Государственное санитарно-эпидемиологическое
нормирование Российской Федерации

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТАТОЧНЫХ
КОЛИЧЕСТВ ПЕСТИЦИДОВ
В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ,
СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОМ СЫРЬЕ
И ОБЪЕКТАХ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ

Сборник методических указаний

МУК 4.1.1941 - 4.1.1954-05

Москва, 2009

1. Сборник подготовлен Федеральным научным центром гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана (академик РАМН, проф. В.Н. Ракитский, проф. Т.В. Юдина); при участии специалистов Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. Разработчики методов указаны в каждом из них.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

3. Утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации, академиком РАМН Г.Г. Онищенко.

4. Введены впервые.

УТВЕРЖДАЮ

Главный государственный санитарный врач

Российской Федерации,

Руководитель Федеральной службы

по надзору в сфере защиты прав потребителей и

благополучия человека

____________________ Г.Г. Онищенко

«18» января 2005 г.

МУК 4.1.1954-05

Дата введения 18.04.05

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
по определению остаточных количеств этилентиомочевины в картофеле, огурцах,
томатах, томатном соке, луке, винограде и виноградном соке методом
высокоэффективной жидкостной хроматографии

Настоящие методические указания устанавливают метод высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения массовой концентрации этилентиомочевины в картофеле, огурцах, томатах и томатном соке в диапазоне 0,002 - 0,04 мг/кг, луке, винограде и виноградном соке в диапазоне 0,004 - 0,04 мг/кг.

Этнлентиомочевина - продукт метаболизма пестицида класса этиленбисдитиокарбаматов манкоцеба действующего вещества препарата МЕТАКСИЛ, СП (640 г/кг манкоцеба + 80 г/кг металаксила), производитель ЗАО Фирма «Август» (Россия)

Этилентиомочевина (ЭТМ) - имидазолидин-2-тион (IUPAC)

C₃H₆N₂S

Мол. масса 102,17

Белое кристаллическое вещество без запаха. Температура плавления: 203 - 204 °С. Практически нерастворима в ацетоне, диэтиловом эфире, хлороформе, бензоле, керосине, умеренно растворима в метаноле, этаноле, уксусной кислоте, этиленгликоле, пиридине. Растворимость в воде - 20 г/дм³ (25 °С); 90 г/дм³ (60 °С); 440 г/дм³ (90 °С).

Острая пероральная токсичность (LD₅₀) для крыс - 550 - 1832 мг/кг; для мышей 2400 - 4000 мг/кг.

Гигиенические нормативы:

ДСД - 0,001 мг/кг массы тела.

МДУ во всех растительных и пищевых продуктах - 0,02 мг/кг

Область применения препарата

Препарат МЕТАКСИЛ, СП (640 г/кг манкоцеба + 80 г/кг металаксила) рекомендуется в качестве фунгицида на виноградной лозе; картофеле, огурцах, томатах открытого грунта; луке.

1. Метрологические характеристики метода

Метрологические характеристики метода представлены в таблицах 1 и 2.

Таблица 1

Метрологические параметры

^* - при соотношении сигнал/шум равном 5.

Таблица 2

Полнота извлечения ЭТМ из лука, винограда и виноградного сока, огурцов, томатов (томатного сока), картофеля (5 повторностей для каждой концентрации)

2. Метод измерений

Методика основана на определении вещества с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с ультрафиолетовым детектором после экстракции из анализируемых проб метанолом, очистки экстракта на колонке с оксидом алюминия.

Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.

В предлагаемых условиях определения метод специфичен в присутствии пестицидов, применяемых в интенсивной технологии выращивания лука, винограда, огурцов, томатов, картофеля.

3. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы

3.1. Средства измерений

Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

3.2. Реактивы

3.3. Вспомогательные устройства, материалы

Допускается применение другого оборудования и хроматографических колонок с аналогичными техническими характеристиками, обеспечивающими аналогичное разделение

4. Требования безопасности

4.1. При работе с реактивами соблюдают требования безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими, легковоспламеняющимися веществами (ГОСТ 12.1005).

4.2. При выполнении измерений с использованием газового и жидкостного хроматографов соблюдают правила электробезопасности в соответствии с ГОСТом 12.1.019 и инструкцией по эксплуатации прибора.

