ГОСУДАРСТВЕННОЕ САНИТАРНО-ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОЕ
НОРМИРОВАНИЕ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
ГОСУДАРСТВЕННЫЕ
САНИТАРНО-ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКИЕ
ПРАВИЛА И НОРМАТИВЫ
4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
Метод микробиологического измерения концентрации клеток микроорганизма Penicillium vermiculatum PK-1 - продуцент Вермикулена в воздухе рабочей зоны
Методические указания
МУК 4.2.1072-01
Минздрав России
Москва 2002
1. Разработаны к. б. н. Бару Р. В., к. б. н. Лапчинской А. В. (Государственный научный центр по антибиотикам).
2. Утверждены и введены в действие Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации - Первым заместителем министра здравоохранения Российской Федерации 20 сентября 2001 г.
3. Введены впервые.
СОДЕРЖАНИЕ
УТВЕРЖДАЮ
Главный государственный
санитарный врач Российской
Федерации - Первый заместитель
Министра здравоохранения
Российской Федерации
Г. Г. Онищенко
20 сентября 2001 г.
МУК 4.2.1072-01
Дата введения: с момента
утверждения
4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
Метод микробиологического измерения концентрации клеток микроорганизма Penicillium vermiculatum PK-1 - продуцент Вермикулена в воздухе рабочей зоны
Методические указания
1. Общие положения и область применения
Настоящие методические указания устанавливают методику проведения микробиологического количественного анализа концентрации клеток штамма Penicillium vermiculatum PK-1 - продуцент Вермикулена в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 100 до 3000 клеток в 1 м3 воздуха.
Методические указания разработаны в соответствии с требованиями ГОСТ 12.1.005-88 «ССБТ. Воздух рабочей зоны. Общие санитарно-гигиенические требования» и ГОСТ Р 8.563-96 «Методики выполнения измерений».
Методические указания предназначены для применения в лабораториях предприятий, организаций и учреждений, аккредитованных в установленном порядке на право проведения микробиологических исследований.
2. Характеристика штамма-продуцента Вермикулена
Микроорганизм Penicillium vermiculatum PK-1 является продуцентом Вермикулена. Биологический препарат Вермикулен представляет собой живую культуру (споры и мицелиальная масса микроорганизма Penicillium vermiculatum PK-l).
Penicillium vermiculatum PK-1 - аэроб, растет на жидких и агаризованных средах, оптимальная температура роста 25-30 °С, оптимальная рН от 5 до 8. Наиболее интенсивный рост гриба отмечается на картофельно-сахарозном агаре и агаризованной среде Чапека. На среде Чапека-Докса при культивировании при температуре 25 °С на 2-3 сутки образуются небольшие (2-5 мм в диаметре) округлые бархатистые колонии желто-бежеватого цвета, с обратной стороной от светло- до темнооливкового. Репродуктивными органами микроорганизма являются споры (конидии и обрывки мицелия).
ПДКр.з - 5000 кл/м3
3. Пределы измерений
Методика обеспечивает выполнение измерений количества клеток продуцента Вермикулена в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 100 до 30000 клеток в 1 м3 воздуха при доверительной вероятности 0,95.
4. Метод измерений
Метод основан на аспирации из воздуха клеток продуцента Вермикулена на поверхность плотной питательной среды и подсчете выросших колоний по типичным морфологическим признакам.
5. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы
При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства и материалы.
5.1. Средства измерений, вспомогательные устройства, материалы
Прибор для бактериологического анализа воздуха, модель 818 (щелевой прибор Кротова) ТУ 64-12791-77
Термостаты электрические суховоздушные или водяные
Автоклав электрический ГОСТ 9586-75
Бокс, оборудованный бактерицидными лампами
Холодильник бытовой
Весы лабораторные, аналитические типа ВЛА-200
Микроскоп биологический с иммерсионной системой типа «Биолам» Л-211
Лупа с увеличением х 10 ГОСТ 25706-83
Чашки Петри бактериологические плоскодонные стеклянные, диаметром 100 мм
Пробирки биологические, вместимостью 20 и 35 мл ГОСТ 10515-75
Пипетки мерные на 1, 5 и 10 мл ГОСТ 10515-75
Пипетки мерные на 1, 5 и 10 мл ГОСТ 1770-74
Колбы конические, вместимостью 250 и 500 мл ГОСТ 1770-74
Секундомер ГОСТ 9586-75
Барометр ГОСТ 24696-79
Марля медицинская ГОСТ 9412-77
Вата медицинская гигроскопическая ГОСТ 25556-81
5.2. Реактивы, растворы
Антибиотики группы аминогликозидов (канамицин, неомицин и др.)
Спирт этиловый ректификат ГОСТ 5962-67
Селективная среда Чапека-Докса для штамма-продуцента: NaNO3 - 3,0 г; MgSO4 K2HPO4 - 1,0 г; KCL - 0,5 г; MgSO4×7Н2O - 0,5 г; FeSO4×7Н2O - 0,01 г; сахароза - 30 г; агар - 20 г; вода дистиллированная - до 1000 мл; рН - 6,0; стерилизация при 121 °С; 30 мин.
