4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Измерение
остаточного содержания протиоконазола
по метаболиту протиоконазол-дестио
в зерне, масле и зеленой массе кукурузы,
семенах и масле льна, зерне и зеленой массе
гороха, зерне и соломе проса
методом капиллярной газожидкостной
хроматографии

Методические указания
МУК 4.1.3196-14

Москва 2015

1. Разработаны сотрудниками ГНУ Всероссийского НИИ фитопатологии (Л.В. Дубовая, А.М. Макеев).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 26 июня 2014 г. № 1).

3. Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 29 июля 2014 г.

4. Введены впервые.

СОДЕРЖАНИЕ

 

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Измерение
остаточного содержания протиоконазола
по метаболиту протиоконазол-дестио в зерне,
масле и зеленой массе кукурузы, семенах
и масле льна, зерне и зеленой массе гороха,
зерне и соломе проса методом капиллярной
газожидкостной хроматографии

Свидетельство о метрологической аттестации от 03.10.2013 № 01.00225/205-28-13

1. Назначение и область применения

Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода капиллярной газожидкостной хроматографии для определения массовых концентраций протиоконазола по метаболиту протиоконазол-дестио в зеленой массе кукурузы и гороха, соломе проса в диапазоне 0,05 - 0,5 мг/кг, в зерне гороха и проса, зерне и масле кукурузы в диапазоне 0,02 - 0,2 мг/кг, в семенах и масле льна в диапазоне 0,025 - 0,25 мг/кг.

Методические указания носят рекомендательный характер.

Протиоконазол.

2-[(2]18)-2-(1-хлорциклопропил)-3-(2-хлорфенил)-2-окси-пропил]-2Н-1,2,4-триазол-3(4Н)-тион.

Эмпирическая формула: C₁₄H₁₅C1₂N₃OS.

Молекулярная масса 344,3.

Структурная формула:

Бесцветное или светло-бежевое твердое вещество без запаха. Температура плавления: 139,1 - 144,5 °С. Давление паров при 20 °С: ≪ 4×10^-7 Па. Коэффициент распределения н-октанол/вода: K_owlog Р = 4,16 (pH 4), 3,82 (pH 7) и 2,0 (pH 9). Растворимость (г/дм³) при 20 °С: ацетон - > 250, этилацетат - > 250, дихлорметан - 88, ацетонитрил - 69; растворимость в воде - 0,005 (pH 4), 0,3 (pH 8) и 2,0 (pH 9).

Вещество стабильно при хранении на воздухе, а также в кислой (DT₅₀ = 120 дней) и щелочной (DT₅₀ > 1 года) средах.

В присутствии света в водных фотолитических условиях протиоконазол достаточно быстро деградирует с периодом полураспада 47,7 ч.

Краткая токсикологическая характеристика

Острая пероральная токсичность (LD₅₀) для крыс - > 6 200 мг/кг; острая дермальная токсичность (LD₅₀) для крыс - > 2000 мг/кг; острая ингаляционная токсичность (LC₅₀) для крыс - > 4990 мг/м³ воздуха.

Протиоконазол не оказывает раздражающего действия на кожу и слизистую оболочку глаз, не обладает эмбриотоксическим или тератогенным действием. LC₅₀ для рыб - 1,83 мг/дм³ (96 ч).

Фунгицид нетоксичен для птиц, пчел, дождевых червей, дафний и почвенных микроорганизмов.

Основной метаболит протиоконазола

Протиоконазол-дестио (SXX 0665).

α-(1-хлорциклопропил)-α-(2-хлорфенил)метил-1Н-1,2,4-триазол-1-этанол.

Эмпирическая формула: C₁₄H₁₅CI₂N₃O.

Молекулярная масса 312,2.

Структурная формула:

Бесцветный порошок без запаха. Температура плавления: 108,5 °С. Давление паров при 20 °С: 2,7×10^-7 Па. Коэффициент распределения н-октанол/вода: K_owlog Р = 3,04. Растворимость (г/дм³) при 20 °С: гексан - 3, толуол - 84, ацетон -100, ацетонитрил - 43, дихлорметан - более 200, вода - 0,051.

Метаболит стабилен в кислой и щелочной средах (DT₅₀) > 500 ч).

Область применения препарата

Протиоконазол - фунгицид системного действия из группы ингибиторов синтеза эргостерина. Вещество обладает защитным, искореняющим и лечебным действием.

