент распределения октанол/вода (при 25 °С): K_owlogP = 4,65.

Температура плавления: 88,1 °С.

Растворимость в воде (мг/дм³, 25 °С): 0,2.

Растворимость в органических растворителях (г/дм³, при 25 °С): ацетон - более 250; ацетонитрил - 139; метанол - 103; н-октанол - 14,5.

Гидролитически стоек в кислой и нейтральной среде с ДТ₅₀ более 30 дней (pH 5), 38 дней (pH 7), но быстро разрушается в щелочном растворе ДТ₅₀ 1 день (при pH 9).

В почве индоксакарб умеренно персистентен, в аэробных условиях ДТ₅₀ от 3 до 23 дней, в анаэробных условиях ДТ₅₀ 186 дней. В илистой почве ДТ₅₀ 17 дней.

Краткая токсикологическая характеристика. Индоксакарб относится к умеренно опасным веществам по острой пероральной (ЛД₅₀ для крыс от 268 до 1732 мг/кг) и по ингаляционной токсичности (ЛК₅₀ для крыс (4 ч) более 2000 мг/м³) и к мало опасным веществам по дермальной токсичности (ЛД₅₀ для кроликов более 5000 мг/кг). Не раздражает слизистую глаз и кожу кроликов.

Область применения. Индоксакарб - инсектицид из класса оксадиазинов контактного и кишечного действия, блокирует натриевые каналы нервных волокон активным S-изомером. Насекомые прекращают питаться, у них нарушается координация, наступает паралич и затем смерть.

Применяется для борьбы с широким спектром различных бабочек на хлопчатнике, овощных культурах и в фруктовых садах при нормах расхода 12,5 - 125,0 г/га.

Проходит регистрационные испытания в России в качестве инсектицида для борьбы с вредителями яблоневых садов и виноградников с нормой расхода 0,4 - 0,5 л/га и пятью обработками за сезон.

В России установлены следующие гигиенические нормативы:

ДСД - 0,01 мг/кг массы человека;

ОДК в почве - 0,9 мг/кг;

ПДК в воде водоемов - 0,015 мг/дм³;

ОБУВ в воздухе рабочей зоны - 0,3 мг/м³;

ОБУВ в атмосферном воздухе - 0,005 мг/м³;

МДУ в продукции (мг/кг): яблоки - 0,5; томаты - 0,5; семена и масло рапса - 0,05; лук - 2,0.

МДУ в импортируемой продукции (мг/кг): семена и масло подсолнечника - 0,05; зерно и масло кукурузы - 0,02; корнеплоды сахарной свеклы - 0,1.

1. Погрешность измерения

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности Р = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительные интервалы среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в табл. 2.

Таблица 1

Метрологические параметры для индоксакарба

Таблица 2

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение,
доверительный интервал среднего результата для индоксакарба

2. Метод измерений

Метод основан на определении индоксакарба с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием ультрафиолетового диодно-матричного детектора после его экстракции из образцов органическим растворителем, очистки экстракта перераспределением между двумя несмепшвающимися фазами, на колонках с окисью алюминия, на концентрирующих патронах № 1 и на колонках с флорозилом.

Идентификация веществ проводится по времени удерживания, а количественное определение - методом абсолютной калибровки.

В предлагаемых условиях анализа метод специфичен. Специфичность обеспечивается подбором состава подвижной фазы и выбором колонок различной полярности.

3. Средства измерений, реактивы, вспомогательные
устройства и материалы

3.1. Средства измерений

Примечание. Допускается использование средств измерений с аналогичными или лучшими характеристиками.

3.2. Реактивы

Примечание. Допускается использование реактивов с аналогичными или лучшими характеристиками.

3.3. Вспомогательные устройства и материалы

Примечание. Допускается применение оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4. Требования безопасности

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ Р 12.1.019-09, а также требования, изложенные в технической документации на газовый хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 «Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны». Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004-91.

5. Требования к квалификации операторов

К выполнению измерений и обработке их результатов допускаются специалисты, имеющие опыт работы в химической лаборатории, прошедшие обучение и владеющие техникой проведения анализа, освоившие метод анализа в процессе тренировки и уложившиеся в нормативы контроля при проведении процедуры контроля погрешности анализа.

