Государственное
санитарно-эпидемиологическое нормирование Государственные
санитарно-эпидемиологические 4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ Метод микробиологического
измерения Методические указания МУК 4.2.1783-03 МИНЗДРАВ РОССИИ МОСКВА 2004 Методические указания. - М.: Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России, 2004. 1. Разработаны: Российским государственным медицинским университетом (к.б.н. Н.И. Шеиной). 2. Утверждены Первым заместителем министра здравоохранения Российской Федерации - Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 24 октября 2003 г. 3. Введены в действие с 1 декабря 2003 г. 4. Введены впервые. Главный государственный санитарный врач Российской Федерации, Первый заместитель Министра здравоохранения Российской Федерации Г.Г. Онищенко 24 октября 2003 г. Дата введения: 1 декабря 2003 г. 4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ Метод микробиологического измерения концентрации клеток микроорганизма Penicillium canescens F-832 - продуцента ксиланазы в воздухе рабочей зоны Методические указания МУК 4.2.1783-03 1. Общие положения и область примененияНастоящие методические указания устанавливают методику проведения микробиологического количественного анализа концентрации клеток штамма Penicillium canescens F-832 - продуцента ксиланазы в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 100 до 3000 клеток в 1 м3 воздуха. Методические указания разработаны в соответствии с требованиями ГОСТ 12.1.005-88 «ССБТ. Воздух рабочей зоны. Общие санитарно-гигиенические требования» и ГОСТ Р 8.563-96 «Методики выполнения измерений». Методические указания предназначены для применения в лабораториях предприятий, организаций и учреждений, аккредитованных в установленном порядке на право проведения микробиологических исследований. 2. Характеристика штамма-продуцента ксиланазыМикроорганизм Penicillium canescens F-832 является продуцентом фермента ксиланазы. Штамм растет на различных агаризованных и жидких средах. Культура образует цепочки спор, обычно прямые или слегка извилистые, с гладкой оболочкой. На твердом сусло-агаре на 3 сутки роста при температуре 30 °С образует округлые радиально-складчатые морщинистые колонии с кремовым или сероватым налетом, диаметром 2 - 3 мм. На 4 - 5 сутки инкубации размеры колонии достигают 5 - 7 мм, конфигурация и складчатость колоний не изменяется, образуется воздушный мицелий со спорами бежевато-серого цвета, подошва колоний оранжево-коричневая. Штамм устойчив практически ко всем широко известным антибиотикам. ПДК штамма в воздухе рабочей зоны 2000 кл/м3, А. 3. Пределы измеренийМетодика обеспечивает выполнение измерений количества клеток продуцента ксиланазы в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 100 до 3000 клеток в 1 м3 воздуха при доверительной вероятности 0,95. 4. Метод измеренийПрямой метод основан на аспирации из воздуха клеток продуцента ксиланазы на поверхность плотной питательной среды (сусло-агар) и подсчета выросших колоний по типичным морфологическим признакам. Косвенный метод измерения концентрации штамма-продуцента основан на аспирации из воздуха микробных клеток на поверхность плотной питательной селективной среды и подсчета выросших колоний по зонам просветления, образующихся вокруг каждой колонии штамма как результат продукции ксиланазы на среде с окрашенной целлюлозой. 5. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалыПри выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства и материалы. 5.1. Средства измерений, вспомогательные устройства, материалыПрибор для бактериологического анализа воздуха, модель 818 (щелевой прибор Кротова) ТУ 64-12791-77 Термостаты электрические суховоздушные или водяные Автоклав электрический ГОСТ 9586-75 Бокс, оборудованный бактерицидными лампами Холодильник бытовой Весы лабораторные, аналитические типа ВЛА-200 Микроскоп биологический с иммерсионной системой типа «Биолам» Л-211 Лупа с увеличением ´ 10 ГОСТ 25706-83 Чашки Петри бактериологические плоскодонные, стеклянные, диаметром 100 мм Пробирки биологические, вместимостью 20 и 35 мл ГОСТ 10515-75 Пипетки мерные на 1, 5 и 10 мл ГОСТ 10515-75 Пипетки мерные на 1, 5 и 10 мл ГОСТ 1770-74 Колбы конические, вместимостью 250 и 500 мл ГОСТ 1770-74 Секундомер ГОСТ 9586-75 Барометр ГОСТ 24696-79 Марля медицинская ГОСТ 9412-77 Вата медицинская гигроскопическая ГОСТ 25556-81 5.2. Реактивы, растворыАнтибиотики: группы пенициллина, тетрациклина, цефалоспорина и др. амфотерицин или нистатин Спирт этиловый ректификат ГОСТ 5962-67 Среда для штамма-продуцента: агаризованное пивное сусло 5 - 6 °Б для штамма-продуцента (агар - 1,8 %, рН 5,9 - 6,1, режим стерилизации 1,1 - 1,2 ати в течение 30 мин) Бенгальский розовый Диметилсульфоксид Спирт этиловый ректификат ГОСТ 5962-67 Селективная среда для штамма-продуцента. Состав среды: КН2РО4 - 1 г; MgSO4×7Н3О - 0,5 г; (NH4)2SO4 - 0,7 г; целлюлоза порошковая в пересчете на сухое вещество - 0,9 г; лактоза - 0,3 г; дрожжевой экстракт - 0,5 г; агар - 18 г; вода дистиллированная - до 1000 мл 6. Требования безопасностиПри выполнении измерений концентрации клеток продуцента ксиланазы в воздухе рабочей зоны соблюдают следующие требования. 