ГОСУДАРСТВЕННОЕ САНИТАРНО-ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОЕ
НОРМИРОВАНИЕ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
ГОСУДАРСТВЕННЫЕ
САНИТАРНО-ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКИЕ
ПРАВИЛА И НОРМАТИВЫ
4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ.
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
Метод микробиологического измерения
концентрации клеток плесневого гриба
Penicillium funiculosum F-149 - продуцента
декстраназы в воздухе рабочей зоны
Методические указания
МУК 4.2.1069-01
Минздрав России
Москва 2002
1. Разработаны д. м. н. Ивановым Н. Г., к. б. н. Шеиной Н. И. (Российский государственный медицинский университет).
2. Утверждены и введены в действие Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации - Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации 20 сентября 2001 г.
3. Введены впервые.
СОДЕРЖАНИЕ
УТВЕРЖДАЮ
Главный государственный
санитарный врач Российской
Федерации - Первый заместитель
Министра здравоохранения
Российской Федерации
Г. Г. Онищенко
20 сентября 2001 г.
МУК 4.2.1069-01
Дата введения: с момента
утверждения
4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
Метод микробиологического измерения концентрации клеток плесневого гриба Penicillium funiculosum F-149-продуцента декстраназы в воздухе рабочей зоны
Методические указания
1. Общие положения и область применения
Настоящие методические указания устанавливают методику проведения микробиологического количественного анализа концентрации клеток штамма Penicillium funiculosum F-149 - продуцента декстраназы в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 100 до 5000 клеток в 1 м3 воздуха.
Методические указания разработаны в соответствии с требованиями ГОСТ 12.1.005-88 «ССБТ. Воздух рабочей зоны. Общие санитарно-гигиенические требования» и ГОСТ Р 8.563-96 «Методики выполнения измерений».
Методические указания предназначены для применения в лабораториях предприятий, организаций и учреждений, аккредитованных в установленном порядке на право проведения микробиологических исследований.
2. Биологическая характеристика плесневого гриба Penicillium funiculosum F-149 и его гигиенический норматив
Систематическое положение микроорганизма
Класс Fungi imperfecti
Порядок Hyphomycetales
Семейство Mucedinaceae
Род Penicillium
Секция Biverticillata
Вид funiculosum
Штамм F-149
Округлые колонии имеют 4-5 мм в диаметре, в зависимости от плотности посева могут достигать 11 мм в диаметре. Поверхность колоний слабо шероховатая, пушистая, консистенция мягкая. Воздушный мицелий имеет белоснежно-белую окраску. На 3-4 день развития желтовато-кремовый субстрат меняет свою окраску, становясь ярко-оранжевым. Продолжительность развития гриба составляет 26-30 дней. Репродуктивными органами гриба являются конидиеносцы с конидиями (споры), может также размножаться вегетативно (фрагментами мицелия).
Штамм Penicillium funiculosum F-149 получен из Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов ГНИИгенетики. Штамм является продуцентом декстраназы. Активность по методу Нельсона составляет 10-12 ед/мл культуральной жидкости. Изучаемый штамм выделен из почвы, аэроб, растет на жидких и агаризованных средах. Оптимальная температура роста 28-30 °С, оптимальный рН 6-8. Наиболее интенсивный рост наблюдается на агаризованном пивном сусле 7 °Б, для выращивания могут также использоваться картофельно-сахарозный агар, агаризованная среда Чапека, среда Чапека-Докса.
Предельно допустимая концентрация (ПДК) в воздухе рабочей зоны - 2000 кл/м3, пометка А.
3. Пределы измерений
Методика обеспечивает выполнение измерений количества клеток плесневого гриба в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 100 до 3000 клеток в 1 м3 воздуха при доверительной вероятности 0,95.
4. Метод измерений
Метод основан на аспирации из воздуха клеток плесневого гриба на поверхность плотной питательной среды и подсчета выросших колоний по типичным морфологическим признакам и ярко-оранжевому окрашиванию субстрата на 3-4 сутки. Вопрос о корреляции между пигментной и ферментативной активностью плесневого гриба требует дополнительных исследований.
5. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы
При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства и материалы.
5.1. Средства измерений, вспомогательные устройства, материалы
Прибор для бактериологического анализа воздуха, модель 818 (щелевой прибор Кротова) ТУ 64-12791-77
Термостаты электрические суховоздушные или водяные
Автоклав электрический ГОСТ 9586-75
Бокс, оборудованный бактерицидными лампами
Холодильник бытовой
Весы лабораторные, аналитические типа ВЛА-200
Микроскоп биологический с иммерсионной системой типа «Биолам» Л-211
Лупа с увеличением х 10 ГОСТ 25706-83
Чашки Петри бактериологические плоскодонные стеклянные, диаметром 100 мм
Пробирки биологические, вместимостью 20 и 35 мл ГОСТ 10515-75
Пипетки мерные на 1,5 и 10 мл ГОСТ 10515-75
Пипетки мерные на 1,5, и 10 мл ГОСТ 1770-74
Колбы конические, вместимостью 250 и 500 мл ГОСТ 1770-74
Секундомер ГОСТ 9586-75
Барометр ГОСТ 24696-79
Марля медицинская ГОСТ 9412-77
Вата медицинская гигроскопическая ГОСТ 25556-81
5.2. Реактивы, растворы
Антибиотики группы аминогликозидов: канамицин, неомицин и др.
