Дополнение
к документу "Временные гигиенические нормативы и метод
определения содержания гистамина в рыбопродуктах"

(утв. заместителем Главного государственного санитарного врача СССР
31 марта 1987 г. № 4274-87)

Необходимость дополнения документа колориметрическим методом определения гистамина обусловлена недостаточной оснащенностью лабораторий рыбоперерабатывающих предприятий спектрофлуориметрами, которые требуются для осуществления контроля гистамина в рыбопродуктах флуориметрическим методом. Колориметрический метод выделения, идентификации и количественного определения гистамина в рыбных продуктах предполагает использование широко распространенных отечественных колориметров или спектрофотометров и прост в использовании.

Метод
выделения, идентификации и количественного определения гистамина в
рыбопродуктах (колориметрический метод)

1. Сущность метода

В основе колориметрического метода определения гистамина лежит измерение величины абсорбции окрашенного производного, полученного при взаимодействии гистамина с диазореактивом. Предел обнаружения метода - 10 мг/кг, относительное стандартное отклонение при определении гистамина в интервале концентраций 20 - 175 мг/кг изменяется от 0,08 до 0,25. Степень извлечения добавленного к образцу стандарта гистамина - 94 - 99 %.

2. Аппаратура, материалы, реактивы

Баня водяная.

Весы лабораторные общего назначения 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г по ГОСТ 24104-80 с допускаемой погрешностью взвешивания ±0,001 г.

Весы лабораторные общего назначения 3-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 1 кг по ГОСТ 24104-80 с допускаемой погрешностью взвешивания ±0,1 г.

Воронки В-100-150-ХС; В-35-50-ХС по ГОСТ 25336-82.

Воронки делительные ВД-3-250-29/32 ХС по ГОСТ 25336-82.

Колбы конические К_н - 1-100-29/32 по ГОСТ 25336-82.

Колбы мерные 1-100-2 или 2-100-2 по ГОСТ 1770-74.

Колориметр фотоэлектрический по ГОСТ 12083-78 со светофильтром с λ = 490 ± 10 нм или спектрофотометр СФ-26 (или другой аналогичный). Микроразмельчитель тканей РТ-2 по МРТУ 64-1-1505-63.

Мясорубка по ГОСТ 4025-83.

Пипетки 4-1-1 или 5-1-1, 7-1-5 или 7-2-5; 7-1-10 или 7-2-10 по ГОСТ 20292-74.

Пробирки мерные П-2-10 или П-2-15 по ГОСТ 1770-74.

Термометр 0 - 100 °С по ГОСТ 2045-71.

Холодильник бытовой.

Шкаф лабораторный сушильный.

Цилиндры мерные 1 - 50 или 2 - 50 по ГОСТ 1770-74.

Электроплитка бытовая по ГОСТ 14919-83.

Бумага фильтровальная по ГОСТ 12026-76.

н-бутанол по ГОСТ 6006-78, ч.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709-72.

Гистамин или гидрохлорид гистамина.

Кислота соляная по ГОСТ 3118-77, х.ч., раствор 3,75 г/дм³ (0,1 н раствор).

Кислота трихлоруксусная по ТУ 6-09-1926-77, раствор 50 г/дм³ (5 %-ный раствор).

Натрий азотистокислый по ГОСТ 4197-74, ч.д.а., раствор 50 г/дм³ (5 %-ный раствор).

Натрия гидроокись по ГОСТ 4328-77, ч.д.а., раствор 200 г/дм³ (5 н раствор).

Натрий сернокислый безводный по ГОСТ 4166-76, х.ч., прокаленный.

Натрий углекислый по ГОСТ 83-79, х.ч., раствор 40 г/дм³ (4 %-ный раствор).

Паранитроанилин, ч.д.а.

Этилацетат по ГОСТ 22300-76, ч.д.а.

3. Подготовка к испытанию

3.1. Приготовление раствора паранитроанилина

Паранитроанилин очищают путем перекристаллизации в воде. Для этого растворяют его в горячей дистиллированной воде и охлаждают раствор до комнатной температуры. Выпавшие кристаллы отфильтровывают и высушивают при 80 °С в течение 10 - 15 мин, 0,1 г паранитроанилина растворяют в 100 см³ 0,1 н соляной кислоты. Хранят раствор в холодильнике до момента употребления.

3.2. Приготовление диазореактива

Диазореактив получают непосредственно перед использованием путем смешивания 10 см³ раствора 1 г/дм³ паранитроанилина в 0,1 н соляной кислоте и 1 см³ раствора 50 г/дм³ азотистокислого натрия и охлаждают до 0 °С.

3.3. Приготовление н-бутанола, насыщенного водой

Для приготовления н-бутанола, насыщенного водой, встряхивают 50 см³ н-бутанола и 20 см³ дистиллированной воды в делительной воронке. После разделения фаз отделяют верхний бутанольный слой.

3.4. Подготовка проб к анализу

Отбор проб проводится по ГОСТ 7631-85 "Рыба, морские млекопитающие, морские беспозвоночные и продукты их переработки. Правила приемки, органолептические методы оценки качества, методы отбора проб для лабораторных испытаний" и ГОСТ 8756.0-70 "Продукты пищевые консервированные. Отбор проб и подготовка их к испытанию".