Применяется в России в качестве фунгицида системного действия в составе смесевых препаратов для протравливания зерна колосовых культур и обработки вегетирующих растений зерновых злаков и рапса с нормой расхода 37 - 50 г д.в./т семян или 80 - 100 г д.в./га.

Проходит регистрационные испытания в Российской Федерации в качестве фунгицида в составе смесевых препаратов для протравливания зерна гороха и проса и семян льна с нормой расхода до 82,5 г д.в./т, а также для однократной обработки посевов кукурузы при норме расхода до 125 г д.в./га.

Протиоконазол весьма лабильное вещество и при поступлении в растение очень быстро метаболизируется до более устойчивого соединения - протиоконазол-дестио (α-(1-хлорциклопро-пил)-α-(2-хлорфенил)метил-1Н-1,2,4-триазол-1-этанол). В связи с этим разработан метод, позволяющий осуществлять контроль за содержанием остаточных количеств протиоконазола в зеленой массе растений, зерне кукурузы, гороха и проса, семенах и масле льна по протиоконазол-дестио.

2. Метрологические характеристики

При соблюдении всех регламентированных условий и проведении анализа в точном соответствии с данной методикой значение погрешности (и ее составляющие) результатов измерений не превышает значений, приведенных в таблице.

Таблица

3. Метод измерений

Метод основан на экстракции метаболита протиоконазол-дестио из зеленой массы и соломы водным раствором ацетона, из зерна и семян водным раствором ацетонитрила или ацетона, из масла ацетонитрилом, очистке экстрактов от коэкстрактивных компонентов перераспределением в системе несмешивающихся растворителей, а также на колонке с оксидом алюминия и концентрирующем патроне, с последующим измерением содержания протиоконазол-дестио в очищенных экстрактах методом капиллярной газожидкостной хроматографии (ГЖХ) при программировании температуры колонки с термоионным детектором (ТИД) и обработкой хроматограмм методом абсолютной градуировки.

4. Требования к средствам измерений,
вспомогательным устройствам, реактивам
и материалам

4.1. Средства измерений

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

4.2. Реактивы

Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией.

4.3. Вспомогательные устройства, материалы

Примечание. Допускается использование других вспомогательных устройств и материалов с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

5. Требования безопасности, охраны окружающей среды

5.1. При работе с реактивами соблюдают требования безопасности, установленные для работы с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами по ГОСТ 12.1.007-76, 12.1.005-88.

5.2. При проведении анализов горючих и вредных веществ соблюдают требования противопожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и должны быть в наличии средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-90. Обучение работающих правилам безопасности труда проводят согласно ГОСТ 12.0.004-90.

5.3. При выполнении измерений с использованием хроматографа соблюдают правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ Р 12.1.019-2009 и инструкцией по эксплуатации прибора.

5.4. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией. Содержание вредных веществ в воздухе рабочей зоны не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и 2.2.5.2308-07.

6. Требования к квалификации операторов

К выполнению измерений и обработке их результатов допускается специалист, прошедший обучение, имеющий опыт работы в лаборатории и владеющий техникой проведения газохроматографического анализа, освоивший данную методику и подтвердивший соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений.

7. Требования к условиям измерений

При выполнении измерений соблюдают следующие условия.

7.1. Условия приготовление растворов и подготовки
проб к анализу

7.2. Условия хроматографического анализа

8. Подготовка к выполнению измерений

Измерениям предшествуют следующие операции: очистка органических растворителей (при необходимости), приготовление градуировочных растворов, раствора внесения, кондиционирование хроматографической колонки, установление градуировочной характеристики, приготовление смесей растворителей, подготовка колонки с оксидом алюминия и концентрирующих патронов, проверка хроматографического поведения протиоконазол-дестио на колонке и патронах.

8.1. Очистка органических растворителей
и приготовление растворов

8.1.1. Ацетон

Ацетон перегоняют над перманганатом калия и карбонатом калия (на 1 дм³ ацетона 10 г перманганата калия и 2 г карбоната калия). Срок хранения - 1 неделя.

8.1.2. Ацетонитрил

Ацетонитрил кипятят с обратным холодильником над пентоксидом фосфора (на 1 дм³ ацетонитрила 20 г пентоксида фосфора) не менее часа, после чего перегоняют. Непосредственно перед употреблением ацетонитрил повторно перегоняют над прокаленным карбонатом калия (на 1 дм³ ацетонитрила - 10 г карбоната калия). Срок хранения - 1 неделя.