5. Требования к квалификации операторов

К выполнению измерений допускают лиц, имеющих квалификацию не ниже лаборанта-исследователя, с опытом работы на жидкостном хроматографе.

6. Условия измерений

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

· процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят согласно ГОСТу 15150 при температуре воздуха (20 ± 5) °С, атмосферном давлении 630 - 800 мм рт. ст. и относительной влажности не более 80 %.

· выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

7. Подготовка к определению

Выполнению измерений предшествуют следующие операции: очистка органических растворителей, подготовка подвижной фазы для ВЭЖХ, кондиционирование хроматографической колонки, приготовление градуировочных растворов, построение градуировочной характеристики, подготовка колонки для очистки экстракта, проверка хроматографического поведения вещества на колонке с оксидом алюминия.

7.1. Подготовка органических растворителей

Метилен хлористый последовательно промывают порциями концентрированной серной кислоты до тех пор, пока она не перестанет окрашиваться в желтый цвет, далее водой до нейтральной реакции промывных вод, перегоняют над поташом. Хранят над безводным сульфатом натрия.

Метанол подвергают перегонке при атмосферном давлении с дефлегматором.

7.2. Подготовка подвижной фазы для ВЭЖХ

В мерную колбу вместимостью 1000 см³ помещают 990 см³ бидистиллированной воды, добавляют 10 см³ метанола, перемешивают, фильтруют и дегазируют

7.3. Кондиционирование хроматографической колонки

Промывают колонку подвижной фазой для ВЭЖХ со скоростью подачи растворителя 0,3 см³/мин (анализ по п. 9.3.1) или 1 см³/мин (анализ по п. 9.3.2) до установления стабильной базовой линии.

7.4. Приготовление растворов для градуировки

7.4.1. Исследование проб лука, винограда и виноградного сока

7.4.1.1. Исходный раствор для градуировки (концентрация 1 мг/см³)

В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 0,1 г ЭТМ, доводят до метки бидистиллированной водой, тщательно перемешивают.

Исходный раствор хранится в холодильнике в течение 3-х месяцев в плотно закрытой посуде.

Растворы № 1 - 6 готовят объемным методом путем последовательного разбавления исходного раствора.

7.4.1.2. Раствор № 1 для градуировки (концентрация 10 мкг/см³)

В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 1 см³ исходного раствора для градуировки с концентрацией 1 мг/см³, доводят до метки бидистиллированной водой, тщательно перемешивают. Раствор хранится в холодильнике в течение месяца.

Этот раствор используют для приготовления проб с внесением при оценке полноты извлечения ЭТМ из исследуемых образцов.

7.4.1.3. Раствор № 2 для градуировки (концентрация 1 мкг/см³)

В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 10 см³ раствора № 1 для градуировки с концентрацией 10 мкг/см³, доводят до метки бидистиллированной водой, тщательно перемешивают. Раствор хранится в холодильнике в течение месяца.

7.4.1.4. Рабочие растворы №№ 3 - 6 для градуировки (соответствуют концентрациям 0,01 - 0,1 мкг/см³).

В 4 мерные колбы вместимостью 100 см³ помещают с помощью пипетки по 1; 2; 5 и 10 см³ раствора № 2 с концентрацией 1 мкг/см³ (п. 7.4.1.3), доводят до метки бидистиллированной водой, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы ЭТМ №№ 3 - 6 с концентрациями 0,01; 0,02; 0,05 и 0,1 мкг/см³, соответственно.

Растворы хранятся в холодильнике в течение недели.

7.4.2. Исследование проб картофеля, огурцов, томатов и томатного сока

7.4.2.1. Исходный раствор для градуировки (концентрация 100 мкг/см³)

В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 0,01 г ЭТМ, доводят до метки метанолом, тщательно перемешивают.

Исходный раствор хранится в морозильной камере при -12 °С не более 15 дней.

7.4.2.2. Раствор № 1а для градуировки (концентрация 5 мкг/см³)

В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 5 см³ исходного раствора для градуировки с концентрацией 100 мкг/см³ (п. 7.4.2.1), доводят до метки подвижной фазой для ВЭЖХ (п. 7.2).