6. Условия измерений

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 ± 5) °С, относительной влажности не более 80 % и нормальном атмосферном давлении;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

7. Подготовка к выполнению определений

Выполнению измерений предшествуют следующие операции: очистка растворителей (при необходимости), приготовление растворов, кондиционирование хроматографической колонки, подготовка колонок с окисью алюминия и концентрирующих патронов № 1 для очистки экстракта, проверка хроматографического поведения вещества на колонках с окисью алюминия и на концентрирующих патронах № 1, установление градуировочной характеристики.

7.1. Подготовка органических растворителей

7.1.1. Очистка ацетонитрила

Ацетонитрил, содержащий воду, предварительно осушают, добавляя в него гранулированный безводный хлористый кальций из расчета не менее 100 г/дм³. Выдерживают его над осушителем в течение 5 - 6 ч. Затем ацетонитрил сливают с осушителя в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 см³ аппарата для перегонки растворителей.

Ацетонитрил перегоняют при температуре 81,5 °С, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 81,5 °С, отбрасывают.

7.1.2. Приготовление бидистиллированной воды

Дистиллированную воду помещают в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 см³ аппарата для перегонки растворителей, добавляют к ней марганцово-кислый калий из расчета 1 г/дм³ и кипятят в течение 6 ч.

Собирают фракции, отогнанные при температуре 100,0 °С, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 100,0 °С, отбрасывают.

7.2. Приготовление растворов для проведения анализа

7.2.1. Приготовление подвижной фазы для ВЭЖХ

Для приготовления подвижной фазы используют свежеперегнанные ацетонитрил и очищенную воду.

В плоскодонную колбу объемом 1000 см³ помещают 700 см³ ацетонитрила и 300 см³ очищенной воды. Смесь тщательно перемешивают, пропускают через нее газообразный гелий со скоростью 20 см³/мин в течение 5 мин, после чего помещают в ультразвуковую ванну для удаления растворенных газов на 1 мин. Готовый раствор подвижной фазы хранят при комнатной температуре не более 7 суток.

7.2.2 Приготовление градуировочных растворов

7.2.2.1. Стандартный раствор № 1 с концентрацией индоксакарба 1,0 мг/см³.

Взвешивают 50 мг индоксакарба в мерной колбе объемом 50 см³. Навеску растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки ацетонитрилом. Полученный стандартный раствор № 1 используется для приготовления стандартных растворов для хроматографического исследования и установления градуировочной характеристики. Стандартный раствор № 1 хранится в холодильнике в течение 6 месяцев.

7.2.2.2. Стандартный раствор № 2 с концентрацией индоксакарба 10,0 мкг/см³.

Из стандартного раствора № 1 отбирают пипеткой 1 см³, помещают в мерную колбу объемом 100 см³ и доводят объем до метки ацетонитрилом. Стандартный раствор № 2 используется даю внесения в контрольные образцы и для приготовления стандартных растворов для установления градуировочной характеристики. Стандартный раствор № 2 хранится в холодильнике не более 30 суток.

7.2.2.3. Стандартный раствор № 3 с концентрацией индоксакарба 1,0 мкг/см³.

Из стандартного раствора № 2 отбирают пипеткой 1 см³, помещают в мерную колбу объемом 10 см³ и доводят объем до метки смесью ацетонитрила с водой в соотношении 1:1. Стандартный раствор № 3 используется для установления градуировочной характеристики и хранится в холодильнике не более 15 суток.

7.2.2.4. Стандартный раствор № 4 с концентрацией индоксакарба 0,5 мкг/см³.

Из стандартного раствора № 3 отбирают пипеткой 5 см³, помещают в мерную колбу объемом 10 см³ и доводят объем до метки смесью ацетонитрила с водой в соотношении 1:1. Стандартный раствор № 4 используется для установления градуировочной характеристики и хранится в холодильнике не более 15 суток.

7.2.2.5. Стандартный раствор № 5 с концентрацией индоксакарба 0,2 мкг/см³.

Из стандартного раствора № 2 отбирают пипеткой 1 см³, помещают в мерную колбу объемом 50 см³ и доводят объем до метки смесью ацетонитрила с водой в соотношении 1:1. Стандартный раствор № 5 используется для установления градуировочной характеристики и хранится в холодильнике не более 15 суток.