Спирт этиловый ректификат ГОСТ 5962-67
Агаризованное пивное сусло 7 °Б для штамма-продуцента (агар - 1,8 %, рН 6,8, режим стерилизации 1,1-1,2 атм в течение 30 мин)
6. Требования безопасности
При выполнении измерений концентрации клеток штамма-продуцента в воздухе рабочей зоны соблюдают:
· правила техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.005-88;
· правила электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-79 и инструкцию по эксплуатации прибора;
· требования, изложенные в руководстве «Положение об организации работы по технике безопасности в микробиологической промышленности» (1980);
· положения «Инструкций по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности» (1977).
Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами.
7. Требования к квалификации операторов
К выполнению измерений и обработке их результатов допускаются лица с высшим или средним специальным образованием, прошедшие соответствующую подготовку и имеющие навыки работы в области микробиологических исследований.
8. Условия измерений
Процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят в нормальных условиях при температуре воздуха (20 ± 5) °С, атмосферном давлении 630-800 мм рт. ст. и влажности воздуха не более 80 %.
9. Проведение измерений
9.1. Условия отбора проб воздуха
Для определения концентрации клеток плесневого гриба воздух аспирируют при помощи аппарата Кротова со скоростью 10 л/мин на поверхность плотной питательной среды - пивное агаризованное сусло 7 °Б. Время аспирации воздуха (1-10 мин) зависит от предполагаемой концентрации клеток штамма-продуцента.
Аппарат Кротова перед каждым отбором пробы воздуха тщательно протирают спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенку прибора; наружную и внутреннюю стенку крышки. На подвижный диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо. После отбора пробы воздуха и остановки диска прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы.
9.2. Выполнение анализа
Метод предполагает учет количества типичных по морфологическим признакам колоний, выросших на 3-4 сутки после посева воздуха. Прямой метод позволяет учитывать на чашке до 200 колоний продуцента.
Агаризованное пивное сусло 7 °Б расплавляют, остужают до 50-60 °С, добавляют свежеприготовленный в стерильной дистиллированной воде раствор антибиотика (канамицин, неомицин и др.) из расчета 20-30 мг на 1 л среды (для подавления посторонней бактериальной микрофлоры), тщательно перемешивают и разливают по 10 мл в стеклянные чашки Петри на горизонтальной поверхности.
Чашки с застывшей средой помещают в термостат на сутки при температуре 37 °С, после чего проросшие чашки бракуют, стерильные чашки используют для контроля воздуха.
После отбора проб воздуха чашки Петри помещают в термостат при температуре 28-30 °С. Через 72 ч производят подсчет выросших типичных колоний продуцента. При необходимости культуру подвергают микроскопированию.
10. Вычисление результатов измерений
Расчет концентрации клеток продуцента в пересчете на 1 м3 воздуха производят по формуле:
кл/м3,
где
Х - концентрация клеток продуцента в воздухе;
N - количество колоний продуцента, выросших на чашке;
1000 - коэффициент пересчета на 1 м3 воздуха;
V - объем воздуха, л (произведение скорости на время аспирации).
В случае невозможности использования аппарата Кротова, рекомендуем применять метод седиментации клеток продуцента из воздуха непосредственно на чашки Петри с плотной питательной средой. Время отбора проб воздуха может составлять до 30 мин. При использовании этого метода пользуются следующим расчетом концентрации клеток продуцента:
эмпирически установлено, что за 5 мин на площадь 100 см2 оседает количество бактерий, содержащееся в 10 л воздуха, следовательно, за 1 мин - количество бактерий из 2 л воздуха. Площадь чашки Петри диаметром 100 мм равна 78,54 см2. Составляя пропорцию, определяем, что за 1 мин на стеклянную чашку Петри оседают клетки, содержащиеся в 1,57 л воздуха. Количество клеток в 1 м3 воздуха определяем по вышеприведенной формуле, где V = 1,57 л/мин×t (время аспирации, мин).
Предлагаемый метод является ориентировочным и может быть использован как вспомогательный метод.
11. Оформление результатов измерений
Результаты измерений оформляют протоколом по форме.
Протокол №
количественного микробиологического анализа штамма-продуцента Penicillium funiculosum F-149 в воздухе рабочей зоны
Дата проведения анализа
Место отбора пробы
Название лаборатории
Юридический адрес организации
Результаты микробиологического анализа
|
Шифр или № пробы |
Определяемый микроорганизм |
Концентрация, кл/м3 |
Ответственный исполнитель
Научный руководитель
Список литературы
1. ГОСТ 12.1.005-88 «ССБТ. Воздух рабочей зоны. Общие санитарно-гигиенические требования».
2. ГОСТ 8.563-96 «ГСИ. Методики выполнения измерений».
3. Положение об организации работы по технике безопасности в микробиологической промышленности (М., 1980, 27 с.).
4. Инструкции по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности (М., 1977, 7 с.).