7.4.2.3. Рабочие растворы №№ 2а - 5а дня градуировки (соответствуют концентрациям 0,025 - 0,5 мкг/см³).

В 4 мерные колбы вместимостью 100 см³ помещают с помощью пипетки по 0,5; 2,5; 5 и 10 см³ раствора № 1 с концентрацией 5 мкг/см³ (п. 7.4.2.2), доводят до метки подвижной фазой для ВЭЖХ (п. 7.2), тщательно перемешивают, получают рабочие растворы ЭТМ №№ 2а - 5а с концентрациями 0,025; 0,125; 0,25 и 0,5 мкг/см³, соответственно.

Растворы хранятся в холодильнике не более суток

7.5. Построение градуировочной характеристики

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пика (отн. единицы) от концентрации ЭТМ в растворе (мкг/см³), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4-м растворам для градуировки №№ 3 - 6 или 2а - 5а.

В инжектор хроматографа вводят по 20 мм³ каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.3.1. или 9.3.2. Осуществляют не менее 3-х параллельных измерений.

7.6. Подготовка колонки с оксидом алюминия для очистки экстракта

Оксид алюминия, помещенный на воронку Бюхнера, промывают трижды порциями метанола, равными объему сорбента, сушат разряжением, создаваемым водоструйным насосом, затем активируют в сушильном шкафу при 140 - 150 °С в течение 15-ти часов, охлаждают в эксикаторе.

При исследовании проб лука, винограда и виноградного сока нижнюю часть стеклянной колонки длиной 35 - 40 см, внутренним диаметром 13 - 15 мм уплотняют тампоном из стекловаты, медленно выливают в колонку (при открытом кране) суспензию 20 г оксида алюминия в 30 - 35 см³ хлористого метилена. Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента. После этого колонка готова к работе.

При исследовании проб картофеля, огурцов, томатов и томатного сока используют суспензию 7,5 г оксида алюминия в 20 см³ дихлорметана, а также колонку длиной 30 см.

7.7. Проверка хроматографического поведения ЭТМ на колонке с оксидом алюминия

7.7.1. Лук, виноград и виноградный сок

В круглодонную колбу вместимостью 10 см³ помещают 0,5 см³ раствора № 2 для градуировки (п. 7.4.1.3), добавляют 8 см³ метанола, перемешивают и наносят на колонку, подготовленную по п. 7.6. Промывают колонку 100 см³ смеси хлористый метилен-метанол (19:1, по объему) со скоростью 1 - 2 капли в сек. Фракционно (по 10 см³) отбирают элюат, упаривают, остатки растворяют в 5-ти см³ бидистиллированной воды, анализируют на содержание ЭТМ по п. 9.3.1.

7.7.2. Картофель, огурцов, томатов и томатный сок

В круглодонную колбу вместимостью 10 см³ помещают 0,05 см³ исходного раствора с концентрацией ЭТМ 100 мкг/см³ в метаноле (п. 7.4.2.1), удаляют растворитель слабым потоком чистого сжатого воздуха или инертного газа, остаток количественно переносят тремя порциями (1,5 + 1,5 + 2 см³) водного метанола (150 мг воды в 5 см³ метанола) на колонку, подготовленную по п. 7.6. Промывают колонку 90 см³ смеси хлористый метилен-метанол (19:1, по объему) со скоростью 1 - 2 капли в сек. Фракционно (по 6 см³) отбирают элюат, упаривают, остатки растворяют в 1 - 2-х см³ подвижной фазы для ВЭЖХ (п. 7.2), анализируют на содержание ЭТМ по п. 9.3.2.

Фракции, содержащие ЭТМ, объединяют и вновь анализируют.

Рассчитывают уровень вещества в элюате, определяют полноту смывания с колонки и необходимый для очистки объем элюента.

ПРИМЕЧАНИЕ: Проверку хроматографического поведения ЭТМ следует проводить обязательно, поскольку профиль вымывания может изменяться при использовании новой партии сорбентов и растворителей.

8. Отбор проб

Отбор проб производится в соответствии с «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов», утвержденными заместителем Главного государственного санитарного врача СССР 21.08.79 г., № 2051-79.

Отобранные пробы лука, винограда и виноградного сока анализируют в день отбора или хранят при 4 °С в течение 10-ти дней, срок хранения образцов огурцов, томатов, картофеля - не более недели.