7.2.2.6. Стандартный раствор № 6 с концентрацией индоксакарба 0,1 мкг/см³.

Из стандартного раствора № 2 отбирают пипеткой 1 см³, помещают в мерную колбу объемом 100 см³ и доводят объем до метки смесью ацетонитрила с водой в соотношении 1:1. Стандартный раствор № 6 используется для установления градуировочной характеристики и хранится в холодильнике не более 15 суток.

7.2.2.7. Стандартные растворы с концентрацией индоксакарба 25,0; 10,0; 5,0; 2,5; 2,0; 1,0; 0,5; 0,4; 0,25 и 0,2 мкг/см³ для внесения в контрольные образцы.

Методом последовательного разведения ацетонитрилом готовят растворы, содержащие по 2,5; 2,0; 1,0; 0,5; 0,4; 0,25 и 0,2 мкг/см³ и используют эти растворы с целью внесения в контрольные образцы.

Методом последовательного разведения ацетоном готовят растворы, содержащие по 2,0; 1,0; 0,4 и 0,2 мкг/см³ и используют эти растворы для внесения в контрольные образцы масла.

Стандартные растворы для внесения в контрольные образцы хранятся в холодильнике не более 30 суток.

7.3. Установление градуировочной характеристики

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади (высоты) пика от концентрации индоксакарба в растворе (мкг/см³), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4 растворам для градуировки с концентрацией 1,0; 0,5; 0,2 и 0,1 мкг/см³.

В инжектор хроматографа вводят по 10 мм³ каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.7. Осуществляют не менее 5 параллельных измерений.

7.4. Подготовка колонки с окисью алюминия для очистки экстракта
и проверка хроматографического поведения индоксакарба на ней

7.4.1. Подготовка колонки с окисью алюминия для очистки экстракта

В пластиковую или стеклянную колонку диаметром 15 мм помещают 3 г окиси алюминия с зернением 40/250 меш. и, аккуратно постукивая по стенкам колонки, формируют слой адсорбента. Непосредственно перед использованием колонку промывают 10 см³ ацетонитрила.

7.4.2. Проверка хроматографического поведения индоксакарба
на колонке с окисью алюминия

В концентратор объемом 100 см³ вносят 1 см³ стандартного раствора индоксакарба в ацетонитриле с концентрацией 1,0 мкг/см³ и выпаривают его досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С. Сухой остаток растворяют в 10 см³ ацетонитрила, тщательно обмывают стенки концентратора и наносят на подготовленную колонку. Элюат собирают в концентратор и выпаривают досуха при температуре не выше 30 °С.

Исходную колбу обмывают еще двумя порциями ацетонитрила объемом по 10 см³ каждая и последовательно вносят их на колонку. Каждую порцию собирают отдельно в концентраторы объемом по 100 см³ и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.

Сухой остаток каждой фракции растворяют в 2 см³ смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 и 10 мм³ пробы вводят в хроматограф.

Определяют фракции, содержащие индоксакарб, полноту смывания с колонки и необходимый объём элюента.

Изучение поведения индоксакарба на колонке проводят каждый раз при отработке методики или поступлении новой партии окиси алюминия.

7.5. Подготовка концентрирующих патронов № 1 для очистки
экстракта и проверка хроматографического поведения
индоксакарба на них

7.5.1. Подготовка концентрирующих патронов № 1 для очистки экстракта

Все процедуры происходят с использованием вакуума, скорость потока растворов через патрон не должна превышать 5 см³/мин (1 - 2 кап./с).

Патрон № 1 устанавливают на алонж с отводом для вакуума, сверху в патрон вставляют шприц с разъемом типа Люэр объемом не менее 10 см³ (используют как емкость для элюентов).

Кондиционирование: концентрирующий патрон промывают 5 см³ смеси ацетонитрила с водой соотношении 3:1, затем 10 см³ воды. Элюаты отбрасывают.

Нельзя допускать высыхания поверхности патрона.