8.1.3. н-Гексан

Растворитель последовательно промывают порциями концентрированной серной кислоты до прекращения окрашивания последней в желтый цвет, затем водой до нейтральной реакции промывных вод, перегоняют над карбонатом калия. Срок хранения - 1 неделя.

8.1.4. Хлористый метилен и этилацетат

Приготовление раствора натрия углекислого с массовой долей 5 %

Навеску (5,0 ± 0,1) г натрия углекислого растворяют в конической колбе в (40 - 60) см³ деионизованной воды. Полученный раствор количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 см³ и доводят объем раствора до метки деионизованной водой. Срок хранения раствора - 1 неделя.

Хлористый метилен и этилацетат промывают последовательно раствором натрия углекислого с массовой долей 5 %, насыщенным раствором кальция хлористого, сушат над безводным карбонатом калия и перегоняют. Срок хранения - 1 неделя.

8.1.5. Приготовление насыщенного раствора хлорида натрия

В коническую колбу вместимостью 200 см³ вносят навеску

(50 ± 2) г натрия хлористого, приливают 100 см³ деионизованной воды, перемешивают в течение 5 мин, полученный раствор фильтруют. Фильтрат является насыщенным раствором натрия хлористого. Срок годности раствора - 1 неделя.

8.2. Кондиционирование хроматографической колонки

Капиллярную кварцевую колонку устанавливают в термостат хроматографа и, не подсоединяя к детектору, кондиционируют при температуре 290 °С и скорости газа-носителя 2 см³/мин в течение 8 - 10 ч.

8.3. Приготовление градуировочных растворов

8.3.1. Исходный градуировочный раствор протиоконазол-дестио с массовой концентрация 100 мкг/см³

В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают (0,010 ± 0,0001) г протиоконазол-дестио, растворяют в 40 - 50 см³ этилацетата, доводят объем раствора этим же растворителем до метки, тщательно перемешивают.

Раствор хранят в морозильной камере при температуре не выше (-18) °С в течение 3 месяцев.

8.3.2. Градуировочный раствор протиоконазол-дестио с массовой концентрацией 10 мкг/см³ (раствор № 1)

В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 10 см³ исходного раствора протиоконазол-дестио с концентрацией 100 мкг/см³ (п. 8.3.1), разбавляют этилацетатом до метки. Этот раствор используют для приготовления градуировочных растворов № 2 - 5.

Для приготовления проб зерна, семян, масла, зеленой массы и соломы с внесением при оценке полноты извлечения протиоконазол-дестио из исследуемых образцов используют ацетоновый раствор протиоконазол-дестио с концентрацией 1 мкг/см³.

Градуировочный раствор № 1 и ацетоновый раствор протиоконазол-дестио хранят в морозильной камере при температуре не выше минус 18 °С в течение месяца.

8.3.3. Градуировочные растворы протиоконазол-дестио с массовой концентрацией 0,1 - 1,0 мкг/см³ (растворы № 2 - 5)

В 4 мерные колбы вместимостью 100 см³ помещают 1,0; 2,0; 5,0 и 10,0 см³ градуировочного раствора № 1 протиоконазол-дестио с массовой концентрацией 10 мкг/см³ (п. 8.3.2), доводят до метки смесью гексан-этилацетат с объемным соотношением компонентов 9:1, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы № 2 - 5 с концентрацией протиоконазол-дестио 0,1; 0,2; 0,5 и 1,0 мкг/см³ соответственно.

Растворы готовят непосредственно перед использованием.

8.4. Градуировка хроматографа

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пика (мкВ) от концентрации протиоконазол-дестио в растворе (мкг/см³), устанавливают методом абсолютной градуировки по 4 градуировочным растворам.

В инжектор хроматографа вводят по 1 мм³ каждого градуировочного раствора (п. 8.3.3) и анализируют при условиях хроматографирования по п. 7.2. Осуществляют не менее 3 параллельных измерений. Расхождение между параллельными определениями не должно превышать предел повторяемости г.

По полученным данным строят градуировочную характеристику.

8.5. Контроль стабильности градуировочной характеристики

Контроль стабильности градуировки проводят не реже 1 раза в три месяца, а также при смене реактивов или изменении условий анализа.

Для контроля стабильности используют вновь приготовленные градуировочные растворы с массовой концентрацией исследуемого вещества в начале, середине и в конце диапазона измерений, которые анализируют в точном соответствии с методикой.

