ГОСУДАРСТВЕННОЕ САНИТАРНО-ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОЕ ГОСУДАРСТВЕННЫЕ
САНИТАРНО-ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКИЕ 4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. Метод микробиологического измерения Методические указания МУК 4.2.1070-01 Минздрав России 1. Разработаны к. м. н. В. И. Бобровым (ВНЦ по безопасности биологически активных веществ). 2. Утверждены и введены в действие Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации - Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации 20 сентября 2001 г. 3. Введены впервые. СОДЕРЖАНИЕ УТВЕРЖДАЮ Главный государственный санитарный врач Российской Федерации - Первый заместитель Министра здравоохранения Российской Федерации Г. Г. Онищенко 20 сентября 2001 г. МУК 4.2.1070-01 Дата введения: с момента утверждения 4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ Метод микробиологического измерения концентрации клеток микроорганизма Trichoderma longibrachiatum TW-1 - продуцента b-глюканазы в воздухе рабочей зоны Методические указания 1. Общие положения и область примененияНастоящие методические указания устанавливают методику проведения микробиологического количественного анализа концентрации клеток штамма - Trichoderma longibrachiatum TW-1-продуцента b-глюканазы в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 100 до 6000 клеток в 1 м3 воздуха. Методические указания разработаны в соответствии с требованиями ГОСТ 12.1.005-88 «ССБТ. Воздух рабочей зоны. Общие санитарно-гигиенические требования» и ГОСТ Р 8.563-96 «Методики выполнения измерений». Методические указания предназначены для применения в лабораториях предприятий, организаций и учреждений, аккредитованных в установленном порядке на право проведения микробиологических исследований. 2. Характеристика штамма-продуцента b-глюканазыПродуцент b-глюканазы Trichoderma longibrachiatum TW-1 относится к классу несовершенных грибов. Рост характерных колоний определяется на 5-6 сутки. На агаризованной среде СМ микроорганизм образует характерные колонии до 15 мм в диаметре с гладкой подошвой, не врастающие в агар, с волнистым краем, пушистым воздушным мицелием, который покрыт спорами белого и желтого цвета. Гифы мицелия бесцветные, септированные, многократно ветвистые. Оптимальная температура роста 28-30 °С. Предельно допустимая концентрация (ПДК) в воздухе рабочей зоны - 5000 кл/м3, 3 класс опасности, пометка А. 3. Пределы измеренийМетодика обеспечивает выполнение измерений количества клеток продуцента b-глюканазы в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 100 до 6000 клеток в 1 м3 воздуха при доверительной вероятности 0,95. 4. Метод измеренийМетод измерения концентрации штамма-продуцента основан на аспирации из воздуха микробных клеток (спор, фрагментов мицелия) продуцента b-глюканазы на поверхность плотной питательной среды СМ и подсчета выросших колоний по зонам просветления, образующихся вокруг каждой колонии штамма как результат продукции b-глюканазы на среде с окрашенной целлюлозой. 5. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалыПри выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства и материалы. 5.1. Средства измерений, вспомогательные устройства, материалы Прибор для бактериологического анализа воздуха, модель 818 (щелевой прибор Кротова) ТУ 64-12791-77 Термостаты электрические суховоздушные или водяные Автоклав электрический ГОСТ 9586-75 Бокс, оборудованный бактерицидными лампами Холодильник бытовой Весы лабораторные, аналитические типа ВЛА-200 Микроскоп биологический с иммерсионной системой типа «Биолам» Л-211 Лупа с увеличением х 10 ГОСТ 25706-83 Чашки Петри бактериологические плоскодонные стеклянные, диаметром 100 мм Пробирки биологические, вместимостью 20 и 35 мл ГОСТ 10515-75 Пипетки мерные на 1, 5 и 10 мл ГОСТ 10515-75 Пипетки мерные на 1,5, и 10 мл ГОСТ 1770-74 Колбы конические, вместимостью 250 и 500 мл ГОСТ 1770-74 Секундомер ГОСТ 9586-75 Барометр ГОСТ 24696-79 Марля медицинская ГОСТ 9412-77 Вата медицинская гигроскопическая ГОСТ 25556-81 5.2. Реактивы, растворы Бенгальский розовый Диметилсульфоксид Спирт этиловый ректификат ГОСТ 5962-67 Селективная среда для штамма-продуцента b-глюканазы Состав среды: КН2РO4- 1 г; MgSO4×7Н2O - 0,5 г; (NH4)2SO4 - 5 г; целлюлоза порошковая в пересчете на сухое вещество - 5 г; глюкоза - 5 г; дрожжевой экстракт - 0,5 г; агар - 20 г; вода дистиллированная - до 1000 мл. 6. Требования безопасностиПри выполнении измерений концентрации клеток продуцента b-глюканазы в воздухе рабочей зоны соблюдают: · правила техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.005-88; · правила электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-79 и инструкцию по эксплуатации прибора; · требования, изложенные в руководстве «Положение об организации работы по технике безопасности в микробиологической промышленности» (1980); · положения «Инструкций по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности» (1977). Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами. 7. Требования к квалификации операторовК выполнению измерений и обработке их результатов допускаются лица с высшим или средним специальным образованием, прошедшие соответствующую подготовку и имеющие навыки работы в области микробиологических исследований. 8. Условия измеренийПроцессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят в нормальных условиях при температуре воздуха (20 ± 5) °С, атмосферном давлении 630-800 мм рт. ст. и влажности воздуха не более 80 %. 9. Проведение измерений9.1. Условия отбора проб воздуха Для определения продуцента b-глюканазы воздух аспирируют при помощи аппарата Крогова со скоростью 10 л/мин на поверхность плотной питательной среды. Время аспирации воздуха (1- 10 мин) зависит от предполагаемой концентрации клеток продуцента, а прямой метод позволяет учитывать на чашке до 200 колоний продуцента. Аппарат Кротова перед каждым отбором пробы воздуха тщательно протирают спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенку прибора, наружную и внутреннюю стенку крышки. На подвижный диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо. После отбора пробы воздуха и остановки диска, прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы. 9.2. Выполнение анализа Метод предполагает учет количества колоний, выросших на 2-3 сутки после посева проб воздуха по зонам просветления, которые являются результатом образования целлюлаз на срезах с окрашенной целлюлозой в присутствии повышенного количества глюкозы. Существенным признаком промышленных мутантов рода Trichoderma является пониженная катаболическая репрессия по сравнению с дикими мутантами Trichoderma. В то время как у диких штаммов глюкоза в концентрациях выше 0,02 г/л практически полностью подавляет образование целлюлаз в глубинной культуре, у промышленных мутантов подавление образования целлюлаз начинается при концентрациях глюкозы выше 1 г/л. Селективную среду расплавляют, остужают до 60 °С, добавляют 50 мг/л бенгальского розового, растворенного в 1 мл диметил-сульфоксида, тщательно перемешивают и разливают по 10 мл в стеклянные чашки Петри на горизонтальной поверхности. Бенгальский розовый предназначен для специфического окрашивания целлюлозы и для ограничения разрастания колоний на чашках. Чашки с застывшей средой помещают в термостат на сутки при температуре 37 °С, после чего проросшие чашки бракуют, стерильные чашки используют для контроля воздуха. После отбора проб воздуха чашки Петри помещают в термостат при 28-30 °С на 2 дня и затем при температуре 44 °С на 18 ч для образования вокруг колоний зон просветления. Количественный учет микробных клеток штамма-продуцента b-глюканазы проводится методом подсчета зон просветления, образующихся вокруг колоний микроорганизма как результат продукции глюканазы на среде СМ с окрашенной целлюлозой. 10. Вычисление результатов измеренийРасчет концентрации клеток продуцента в пересчете на 1 м3 воздуха производят по формуле: кл/м3, где Х - концентрация клеток продуцента в воздухе; N - количество колоний продуцента, выросших на чашке; 1000 - коэффициент пересчета на 1 м3 воздуха; V - объем воздуха, л (произведение скорости на время аспирации). 11. Оформление результатов измеренийРезультаты измерений оформляют протоколом по форме: Протокол № количественного микробиологического анализа штамма-продуцента Trichoderma longibrachiatum TW-1 в воздухе рабочей зоны Дата проведения анализа Место отбора пробы Название лаборатории Юридический адрес организации Результаты микробиологического анализа
Ответственный исполнитель Научный руководитель Список литературы1. ГОСТ 12.1.005-88 «ССБТ. Воздух рабочей зоны. Общие санитарно-гигиенические требования». 2. ГОСТ 8.563-96 «ГСИ. Методики выполнения измерений». 3. Положение об организации работы по технике безопасности в микробиологической промышленности (М., 1980, 27 с.). 4. Инструкции по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности (М., 1977, 7 с.). |