7.5.2. Проверка хроматографического поведения индоксакарба
на концентрирующих патронах № 1

Из стандартного раствора индоксакарба в ацетонитриле, содержащего 1 мкг/см, отбирают 1 см³, помещают в концентратор объемом 100 см³ и выпаривают на ротационном вакуумном испарителе досуха при температуре не выше 30 °С. Сухой остаток растворяют в 1 см³ ацетонитрила, тщательно обмывая стенки концентратора, прибавляют 9 см³ воды, перемешивают и вносят на патрон. Элюат собирают в концентратор, выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе досуха при температуре не выше 30 °С, сухой остаток растворяют в 2 см³ смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 и хроматографируют.

Исходный концентратор обмывают последовательно 10 см³ смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:4, затем тремя порциями по 5 см³ смеси ацетонитрила с водой в соотношении 3:1, полученные растворы последовательно вносят на патрон. Элюат после прохождения каждой порции элюентов собирают в отдельные концентраторы объемом по 100 см, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С, сухой остаток растворяют в 2 см³ смеси ацетонитрила с водой и хроматографируют.

Определяют фракции, содержащие индоксакарб, полноту смывания с патрона и необходимый объём элюента.

Изучение поведения индоксакарба на концентрирующих патронах № 1 проводят каждый раз при отработке методики или поступлении новой партии концентрирующих патронов.

7.6. Подготовка колонки с флоризилом для очистки экстракта и
проверка хроматографического поведения индоксакарба на ней

7.6.1. Подготовка колонки с флоризилом для очистки экстракта

В пластиковую или стеклянную колонку диаметром 15 мм помещают 4 г флоризила с зернением 60/100 меш. и, аккуратно постукивая по стенкам колонки, формируют слой адсорбента. На слой флоризила наносят слой безводного серно-кислого натрия толщиной 1 см. Колонку промывают 15 см³ ацетона и высушивают.

Непосредственно перед использованием колонку последовательно промывают 10 м³ смеси гексана с ацетоном в соотношении 9:1, а затем 10 см³ гексана.

7.6.2. Проверка хроматографического поведения индоксакарба
на колонке с флоризилом

Из стандартного раствора индоксакарба в ацетонитриле, содержащего 1 мкг/см³, отбирают 1 см³, помещают в кругаодонную колбу объемом 100 см³ и упаривают на ротационном вакуумном испарителе досуха при температуре не выше 30 °С. Сухой остаток растворяют в 1 см³ ацетона, тщательно обмывая стенки концентратора, прибавляют 9 см³ гексана, перемешивают и полученный раствор вносят на колонку. Элюат собирают в концентратор, упаривают досуха, сухой остаток растворяют в 2 см³ смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 и хроматографируют.

Исходную колбу последовательно обмывают 10 см³ смеси гексана с ацетоном в соотношении 9:1, 10 см³ смеси гексана с ацетоном в соотношении 4:1 и 4 порциями объёмом 5 см³ каждая смеси гексана с ацетоном в соотношении 2:1. Каждую порцию собирают отдельно в концентраторы и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.

Сухой остаток каждой фракции растворяют в 2 см³ смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 и хроматографируют.

Определяют фракции, содержащие индоксакарб, полноту смывания с колонки и необходимый объём элюента.

Изучение поведения индоксакарба на колонке проводят каждый раз при отработке методики или поступлении новой партии флоризила.

7.7. Подготовка и кондиционирование колонки
для жидкостной хроматографии

Хроматографическую колонку с предколонкой устанавливают в термостате хроматографа и стабилизируют при температуре 30 °С и скорости потока подвижной фазы 0,175 см³/мин 3 - 4 ч.

8. Отбор проб и хранение

Отбор проб производится в соответствии с «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов», № 2051-79 от 21.08.79, а также в соответствии с ГОСТ 13586.3-83 «Зерно. Правила приемки и методы отбора проб», ГОСТ Р ИСО 6497-2011 «Корма растительного происхождения. Методы отбора проб», ГОСТ 10852-86 «Семена масличные. Правила приемки и методы отбора проб», ГОСТ 17109-88 «Соя. Требования при заготовках и поставках», ГОСТ Р 53510-09 «Масло соевое. ТУ», ГОСТ 8808-2000 «Масло кукурузное. ТУ», ГОСТ 22391-89 «Подсолнечник. Требования при заготовках и поставках», ГОСТ Р 52465-05 «Масло подсолнечное. ТУ», ГОСТ Р 53457-09 «Масло рапсовое. ТУ», ГОСТ Р 52062-03 «Масла растительные. Правила приемки и методы отбора проб» и ГОСТ Р 52647-06 «Свекла сахарная. ТУ».