Для длительного хранения пробы замораживают и хранят при температуре -18 °С. Непосредственно перед анализом образцы лука и винограда измельчают на гомогенизаторе, огурцов, томатов, картофеля - при помощи терки для овощей.

9. Выполнение определения

9.1. Экстракция

9.1.1. Лук, виноград, виноградный сок

Образец измельченного лука, ягод винограда или виноградного сока массой 20 г помещают в коническую колбу вместимостью 200 - 250 см³, вносят 100 см³ метанола. Колбы с образцами лука и ягод винограда встряхивают на механическом встряхивателе в течение 45-ти минут. Образец виноградного сока помещают на 2 часа в холодильник (4 - 6 °С).

Затем растворы фильтруют на воронке Бюхнера через двойной бумажный фильтр «красная лента» под вакуумом. Осадок на фильтре промывают дважды по 20 см³ метанола. Экстракт и промывку переносят в мерный цилиндр вместимостью 200 см³ с пришлифованной пробкой, перемешивают, измеряют объем раствора, ¹/₂ его часть (эквивалентную 10 г образца) переносят в круглодонную колбу и упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 45 °С до получения малоподвижной вязкой массы. Колбу с остатком отсоединяют от роторного испарителя. Оставшиеся капли конденсата выше уровня исходного фильтрата (около шлифа грушевидной колбы) удаляют с помощью фильтровальной бумаги. Для более полного освобождения от летучих продуктов содержимое колбы продувают слабой струей сжатого воздуха в течение 10 - 15 мин.

Далее проводят очистку экстракта по п. 9.2.1.

9.1.2. Картофель, огурцы, томаты, томатный сок

Образец измельченных огурцов, картофеля, томатов или томатного сока массой 25 г помещают в коническую колбу вместимостью 200 - 250 см³, вносят 50 см³ метанола. Содержимое колбы интенсивно перемешивают в течение 30-ти минут на магнитной мешалке. Полученный экстракт переносят на фильтр Шота, присоединенный через переходник к грушевидной колбе вместимостью 200 см³, и фильтруют с помощью водоструйного насоса. Осадок растительного материала на фильтре промывают 25 см³ метанола, фильтруя промывной раствор в ту же грушевидную колбу. Фильтрат упаривают при температуре не выше 60 °С до получения малоподвижной (томаты, томатный сок) или практически не текучей (огурцы, картофель) вязкой массы. Колбу с остатком отсоединяют от роторного испарителя. Оставшиеся капли конденсата выше уровня исходного фильтрата (около шлифа грушевидной колбы) удаляют с помощью фильтровальной бумаги. Для более полного освобождения от летучих продуктов содержимое колбы продувают слабой струей сжатого воздуха или инертного газа в течение 20 - 30 мин.

9.2. Очистка экстракта

9.2.1. Лук, виноград, виноградный сок

Высушенный экстракт, полученный по п. 9.1.1, растворяют при перемешивании и температуре 38 - 42 °С в 2 см³ метанола и 0,5 см³ бидистиллированной воды, помещая колбу на ультразвуковую баню. Затем в колбу вносят порциями по 2 см³ еще 6 см³ метанола. После прибавления последней порции колбу закрывают пришлифованной пробкой и помещают на ультразвуковую баню на 2 - 3 мин.

Полученный водно-метанольный раствор переносят в подготовленную по п. 7.3 колонку, дают растворителю стечь до верхнего края сорбента. ЭТМ элюируют с колонки 70 см³ смеси хлористый метилен-метанол (19:1, по объему), собирая элюат в круглодонную колбу вместимостью 150 см³. Раствор упаривают при температуре не выше 45 °С почти досуха, затем продувают слабой струей сжатого воздуха досуха. Остаток растворяют в 4 см³ бидистиллированной воды, помещая колбу на ультразвуковую баню. Раствор фильтруют при помощи набора для фильтрации проб (или через плотный тампон из стекловаты, помещенный в конусную воронку) и анализируют на содержание ЭТМ по п.п. 9.3.