Градуировочную характеристику считают стабильной, если для каждого контрольного образца выполняется условие (1)

S_изм., S_гр. - значение площади пика протиоконазол-дестио в образце для контроля, измеренное и найденное по градуировочной характеристике соответственно, мкВ;

K_гр. - норматив контроля, K_гр. = 0,5⋅δ, где ±δ - границы относительной погрешности, % (табл.).

Если условие стабильности не выполняется только для одного образца, то повторно анализируют этот образец для исключения результата, содержащего грубую ошибку.

Если градуировка нестабильна, выясняют причины нестабильности и повторяют контроль стабильности с использованием других образцов для градуировки, предусмотренных методикой. При повторном обнаружении нестабильности градуировки прибор градуируют заново.

8.6. Подготовка колонки с оксидом алюминия
и концентрирующего патрона № 1 для очистки
экстракта

Нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см и внутренним диаметром 8 - 10 мм уплотняют тампоном из стекловаты, медленно выливают в колонку (при открытом кране) суспензию 5 г оксида алюминия нейтрального III степени активности в 15 см³ гексана (оксид алюминия III степени активности по Брокману получают добавлением 6 % воды к навеске оксида алюминия I степени активности). Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента и помещают на него слой безводного сульфата натрия высотой 1 см. Колонку промывают 15 см³ гексана со скоростью 1 - 2 капли/с, после чего она готова к работе.

Концентрирующий патрон № 1 промывают сначала с помощью медицинского шприца 10 см³ смеси дихлорметан-ацетон (1:1, по объему), а затем 7 см³ смеси гексан-дихлорметан (7:3, по объему) со скоростью 5 см³/мин.

8.7. Определение объема элюента, необходимого для полного
вымывания протиоконазол-дестио из колонки с оксидом
алюминия

В круглодонную колбу вместимостью 10 см³ помещают 0,2 см³ градуировочного раствора протиоконазол-дестио с концентрацией 10 мкг/см³ в этилацетате (п. 8.3.2). Растворитель упаривают досуха на роторном испарителе при температуре не выше 40 °С, остаток растворяют в 2 см³ смеси гексан-этилацетат (9:1, по объему), помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин. Раствор наносят на колонку с оксидом алюминия, подготовленную по п. 8.6. Промывают колонку 20 см³ смеси гексан-этилацетат (9:1, по объему) со скоростью 1 - 2 капли/с, элюат отбрасывают. Затем колонку промывают 40 см³ смеси гексан-этилацетат (8:2, по объему), отбирая последовательно по 5 см³ элюата. Каждую фракцию упаривают досуха, остатки растворяют в 1 см³ смеси гексан-этилацетат (9:1, по объему), помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин, и затем хроматографируют в соответствии с п. 7.2.

По результатам обнаружения протиоконазол-дестио в каждой из фракций определяют объем смеси гексан-этилацетат (8:2, по объему), необходимый для полного вымывания вещества из колонки.

Примечание. Профиль вымывания протиоконазол-дестио может меняться при использовании новых партий сорбента и растворителей.

8.8. Определение объема элюента, необходимого
для полного вымывания протиоконазол-дестио из патрона № 1

В круглодонную колбу вместимостью 10 см³ помещают 0,1 см³ градуировочного раствора протиоконазол-дестио с концентрацией 10 мкг/см³ в этилацетате (п. 8.3.2). Растворитель упаривают досуха на роторном испарителе при температуре не выше 40 °С, остаток растворяют в 2 см³ смеси гексан-дихлорметан (7:3, по объему), помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин. Раствор наносят на патрон № 1, подготовленный по п. 8.6. Промывают патрон 6 см³ смеси гексан-дихлорметан (7:3, по объему) со скоростью 1 - 2 капли/с, элюат отбрасывают. Затем через патрон пропускают 15 см³ смеси гексан-дихлорметан (4:6, по объему), отбирая последовательно по 5 см³ элюата непосредственно в круглодонные колбы. Растворы в колбах упаривают досуха при температуре не выше 40 °С, остатки растворяют в 1 см³ смеси гексан-этилацетат (9:1, по объему), помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин, и затем хроматографируют в соответствии с п. 7.2.

По результатам обнаружения протиоконазол-дестио в каждой из фракций определяют объем смеси гексан-дихлорметан (4:6, по объему), необходимый для полного вымывания вещества из патрона.