Пробы зеленой массы кукурузы и сахарной свеклы, а также корнеплодов сахарной свеклы хранят в холодильнике в полиэтиленовых пакетах при температуре 0 - 4 °С в течение суток. Для длительного хранения пробы замораживают и хранят в морозильной камере при температуре -18 °С.

Отобранные пробы зерна кукурузы, а также семян подсолнечника подсушивают до стандартной влажности и хранят в бумажных или тканевых мешочках в сухом, хорошо проветриваемом шкафу, недоступном для грызунов.

Пробы кукурузного и подсолнечного масла хранят в стеклянной герметично закрытой таре в холодильнике при температуре 4 °С не более 10 суток.

9. Выполнение определения

9.1. Зеленая масса кукурузы

9.1.1. Экстракция

Образец измельченной зеленой массы кукурузы массой 5 г помещают в полипропиленовую банку для экстракции объемом 250 см³, прибавляют 40 см³ ацетонитрила и помещают на 5 мин в ультразвуковую ванну. Экстракт фильтруют в коническую колбу объемом 250 см³ с 5 г хлорида натрия через фильтр низкой плотности. Экстракцию повторяют еще два раза, используя по 40 см³ ацетонитрила и помещая на 5 мин в ультразвуковую ванну. Экстракты объединяют в конической колбе объемом 250 см³ с 5 г хлорида натрия, перемешивают и выдерживают 10 мин при комнатной температуре.

Затем объединенный экстракт из колбы переносят в делительную воронку (не растворившуюся соль оставляют в колбе) объемом 250 см³, оставляют до полного разделения слоев в делительной воронке. Нижний водный слой отбрасывают, а верхний ацетонитрильный слой собирают через слой безводного сульфата натрия в концентратор объемом 250 см³ и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.

9.1.2. Очистка экстракта перераспределением
в системе несмешивающихся растворителей

К сухому остатку в концентраторе, полученному по п. 9.1.1, прибавляют 5 см³ ацетонитрила, обмывают стенки концентратора, затем прибавляют 100 см³ дистиллированной воды, 5 г хлорида натрия, перемешивают и переносят в делительную воронку объемом 250 см³. Индок-сакарб экстрагируют тремя порциями гексана объемом по 30 см³, встряхивая делительную воронку каждый раз по 2 мин. После полного разделения фаз в делительной воронке верхний слой (гексан) собирают через слой безводного сульфата натрия в концентратор объемом 250 см³ и выпаривают досуха при температуре не выше 30 °С.

9.1.3. Очистка экстракта на колонке с окисью алюминия

Сухой остаток, полученный в п. 9.1.2, растворяют в 10 см³ ацетонитрила, тщательно обмывают стенки концентратора, наносят на подготовленную колонку, элюат собирают в концентратор. Исходную колбу обмывают 10 см³ ацетонитрила и вносят на колонку. Элюаты объединяют и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С. Сухой остаток подвергают дальнейшей очистке на концентрирующих патронах № 1.

9.1.4. Очистка экстракта на концентрирующих патронах № 1

Сухой остаток растворяют в 1 см³ ацетонитрила, тщательно обмывая стенки концентратора, прибавляют 9 см³ воды, перемешивают и вносят на подготовленный патрон. Элюат отбрасывают. Исходный концентратор обмывают 10 см³ смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:4, наносят на патрон и элюат также отбрасывают. Индоксакарб элюируют 15 см³ смеси ацетонитрила с водой в соотношении 3:1. Элюат собирают в концентратор объемом 100 см³, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.

Сухой остаток растворяют в 5 см³ смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 и 10 мм³ пробы вводят в хроматограф.

9.2. Зерно кукурузы

9.2.1. Экстракция

Образец измельченного зерна кукурузы массой 20 г помещают в полипропиленовую банку для экстракции объемом 250 см³, прибавляют 40 см³ ацетонитрила и помещают на 5 мин в ультразвуковую ванну. Экстракт фильтруют в концентратор объемом 250 см³ через фильтр низкой плотности. Экстракцию повторяют два раза, используя по 40 см³ ацетонитрила и помещая на 5 мин в ультразвуковую ванну. Экстракты фильтруют, объединяют в концентраторе объемом 250 см³ и выпаривают до масляного остатка при температуре не выше 30 °С.