9.2.2. Огурцы, томаты, томатный сок, картофель

Высушенный экстракт, полученный по п. 9.1.2, растворяют при медленном перемешивании и температуре 38 - 42 °С в 1 см³ метанола и строго определенного количества бидистиллированной воды, помещая колбу на ультразвуковую баню. Количество добавляемой воды оставляет 145, 150 и 350 мм³, соответственно для огурцов, томатов (томатного сока) и картофеля. Операция растворения высушенного экстракта занимает достаточно длительное время (от одного до 2-х часов). Затем в колбу вносят порциями по 1 см³ еще 4 см³ метанола. После прибавления каждой порции метанола содержимое колбы осторожно перемешивают, после прибавления последней порции колбу закрывают пришлифованной пробкой и помещают на ультразвуковую баню на 10 мин.

Полученный водно-метанольный раствор переносят в подготовленную по п. 7.3 колонку, дают растворителю стечь до верхнего края сорбента. ЭТМ элюируют с колонки 60 см³ смеси хлористый метилен-метанол (19:1, по объему), собирая элюат в круглодонную колбу вместимостью 100 см³. Раствор упаривают при температуре не выше 50 °С почти досуха, затем продувают слабой струей сжатого воздуха или инертного газа досуха. Остаток растворяют в 2 см³ бидистиллированной воды, помещая колбу на ультразвуковую баню. Раствор фильтруют при помощи набора для фильтрации проб (или через плотный тампон из стекловаты, помещенный в конусную воронку) и анализируют на содержание ЭТМ по п.п. 9.3.

9.3. Условия хроматографирования

9.3.1. Лук, виноград, виноградный сок

Хроматограф жидкостной с ультрафиолетовым детектором (Perkin-Elmer, США)

Колонка хроматографическая стальная, длиной 25 см, внутренним диаметром 2 мм, содержащая Spherisorb S5 ODS 2, зернением 5 мкм

Температура колонки: комнатная

Скорость потока элюента: 0,3 см³/мин

Рабочая длина волны: 233 нм

Чувствительность: 0,02 ед. абсорбции на шкалу

Объем вводимой пробы: 20 мкл

Подвижная фаза: вода-метанол (99:1, по объему)

Ориентировочное время выхода ЭТМ: 4,6 - 4,9 мин

Линейный диапазон детектирования 0,2 - 2,0 нг

Образцы, дающие пики, большие, чем градуировочные растворы с концентрацией 0,1 мкг/см³, разбавляют бидистиллированной водой.

9.3.2. Огурцы, томаты, томатный сок, картофель

Хроматограф жидкостной с ультрафиолетовым детектором, модель 1100 (Agilent Technologies, США)

Колонка хроматографическая стальная, длиной 25 см, внутренним диаметром 4,6 мм, содержащая Zorbax SB С18, зернением 5 мкм

Температура термостата колонки: 25 °С

Скорость потока элюента: 1 см³/мин

Рабочая длина волны: 233 нм

Чувствительность: 0,007 ед. абсорбции на шкалу

Объем вводимой пробы: 50 мкл

Подвижная фаза: вода - метанол (99:1, по объему)

Ориентировочное время выхода ЭТМ: 4,5 мин

Линейный диапазон детектирования 0,5 - 10 нг

Образцы, дающие пики, большие, чем градуировочные растворы с концентрацией 0,5 мкг/см³, разбавляют подвижной фазой (п. 7.2).

10. Обработка результатов анализа

Содержание ЭТМ в пробе рассчитывают по формуле:

X - содержание ЭТМ в пробе, мг/кг;

А - концентрация ЭТМ, найденная по градуировочному графику, мкг/см³;

V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, см³;

m - масса анализируемого образца, г.

К - коэффициент пересчета, учитывающий объем экстрактов проб, используемый для анализа, равный для лука, винограда и виноградного сока - 2, для огурцов, томатов, томатного сока, картофеля - 1.

11. Контроль погрешности измерений

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ ИСО 5725-1-6.2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».

12. Разработчики.

Юдина Т.В., Федорова Н.Е., Волкова В.Н. (Федеральный научный центр гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана); Братина И.В. (Федеральный центр Госсанэпиднадзора) - лук, виноград, виноградный сок

Белов М.Ю., Кулешова О.Ю. (ЗАО Фирма «Август») - огурцы, томаты, томатный сок, картофель.

СОДЕРЖАНИЕ