Примечание. Профиль вымывания протиоконазол-дестио может меняться при использовании новых партий концентрирующих патронов № 1 и растворителей.

9. Отбор и хранение проб

Отбор проб производится в соответствии с правилами, определенными ГОСТ Р 50436-92 «Зерновые. Отбор проб зерна», ГОСТ 13634-90 «Кукуруза. Требования при заготовке и поставке», ГОСТ 28674-90 «Горох. Требования при заготовке и поставке», ГОСТ 10852-86 «Семена масличные. Правила приемки и методы отбора проб», ГОСТ 5791-81 «Масло льняное техническое. Технические условия», «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов» (№ 2051-79 от 21.08.79).

Пробы зеленой массы хранят в стеклянной или полиэтиленовой таре в холодильнике не более одного дня; для длительного хранения пробы замораживают и хранят при температуре минус 18 °С до анализа. Пробы зерна, семян и соломы высушивают до стандартной влажности и хранят в бумажных или тканевых мешочках в сухом, хорошо проветриваемом шкафу. Пробы масла хранят в плотно закрытой стеклянной или полиэтиленовой таре в холодильнике при температуре 0 - 4 °С. В некоторых случаях масло получают из семян масличных культур экстракцией органическими неполярными растворителями (петролейный и диэтиловый эфиры) непосредственно перед проведением анализа.

10. Проведение определения

10.1. Экстракция протиоконазол-дестио

10.1.1. Земная масса кукурузы и гороха, солома проса. Образец измельченного растительного материала (зеленая масса 20 г, солома 5 г) помещают в стакан гомогенизатора вместимостью 500 см³, добавляют 100 см³ смеси ацетон-вода с объемным соотношением компонентов 8:2 и гомогенизируют 3 мин при 10000 об./мин. Гомогенат фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через бумажный фильтр в колбу вместимостью 250 см³. Осадок на фильтре промывают 50 см³ смеси ацетон-вода (8:2, по объему). Аликвоту объединенного фильтрата, эквивалентную 5 г зеленой массы или 2 г соломы, переносят в круглодонную колбу вместимостью 100 см³ и упаривают до водного остатка (5 - 10 см³) на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 40 °С. К водному остатку добавляют 25 см³ насыщенного раствора хлорида натрия (п. 8.1.5) и проводят очистку экстракта по п. 10.2.

10.1.2. Зерно кукурузы, семена льна. Образец размолотых семян массой 10 г помещают в плоскодонную колбу вместимостью 250 см³, добавляют 50 см³ смеси ацетонитрил-вода с объемным соотношением компонентов 9:1 и помещают на аппарат для встряхивания на 40 мин. Суспензию фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через бумажный фильтр в колбу Бунзена вместимостью 250 см³. Осадок на фильтре промывают 25 см³ смеси ацетонитрил-вода (9:1, по объему). Экстракт и промывную жидкость переносят в химический стакан, перемешивают, измеряют объем раствора и 1/2 его часть (эквивалентную 5 г образца) переносят в делительную воронку вместимостью 100 см³. В воронку вносят 10 см³ гексана, насыщенного ацетонитрилом, интенсивно встряхивают в течение 2 мин. После расслоения фаз гексановый слой отбрасывают, а водно-ацетонитрильную фракцию переносят в круглодонную колбу вместимостью 100 см³ и упаривают до водного остатка (~1 см³) на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 40 °С. К водному остатку добавляют 30 см³ насыщенного раствора хлорида натрия (п. 8.1.5) и проводят очистку экстракта по п. 10.2.

10.1.3. Зерно гороха и проса. Образец размолотых семян массой 10 г помещают в плоскодонную колбу вместимостью 250 см³, добавляют 50 см³ смеси ацетон-вода с объемным соотношением компонентов 8:2 и помещают на аппарат для встряхивания на 40 мин. Суспензию фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через бумажный фильтр в колбу Бунзена вместимостью 250 см³. Осадок на фильтре промывают 25 см³ смеси ацетон-вода (8:2, по объему). Экстракт и промывную жидкость переносят в химический стакан, перемешивают, измеряют объем раствора и 1/2 его часть (эквивалентную 5 г образца) переносят в круглодонную колбу вместимостью 100 см³ и упаривают до водного остатка (~3 - 4 см³) на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 40 °С. К водному остатку добавляют 30 см³ насыщенного раствора хлорида натрия (п. 8.1.5) и проводят очистку экстракта по п. 10.2.