9.2.2. Очистка экстракта перераспределением
в системе несмешивающихся растворителей

К маслянистому остатку, полученному по п. 9.2.1, добавляют 50 см³ гексана, тщательно обмывают стенки концентратора и переносят в делительную воронку объемом 250 см³. Индоксакарб экстрагируют тремя порциями ацетонитрила объемом по 20 см³, встряхивая каждый раз делительную воронку по 2 мин. После полного разделения фаз в делительной воронке нижний ацетонитрильный слой собирают в химический стакан объемом 100 см³.

Ацетонитрильный экстракт переносят в делительную воронку, прибавляют к нему 30 см³ гексана и интенсивно встряхивают воронку 2 мин. После полного разделения фаз в делительной воронке нижний ацетонитрильный слой собирают в химический стакан объемом 100 см³, верхний гексановый слой отбрасывают. Ацетонитрильный экстракт возвращают в делительную воронку и промывают еще одной порцией гексана объемом 30 см³, гексан отбрасывают. Ацетонитрильный экстракт собирают через слой безводного сульфата натрия в концентратор объемом 250 см³ и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.

Далее проводят очистку экстракта по п. 9.1.3 «Очистка экстракта на колонке с окисью алюминия» и п. 9.1.4 «Очистка экстракта на концентрирующих патронах № 1».

Сухой остаток растворяют в 2 см³ смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 и 10 мм³ пробы вводят в хроматограф.

9.3. Масло кукурузы и подсолнечника

9.3.1.Экстракция и очистка полученного экстракта

Из пробы кукурузного масла отбирают в стакан навеску массой 20 г (10 г - для подсолнечного масла) и переносят ее в делительную воронку объемом 250 см³ двумя порциями гексана объемом по 30 см³. Индоксакарб экстрагируют тремя порциями ацетонитрила объемом по 50 см³, встряхивая делительную воронку 2 мин. После полного разделения фаз в делительной воронке нижний ацетонитрильный слой объединяют в стакане объемом 100 см³. Верхний слой (гексан) отбрасывают.

Ацетонитрильный экстракт переносят в чистую делительную воронку объемом 250 см³, промывают одной порцией гексана объемом 100 см³. Гексан отбрасывают, а ацетонитрил собирают в концентратор объемом 250 см³ через слой безводного сульфата натрия и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.

Далее проводят очистку экстракта по п. 9.1.3 «Очистка экстракта на колонке с окисью алюминия» и п. 9.1.4 «Очистка экстракта на концентрирующих патронах № 1».

Сухой остаток растворяют в 2 см³ смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 и 10 мм³ пробы вводят в хроматограф.

9.4. Семена подсолнечника

9.4.1. Экстракция

Образец измельченных семян подсолнечника массой 10 г помещают в полипропиленовую банку для экстракции объемом 250 см³, прибавляют 50 см³ ацетонитрила и помещают на 5 мин в ультразвуковую ванну, а затем на 5 мин на аппарат для встряхивания проб. Экстракт фильтруют в концентратор объемом 250 см³ через фильтр низкой плотности. Экстракцию повторяют еще два раза, используя по 50 см³ ацетонитрила и помещая на 5 мин в ультразвуковую ванну. Экстракты фильтруют, объединяют в концентраторе объемом 250 см³ и выпаривают досуха при температуре не выше 30 °С.

Далее проводят очистку экстракта по п. 9.2.2 «Очистка экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей» и на колонках с флоризилом.

9.4.2. Очистка экстракта на колонке с флоризилом

Сухой остаток, полученный по п. 9.4.1, растворяют в 1 см³ ацетона, тщательно обмывая стенки концентратора, прибавляют 9 см³ гексана, перемешивают и полученный раствор вносят на колонку, элюат отбрасывают. Исходный концентратор обмывают 10 см³ смеси гексана с ацетоном в соотношении 9:1 и 10 см³ смеси гексана с ацетоном в соотношении 4:1, элюаты отбрасывают. Исходный концентратор обмывают 15 см³ смеси гексана с ацетоном в соотношении 2:1, вносят на колонку, элюат собирают в концентратор объемом 100 см³ и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не более 30 °С.