6.1. Правила техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.005-88. 6.2. Электробезопасность при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-79 и инструкции по эксплуатации прибора. 6.3. «Инструкции по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности» (1977). 6.4. Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами. 7. Требования к квалификации операторовК выполнению измерений и обработке их результатов допускают лиц с высшим или средним специальным образованием, прошедших соответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области микробиологических исследований. 8. Условия измеренийПроцессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят в нормальных условиях при температуре воздуха (20 ± 5 °С), атмосферном давлении 630 - 800 мм рт.ст. и влажности воздуха не более 80 %. 9. Проведение измерения9.1. Условия отбора проб воздухаДля определения продуцента ксиланазы воздух аспирируют при помощи аппарата Кротова со скоростью 10 л/мин на поверхность плотной питательной среды. Время аспирации воздуха (1 - 10 мин) зависит от предполагаемой концентрации клеток продуцента. Аппарат Кротова перед каждым отбором пробы воздуха тщательно протирают спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенку прибора; наружную и внутреннюю стенку крышки. На подвижной диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо. После отбора пробы воздуха и остановки диска, прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы. 9.2. Выполнение анализаПрямой метод предполагает учет количества типичных по морфологическим признакам колоний выросших на 3 - 5 сутки после посева воздуха и позволяет учитывать на чашке до 200 колоний продуцента. Сусло-агар расплавляют, остужают до 60 °С, добавляют свежеприготовленный в стерильной дистиллированной воде раствор одного из антибиотиков из расчета 50 мкл на 1 мл среды (пенициллин, стрептомицин, цефалотин или другой), для подавления посторонней бактериальной микрофлоры) и нистатина или амфотерицина 15 мкг/мл для подавления грибковой флоры. Чашки с застывшей средой помещают в термостат на сутки при температуре 37 °С, после чего проросшие чашки бракуют, стерильные чашки используют для контроля воздуха. При выполнении анализа воздуха рабочей зоны косвенным методом селективную среду расплавляют, остужают до 60 °С, добавляют 50 мг/л бенгальского розового, растворенного в 1 мл диметилсульфоксида, тщательно перемешивают и разливают по 10 мл в стеклянные чашки Петри на горизонтальной поверхности. Бенгальский розовый предназначен для специфического окрашивания целлюлозы и для ограничения разрастания колоний на чашках. После отбора проб воздуха чашки Петри помещают в термостат на 30 °С. На 3 - 5 сутки производят подсчет выросших типичных колоний продуцента по культурально-морфологическим признакам или по зонам просветления вокруг колоний как результат действия ксиланазы на окрашенную целлюлозу. При необходимости культуру подвергают микроскопированию. 10. Вычисление результатов измеренияРасчет концентрации клеток продуцента в пересчете на 1 м3 воздуха производят по формуле: кл./м3, где Х - концентрация клеток продуцента в воздухе; N - количество колоний продуцента, выросших на чашке; 1000 - коэффициент пересчета на 1 м3 воздуха; V - объем воздуха, л (произведение скорости на время аспирации). В случае невозможности использования аппарата Кротова, рекомендуется применять метод седиментации клеток продуцента из воздуха непосредственно на чашки Петри с плотной питательной средой. Время отбора проб воздуха может составлять до 30 мин. При использовании этого метода пользуются следующим расчетом концентрации клеток продуцента: эмпирически установлено, что за 5 мин на площадь 100 см2 оседает количество бактерий, содержащееся в 10 л воздуха, за 1 мин - 2 л воздуха. Площадь чашки Петри диаметром 100 мм равна 78,54 см2. Составляем пропорцию: на 100 см2 за 1 мин оседает 2 л воздуха на 78,54 см2 Х л Х = 1,57 л/мин. Следовательно, на стеклянную чашку Петри за 1 мин оседает 1,57 л воздуха. Надо определить количество клеток в 1 м3 воздуха. На 1 чашку (диаметр 100 мм) за 1 мин оседает количество микробов, содержащихся в 1,57 л воздуха, за Т мин - 1,57Т л. В этом количестве содержится N колониеобразующих единиц (микробных клеток - спор, обрывков мицелия), а в 1 м3 воздуха содержится . Пример: за 30 мин седиментации выросло 12 колоний микроорганизма. В 1 м3 воздуха содержится 12×636,9/30 = 253 клетки. 11. Оформление результатов измеренийРезультаты измерений оформляют протоколом по форме. Протокол №
Результаты микробиологического анализа
Ответственный исполнитель Научный руководитель Список литературы1. ГОСТ 12.1.005-88 «ССБТ. Воздух рабочей зоны. Общие санитарно-гигиенические требования». 2. ГОСТ 8.563-96. ГСИ «Методики выполнения измерений». 3. Положение об организации работы по технике безопасности в микробиологической промышленности. - М., 1980. 27 с. 4. Инструкции по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности. - М., 1977. 7 с. СОДЕРЖАНИЕ
|