10.1.4. Масло. К образцу масла массой 5 г, помещенного в плоскодонную колбу вместимостью 250 см³, приливают 15 см³ гексана и перемешивают. К раствору добавляют 30 см³ ацетонитрила и колбу помещают на встряхиватель на 30 мин. Верхний ацетонитрильный слой декантируют в круглодонную колбу вместимостью 100 см³ через слой ваты, помещенной в конусную воронку. Операцию экстракции масла повторяют еще дважды, используя 30 и 20 см³ ацетонитрила. После декантации ацетонитрильного слоя вату промывают 10 см³ ацетонитрила, которые объединяют с фильтратом. Объединенную ацетонитрильную фазу переносят в делительную воронку вместимостью 250 см, добавляют 10 см³ гексана, насыщенного ацетонитрилом, интенсивно встряхивают в течение 2 мин. После расслоения фаз гексановый слой отбрасывают, а ацетонитрильную фракцию упаривают до маслянистого остатка на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 40 °С. Далее проводят очистку экстракта по п.п. 10.3 и 10.4.

10.2. Очистка экстракта перераспределением в системе
несмешивающихся растворителей

К водным экстрактам зеленой массы, зерна и семян, полученным по пп. 10.1.1, 10.1.2 и 10.1.3 и находящимся в делительных воронках, приливают 30 см³ хлористого метилена, интенсивно встряхивают в течение 2 мин. После разделения фаз нижний органический слой фильтруют через слой безводного сульфата натрия в круглодонную колбу вместимостью 100 см³. Операцию экстракции водной фазы повторяют еще дважды, используя 30 и 20 см³ хлористого метилена. Объединенную органическую фазу, пропущенную через слой сульфата натрия, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 40 °С и остаток подвергают дополнительной очистке на колонке с оксидом алюминия по п. 10.3.

10.3. Очистка экстракта на колонке
с оксидом алюминия

Остаток в круглодонной колбе, полученный по пп. 10.1.4 и 10.2., растворяют в 2 см³ смеси гексан-этилацетат (9:1, по объему), помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин.

Раствор наносят на колонку, подготовленную по п. 8.6. Колбу обмывают 2 см³ смеси гексан-этилацетат (9:1, по объему), которые также наносят на колонку. Промывают колонку 15 сыт смеси гексан-этилацетат (9:1, по объему) со скоростью 1 - 2 капли/с, элюат отбрасывают. Протиоконазол-дестио элюируют с колонки 25 см³ смеси гексан-этилацетат (8:2, по объему), собирая элюат непосредственно в круглодонную колбу вместимостью 100 см³. Раствор упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 40 °С. Остаток экстракта зеленой массы растворяют в 2,5 см³, семян льна в 1,25 см³, зерна кукурузы, гороха, проса и соломы в 1 см³ смеси гексан-этилацетат с объемным соотношением компонентов 9:1, помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин, и растворы анализируют на содержание протиоконазол-дестио по п. 11.1. Экстракт масла дополнительно очищают с помощью концентрирующего патрона № 1.

10.4. Очистка экстракта
на концентрирующем патроне № 1

Остаток экстракта кукурузного и льняного масла, полученный по п. 10.3, растворяют с помощью ультразвуковой ванны в 2 см³ смеси гексан-дихлорметан (7:3, по объему) и раствор вносят на подготовленный концентрирующий патрон № 1 (п. 8.6). Патрон промывают 6 см³ смеси гексан-дихлорметан (7:3, по объему) со скоростью 5 см³/мин, элюат отбрасывают. Протиоконазол-дестио элюируют 10 см³ смеси гексан-дихлорметан (4:6, по объему) в круглодонную колбу вместимостью 50 см³ и раствор упаривают досуха на роторном испарителе при температуре не выше 40 °С. Остатки экстрактов кукурузного и льняного масла растворяют соответственно в 1,0 и 1,25 см³ смеси гексан-этил-ацетат с объемным соотношением компонентов 9:1 и растворы анализируют на содержание протиоконазол-дестио по п. 11.1.

Полнота извлечения протиоконазол-дестио при проведении всех операций подготовки пробы не менее 84 %.