Сухой остаток растворяют в 2 см³ смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 и 10 мм³ пробы вводят в хроматограф.

9.5. Корнеплоды сахарной свеклы

9.5.1. Экстракция

Образец измельченных корнеплодов сахарной свеклы массой 10 г помещают в полипропиленовую банку для экстракции объемом 250 см³, приливают туда 40 см³ ацетонитрила и помещают на 5 мин в ультразвуковую ванну. Экстракт фильтруют в коническую колбу объемом 250 см³ с 5 г хлорида натрия через фильтр низкой плотности. Экстракцию повторяют еще два раза, используя по 40 и 30 см³ ацетонитрила и помещая на 5 мин в ультразвуковую ванну. Экстракты объединяют в конической колбе объемом 250 см³ с 5 г хлорида натрия, перемешивают и выдерживают 10 мин при комнатной температуре.

Затем объединенный экстракт из колбы переносят в делительную воронку (не растворившуюся соль оставляют в колбе) объемом 250 см³, оставляют до полного разделения слоев в делительной воронке. Нижний водный слой отбрасывают, а верхний ацетонитрильный слой собирают через слой безводного сульфата натрия в концентратор объемом 250 см³ и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.

Далее проводят очистку экстракта по п. 9.1.2 «Очистка экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей», по п. 9.1.3 «Очистка экстракта на колонке с окисью алюминия» и п. 9.1.4 «Очистка экстракта на концентрирующих патронах № 1».

После очистки элюат выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С, сухой остаток растворяют в 5 см³ смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1 : 1 и 10 мм³ пробы вводят в хроматограф.

9.6. Зелёная масса сахарной свеклы

9.6.1.Экстракция и очистка полученного экстракта

Образец измельченной зеленой массы сахарной свеклы массой 5 г помещают в полипропиленовую банку для экстракции объемом 250 см³, приливают туда 40 см³ ацетонитрила и помещают на 5 мин в ультразвуковую ванну. Экстракт фильтруют в коническую колбу объемом 250 см³ с 5 г хлорида натрия через фильтр низкой плотности. Экстракцию повторяют еще два раза, используя каждый раз по 40 см³ ацетонитрила и помещая на 5 мин в ультразвуковую ванну. Экстракты объединяют в конической колбе объемом 250 см³ с 5 г хлорида натрия, перемешивают и выдерживают 10 мин при комнатной температуре.

Затем объединенный экстракт из колбы переносят в делительную воронку (не растворившуюся соль оставляют в колбе) объемом 250 см³, оставляют до полного разделения слоев в делительной воронке. Выделившуюся нижнюю водную фазу отбрасывают, а верхнюю ацетонитрильную оставляют в делительной воронке.

К ацетонитрильному экстракту в делительной воронке прибавляют 50 см³ гексана и интенсивно встряхивают воронку 2 мин. После полного разделения фаз в делительной воронке нижний ацетонитрильный слой собирают в химический стакан объемом 250 см³, верхний гексановый слой отбрасывают. Ацетонитрильный экстракт возвращают в делительную воронку и промывают еще одной порцией гексана объемом по 50 см³, гексан отбрасывают. Ацетонитрильный экстракт собирают через слой безводного сульфата натрия в концентратор объемом 250 см³ и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.

Далее проводят очистку экстракта по п. 9.1.2 «Очистка экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей» и по п. 9.1.3 «Очистка экстракта на колонке с окисью алюминия».

После очистки элюат выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С, сухой остаток растворяют в 25 см³ смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 и 10 мм³ пробы вводят в хроматограф.

9.7. Условия хроматографирования

Хроматографическая система, включающая:

- хроматограф жидкостной с диодно-матричным детектором, снабженный термостатом для колонок с диапазоном температур от 15 до 80 °С и стандартным автосамплером с дозирующим объемом от 0,1 до 100 мм³ для автоматического ввода пробы в хроматографическую систему;

- компьютерное программное обеспечение, контролирующее работу всего прибора, обеспечивающее сбор и хранение всех хроматограмм в процессе проведения хроматографического анализа, обеспечивающее обработку результатов измерений, вывод и расчет хроматограмм и количественный анализ.