Образцы доставляют в лабораторию сразу же после отбора проб. В случае длительной транспортировки (более 1 ч) рыба-сырец должна транспортироваться в охлажденном состоянии, а мороженая - в замороженном состоянии. Исследование образцов должно проводиться в день доставки их в лабораторию. При отсутствии такой возможности образцы должны храниться при температуре не выше -8 °С не более трех суток.

Доставка и хранение образцов консервов и другой продукции должны проводиться с соблюдением режимов, предусмотренных НТД (действующими инструкциями и стандартами).

3.5. Экстракция

Навеску 10 г (с точностью до 0,01 г) приготовленного образца помещают в сосуд микроразмельчителя тканей, добавляют 25 см³ 5 %-ного раствора трихлоруксусной кислоты и перемешивают 5 мин. Полученную смесь переносят в плоскодонную коническую колбу на 100 см³ ополаскивают сосуд смесителя дважды 5 - 10 см³ 5 %-ного раствора трихлоруксусной кислоты; растворы объединяют. Колбу снабжают воздушным холодильником и выдерживают на водяной бане при 60 °С в течение 15 мин. Охлажденную смесь переносят количественно в цилиндр, доводят до 50 см³ 5 %-ным раствором трихлоруксусной кислоты и фильтруют через складчатый бумажный фильтр (фильтрат 1).

3.6. Построение калибровочной кривой

Готовят стандартные растворы гистамина с концентрацией 5, 10, 20 и 40 мкг/см³ в 5 %-ной трихлоруксусной кислоте. Для приготовления основного раствора гистамина с концентрацией 40 мкг/см³ 4,0 мг гистамина помещают в мерную колбу вместимостью 100 см³, растворяют в 5 %-ной трихлоруксусной кислоте и доводят объем до метки. Рабочие растворы гистамина с концентрациями 20, 10, 5 мкг / см получают путем разбавления 5 %-ным раствором трихлоруксусной кислоты основного раствора в 2, 4 и 8 раз соответственно. Основной раствор гистамина хранят в холодильнике неделю, рабочие растворы готовят в день проведения анализа.

5 см³ каждого стандартного раствора помещают в пробирки с притертыми пробками, добавляют 1 см³ 20 %-ного раствора гидроксида натрия и вносят в раствор при перемешивании безводный углекислый натрий до получения насыщенного раствора. Добавляют 5 см³ н-бутанола, насыщенного водой, и энергично встряхивают пробирки в течение 30 с. После разделения фаз отбирают пипеткой или шприцем 3 см³ верх него бутанольного слоя и переносят в другую пробирку с притертой пробкой, содержащую 3 см³ 0,1 н раствора соляной кислоты. Встряхивают содержимое пробирки в течение 30 с. После разделения фаз отбирают 2 см³ нижнего водного слоя, переносят в другую пробирку, добавляют 2 см³ 4 %-ного раствора углекислого натрия и выдерживают 5 мин при 0 °С. Приливают к охлажденному раствору 2 см³ холодного свежеприготовленного диазореактива, встряхивают и вновь выдерживают 5 мин при 0 °С. Добавляют 4 см³ этилацетата и энергично встряхивают в течение 30 с. После разделения фаз сухой пипеткой отбирают верхний слой и переносят в пробирку, содержащую безводный сульфат натрия (раствор окрашенного производного в этилацетате должен быть прозрачным). Измеряют величину абсорбции раствора при 495 нм в кювете толщиной 1 см. В качестве раствора сравнения используют этилацетат. На основании полученных данных строится калибровочная кривая зависимости величины абсорбции от концентрации гистамина в растворе.

4. Проведение испытаний

5 см³ фильтрата 1, полученного по п. 3.5, помещают в пробирку и проводят процедуру, описанную в п. 3.6, начиная с добавления раствора гидроокиси натрия.

Если образцы содержат гистамина более 200 мг/кг, необходимо разбавить полученный фильтрат 5 %-ным раствором трихлоруксусной кислоты.

Для определения концентрации гистамина в экстракте используется калибровочная кривая.

5. Обработка результатов

Содержание гистамина в образце продукта Г (мг/кг), вычисляют по формуле:

где с - концентрация гистамина, найденная по калибровочной кривой, мкг/см³;

У - объем экстракта, см³ (50 см³);

м - навеска образца продукта, г (10 г);

Ф - фактор разбавления

Вычисление проводят до единиц. За окончательный результат принимают среднее арифметическое значение результатов трех параллельных определений. Допустимое расхождение между результатами параллельных определений не должно превышать 50 % по отношению к среднему арифметическому значению.

Определение гистамина проводится в отдельных видах рыб и рыбных продуктах в пунктах выработки продукции.

Периодичность контроля лабораториями санэпидстанций устанавливается не реже 1 раза в квартал. Содержание гистамина в экспортных и импортных консервах определяется в каждой партии отраслевыми лабораториями. В случае нарушения температурного режима хранения консервов проводится внеочередной контроль.

СОДЕРЖАНИЕ