11. Выполнение измерений

11.1. В испаритель хроматографа вводят 1 мм³ очищенного экстракта анализируемой пробы (пп. 10.1 - 10.4), анализируют при условиях п. 7.2 и регистрируют хроматограмму. Каждый экстракт хроматографируют дважды.

11.2. Для каждого образца зеленой массы, соломы, зерна и семян повторяют операции по пп. 10.1 - 10.3, 11.1, для образца масла - по пп. 10.1, 10.3, 10.4, 11.1.

12. Обработка результатов измерений

12.1. Для обработки результатов хроматографического анализа используют программу сбора и обработки хроматографической информации.

Альтернативная обработка результатов.

По градуировочной характеристике находят значение массовой концентрации протиоконазол-дестио в экстрактах, С, мкг/см³.

Массовую долю протиоконазол-дестио X, мг/кг, в образцах зеленой массы, зерне, семенах, масле и соломе рассчитывают по формуле (2).

С - значение массовой концентрации протиоконазол-дестио в экстрактах, мкг/см³;

V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, см³;

m - масса анализируемой части образца, соответствующая доле экстракта, использованной для очистки на колонке с оксидом алюминия и патроне № 1 и последующего хроматографического определения, г;

0,84 - коэффициент извлечения протиоконазол-дестио, учитывающий все процедуры подготовки пробы.

При расчете содержания протиоконазол-дестио в эквивалентах протиоконазола полученное значение Х умножают на 1,1.

12.2. За результат измерений принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, если выполняется условие приемлемости (3)

Х₁, Х₂ - результаты параллельных определений массовой доли протиоконазол-дестио, мг/кг;

r - значение предела повторяемости, % (табл.).

Если условие (3) не выполняется, выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и повторяют выполнение измерений в соответствии с требованиями данной методики.

12.3. Результат анализа в документах, предусматривающих его использование, представляют в виде

 - среднее арифметическое значение результатов п определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

±δ - границы относительной погрешности измерений, % (табл.).

В случае, если полученный результат измерений ниже нижней границы диапазона измерений, результат анализа представляют в виде:

«массовая доля протиоконазол-дестио в зеленой массе и соломе менее 0,05 мг/кг»;

«массовая доля протиоконазол-дестио в зерне кукурузы, гороха, проса и масле кукурузы менее 0,02 мг/кг»;

«массовая доля протиоконазол-дестио в семенах и масле льна менее 0,025 мг/кг».

Экстракты, при хроматографировании которых получают аналитический сигнал протиоконазол-дестио, превышающий аналитический сигнал, получаемый при хроматографировании градуировочного раствора с массовой концентрацией 1,0 мкг/см³, разбавляют смесью гексан-этилацетат с объемным соотношением компонентов 9:1 и анализируют в соответствии с данной методикой.

13. Проверка приемлемости результатов
измерений, полученных в условиях
воспроизводимости

13.1. Проверку приемлемости результатов измерений в условиях воспроизводимости проводят:

а) при возникновении спорных ситуаций между двумя лабораториями;

б) при проверке совместимости результатов измерений, полученных при сличительных испытаниях (при проведении аккредитации лабораторий и инспекционного контроля).

13.2. Для проведения проверки приемлемости результатов измерений в условиях воспроизводимости каждая лаборатория использует пробы, оставленные на хранение.

13.3. Расхождение между результатами измерений, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), не должно превышать предела воспроизводимости R (4).

X₁, X₂ - результаты измерений массовой доли протиоконазол-дестио, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), мг/кг;

R - значение предела воспроизводимости, % (табл.).

Если предел воспроизводимости не превышен, то приемлемы все результаты измерений и в качестве окончательного результата используют их среднеарифметическое значение. Если предел воспроизводимости превышен, то выполняют процедуры, изложенные в ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002 (п. 5.3.3).

При разногласиях руководствуются ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002 (п. 5.3.4).

14. Контроль качества результатов
измерений при реализации методики в лаборатории

Контроль качества результатов измерений в лаборатории при реализации методики осуществляют по ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений», используя контроль стабильности среднеквадратического (стандартного) отклонения повторяемости по п. 6.2.2 ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002 и показателя правильности по п. 6.2.4 ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002.

Рекомендуется устанавливать контролируемый период так, чтобы количество результатов контрольных измерений было от 20 до 30.

При неудовлетворительных результатах контроля, например, при превышении предела действия или регулярном превышении предела предупреждения, выясняют причины этих отклонений, в том числе проводят смену реактивов, проверяют работу оператора.