Колонка хроматографическая стальная, длиной 150 мм, с внутренним диаметром 4,6 мм, зернением 3,5 мкм, заполненная сорбентом с привитыми полярными группами С18.

Предколонка хроматографическая стальная, длиной 12,5 мм, внутренним диаметром 2,1 мм, зернением 5 мкм, заполненная сорбентом с привитыми полярными группами С8.

Температура колонки: 30 °С.

Подвижная фаза: ацетонитрил-вода в соотношении 70:30.

Длина волны: 300 нм.

Чувствительность не менее 15 mAU (миллиединиц абсорбции) на шкалу.

Объем вводимой пробы: 10 мм³.

Линейный диапазон детектирования сохраняется в пределах 2 - 20 нг.

10. Обработка результатов

Содержание индоксакарба в пробах рассчитывают по формуле:

X - содержание индоксакарба в пробе, мг/кг;

S_cm - высота (площадь) пика стандарта, мм;

S_np - высота (площадь) пика образца, мм;

А - концентрация стандартного раствора, мкг/см³;

V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, см³;

m - масса анализируемого образца, г (см³);

Р - содержание индоксакарба в аналитическом стандарте, %.

11. Проверка приемлемости результатов
параллельных определений

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости:

X₁, Х₂ - результаты параллельных определений, мг/кг;

r - значение предела повторяемости (табл. 1), при этом r = 2,8×σ_r.

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

12. Оформление результатов

Результат анализа представляют в виде:

 - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

Δ - граница абсолютной погрешности, мг/кг;

δ - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

В случае если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

«содержание вещества в пробе менее 0,01 мг/кг»*

* - 0,01 мг/кг - предел обнаружения.

13. Контроль качества результатов измерений

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений, а также контроль стабильности градуировочной характеристики осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-02 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».

13.1. Контроль стабильности градуировочной характеристики.

Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

Контроль стабильности градуировочной характеристики для индоксакарба проводят при смене основного градуировочного раствора № 1 каждые 6 месяцев, при смене основного градуировочного раствора № 2 каждый месяц, при смене основных градуировочных растворов № 3, 4, 5 и 6 - каждые 15 суток, а также в начале и при окончании каждой серии анализов.

При контроле стабильности градуировочной характеристики проводят измерения не менее трех образцов концентраций для градуировки, содержание индоксакарба в которых должно охватывать весь диапазон концентраций от 0,1 до 1,0 мкг/см³.

Градуировочная характеристика считается стабильной, если для каждого из используемого для контроля градуировочного раствора сохраняется соотношение:

X - концентрация индоксакарба контрольного измерения, мкг/см³;

С - известная концентрация градуировочного раствора индоксакарба в смеси ацетонитрила с водой, взятая для контроля стабильности градуировочной характеристики, мкг/см³;

0,97 - погрешность градуировочной характеристики, %.

Если величина расхождения (А) превышает 0,97 %, делают вывод о невозможности применения градуировочной характеристики для дальнейших измерений. В этом случае выясняют и устраняют причины нестабильности градуировочной характеристики и повторяют контроль ее стабильности с использованием других градуировочных растворов индоксакарба, предусмотренных МВИ. При повторном обнаружении нестабильности градуировочной характеристики определяют ее заново согласно п. 7.3.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом добавок.

Величина добавки С_д должна удовлетворять условию:

 - характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно), мг/кг, при этом:

Δ - граница абсолютной погрешности, мг/кг;

δ - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

Результат контроля процедуры К_к рассчитывают по формуле:

, , С_д - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11), содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце и концентрация добавки, соответственно, мг/кг.

Норматив контроля К рассчитывают по формуле:

Проводят сопоставление результата контроля процедуры (К_к) с нормативом контроля (К).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию:

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

X₁, Х₂ - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

Приложение 1

Полнота извлечения индоксакарба из зеленой массы, зерна и
масла кукурузы, из семян и масла подсолнечника, из зеленой
массы и корнеплодов сахарной свеклы
(5 повторностей для каждой концентрации, Р = 0,95)