6. Требования безопасности
При выполнении измерений концентрации клеток продуцента Вермикулена в воздухе рабочей зоны соблюдают:
· правила техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.005-88;
· правила электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-79 и инструкцию по эксплуатации прибора;
· требования, изложенные в руководстве «Положение об организации работы по технике безопасности в микробиологической промышленности» (1980);
· положения «Инструкций по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности» (1977).
Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами.
7. Требования к квалификации операторов
К выполнению измерений и обработке их результатов допускаются лица с высшим или средним специальным образованием, прошедшие соответствующую подготовку и имеющие навыки работы в области микробиологических исследований.
8. Условия измерений
Процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят в нормальных условиях при температуре воздуха (20 ± 5) °С, атмосферном давлении 630-800 мм рт. ст. и влажности воздуха не более 80 %.
9. Проведение измерения
9.1. Условия отбора проб воздуха
Для определения продуцента Вермикулена воздух аспирируют при помощи аппарата Кротова со скоростью 10 л/мин на поверхность плотной питательной среды. Время аспирации воздуха (1-10 мин) зависит от предполагаемой концентрации клеток продуцента.
Аппарат Кротова перед каждым отбором пробы воздуха тщательно протирают спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенку прибора; наружную и внутреннюю стенку крышки. На подвижный диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо. После отбора пробы воздуха и остановки диска прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы.
9.2. Выполнение анализа
Метод предполагает учет количества типичных по морфологическим признакам колоний, выросших на 2-3 сутки после посева воздуха. Прямой метод позволяет учитывать на чашке до 200 колоний продуцента.
Селективную среду расплавляют, остужают до 60 °С, добавляют свежеприготовленный в стерильной дистиллированной воде раствор антибиотика (канамицин, неомицин) из расчета 25-50 мкг на 1 мл среды (для подавления посторонней бактериальной микрофлоры), тщательно перемешивают и разливают по 10-15 мл в стеклянные чашки Петри на горизонтальной поверхности. Чашки с застывшей средой помещают в термостат на сутки при температуре 37 °С, после чего проросшие чашки бракуют, стерильные чашки используют для контроля воздуха.
После отбора проб воздуха чашки Петри помещают в термостат на 25 °С. Через 48-72 ч производят подсчет выросших типичных колоний продуцента. При необходимости культуру подвергают микроскопированию.
10. Вычисление результатов измерения
Расчет концентрации клеток продуцента в пересчете на 1 м3 воздуха производят по формуле:
кл/м3,
где
Х - концентрация клеток продуцента в воздухе;
N - количество колоний продуцента, выросших на чашке;
1000 - коэффициент пересчета на 1 м3 воздуха;
V - объем воздуха, л (произведение скорости на время аспирации).
В случае невозможности использования аппарата Кротова, рекомендуется применять метод седиментации клеток продуцента из воздуха непосредственно на чашки Петри с плотной питательной средой. Время отбора проб воздуха может составлять до 60 мин (при определении концентрации микроорганизма в атмосферном воздухе). При использовании этого метода пользуются следующим расчетом концентрации клеток продуцента:
эмпирически установлено, что за 5 мин на площадь 100 см2 оседает количество бактерий, содержащееся в 10 л воздуха, за 1 мин - в 2 л воздуха. Площадь чашки Петри диаметром 100 мм равна 78,54 см2.
Составляем пропорцию:
на 100 см2 за 1 мин оседает 2 л воздуха
на 78,54 см2 - Х л
Х= 1,57 л/мин.
Следовательно, на стеклянную чашку Петри за 1 мин оседает 1,57 л воздуха.
Надо определить количество клеток в 1 м3 воздуха.
На 1 чашку (диаметр 100 мм) за 1 мин оседает количество микробов, содержащихся в 1,57 л воздуха, за Т мин - 1,57×Т л.
В этом количестве содержится N колониеобразующих единиц (микробных клеток - спор, обрывков мицелия), а в 1 м3 воздуха содержится
Пример: за 30 мин седиментации выросло 12 колоний микроорганизма. В 1 м3 воздуха содержится
= 253
клетки
11. Оформление результатов измерений
Результаты измерений оформляют протоколом по форме.
Протокол №
количественного микробиологического анализа штамма Penicillium vermiculatum PK-1 - продуцента Вермикулена в воздухе рабочей зоны
Дата проведения анализа
Место отбора пробы
Название лаборатории
Юридический адрес организации
Результаты микробиологического анализа
|
Шифр или № пробы |
Определяемый микроорганизм |
Концентрация кл/м3 |
Ответственный исполнитель
Научный руководитель
Список литературы
1. ГОСТ 12.1. 005-88 «ССБТ. Воздух рабочей зоны. Общие санитарно-гигиенические требования».
2. ГОСТ 8.563-96 «ГСИ. Методики выполнения измерений».
3. Положение об организации работы по технике безопасности в микробиологической промышленности (М., 1980, 27 с.).
4. Инструкции по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности (М., 1977, 7 с.).