МУК 4.2.3144-13

Государственное санитарно-эпидемиологическое нормирование
Российской Федерации

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Метод определения бактерий
Enterobacter sakazakii в продуктах
для питания детей раннего возраста

Дополнения и изменения к МУК 4.2.2428-08

Методические указания
МУК 4.2.3144-13

Москва 2014

1. Разработаны Федеральным государственным бюджетным учреждением «Научно-исследовательский институт питания» Российской Академии медицинских наук (В.А. Тутельян, С.А. Шевелева, И.Я. Конь, Н.Р. Ефимочкина, И.Б. Быкова, С.Ю. Батищева).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере зашиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 29 октября 2013 г. № 3).

3. Утверждены врио Руководителя Федеральной службы по надзору в сфере зашиты прав потребителей и благополучия человека, Главного государственного санитарного врача Российской Федерации А.Ю. Поповой 26 ноября 2013 г.

4. Введены впервые.

УТВЕРЖДАЮ

Врио Руководителя Федеральной службы
по надзору в сфере защиты прав
потребителей и благополучия человека,
Главного государственного санитарного
врача Российской Федерации

А.Ю. Попова

26 ноября 2013 г.

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Метод определения бактерий Enterobacter sakazakii
в продуктах для питания детей раннего возраста

Дополнения и изменения к МУК 4.2.2428-08

Методические указания
МУК 4.2.3144-13

1. По тексту документа изменить название Enterobacter sakazakii и записать в следующей редакции «Cronobacter spp. (Enterobacter sakazakii)» или «Cronobacter spp.».

2. Раздел 1 «Общие положения и область применения» дополнить п. 1.7 и изложить его в следующей редакции: «1.7. Методические указания носят рекомендательный характер».

3. Раздел 2 «Сущность метода» изложить в следующей редакции:

«2. Сущность метода

2.1. Метод определения бактерий Enterobacter sakazakii (Cronobacter spp.) основан на высеве определенных количеств продукта в жидкие неселективные среды для предварительного обогащения проб, пересеве в жидкие селективные среды для выделения бактерий семейства Enterobacteriaceae, с последующим пересевом на поверхность твердых селективных сред, инкубировании посевов, выявлении в этих посевах бактерий, способных расти и образовывать типичные колонии на поверхности селективного агара, с последующим выделением чистой культуры.

Ниже представлена методическая схема определения Cronobacter spp.

Таблица 1

Схема исследования сухих детских смесей на наличие Cronobacter spp.

Этап	Продолжительность инкубации, ч	Температура
1. Подготовка реактивов и материалов
2. Растворение навесок продукта в забуференной пептонной воде (ЗПВ) в соотношении 1:9 (при необходимости определения количества - навесок массой 100, 10 и 1 г в 3 колбы или пробирки с ЗПВ каждая), смешивание и инкубация	18 ± 2	37 °С
3. Посев 0,1 см³ проинкубированной суспензии в селективный питательный бульон для выделения бактерий семейства Enterobacteriaceae и инкубация	24 ± 2	44 °С
4. Пересев 0,1 мл проинкубированного бульона для выделения Enterobacteriaceae на поверхность хромогенного агара для выявления Cronobacter spp. (ESIA™) или фиолетово-красного желчного агара с глюкозой (VRBG-agar)	24 ± 2	44 °С
5. Отбор 5 подозрительных на Cronobacter spp. колоний с поверхности хромогенного ESIA-aгapa, отбор всех типов колоний с поверхности фиолетово-красного желчного агара с глюкозой (VRBG-agar); пересев на триптон-соевый агар с дрожжевым экстрактом (TSYEA) и инкубация	48 ± 2	25 °С
6. Отбор колоний с желтым пигментом, микроскопия по Граму и подтверждение их видовой принадлежности по биохимическим тестам идентификации
7. Интерпретация результатов.
При необходимости - подсчет наиболее вероятного числа (НВЧ) по количеству положительных проб в каждой из засеянных навесок продукта

2.2. Идентификация чистых культур проводится по совокупности морфологических, биохимических и других признаков, определяющих принадлежность к Е. sakazakii (Cronobacter spp.). Подтверждение принадлежности к Cronobacter spp. производится путем получения развернутых биохимических характеристик штаммов. Допускается использование тест-систем для биохимической дифференциации энтеробактерий API 20Е, Rapid 20E, ID 32Е (ф. «БиоМерье», Франция) и др.

Определение биохимических характеристик, подтверждающих принадлежность выделенных штаммов к роду Cronobacter spp. и дифференцирующих их от близкородственных представителей энтеробактерий Enterobacter cloacae и Pantoea agglomerans, приведены в табл. 2.

Таблица 2

Биохимическая дифференциация Cronobacter spp.

Тест или субстрат	Реакции
Тест или субстрат	E. sakazakii (Cronobacter spp.)	E. cloacae	Р. agglomerans
Желтый пигмент при 25 °С	+	-	(+)
D-сорбит	-	+	(+)
α-глюкозидаза	+	(-)	-
Разжижение желатины (22 °С)	-	-	+
Оксидаза	-	-	-
Лизиндекарбоксилаза	-	-	-
Аргининдигидролаза	+	+	-
Орнитиндекарбоксилаза	+	+	(-)
Утилизация цитратов	+	+	+
Реакция Фогес-Проскауэра	+	+	(+)
Индол	-	-	(-)
Глюкоза	+	+	+
Маннит	+	+	+
Лактоза	+	+	(+)
Сахароза	+	+	(+)
L-рамноза	+	+	(+)
D-мелибиоза		+	+
Амигдалин	+	-	(-)
Подвижность	+	+	(+)
Мукоидный рост	+	+	+
Примечания: «+» - 90 - 100 % штаммов положительные; «(+)» - 21 - 89 % штаммов положительные; «-» - 0 - 9 % штаммов положительные; «(-)» - 10 - 24 % штаммов положительные

Ведущими дифференцирующими признаками Cronobacter spp. являются:

• способность к образованию желтого пигмента при культивировании на неселективных средах при температуре 25 °С;

• наличие α-глюкозидазной активности на хромогенных средах, содержащих 5-бромо-4-хлоро-3-индолил-α-D-глюкопиранозид;

• отсутствие способности к ферментации D-сорбита.

Для дифференциации Cronobacter spp. от сорбитвариабельных и обладающих желтым пигментом представителей рода Pantoea agglomerans (Syn: Envinia spp.) используется тест разжижения желатины.».

4. В разделе 3.3 «Реактивы и питательные среды» перечень питательных сред дополнить следующими наименованиями:

• модифицированный лаурилсульфат триптозный бульон с ванкомицином (мЛСТ с ванкомицином);

• Enterobacter sakazakii хромогенный агар (ESIA™) или селективные хромогенные среды аналогичного назначения, соответствующие требованиями стандарта ISO/TS 22964:2006 IDF/RM 210:2006.

5. Раздел 4.2 «Приготовление питательных сред» дополнить пп. 4.2.6, 4.2.7 и 4.2.8 в следующей редакции:

«4.2.6. Забуференная пептонная вода

Состав среды	Концентрация, г/дм³
Хлорид натрия (NaCl)	5,0
Ферментативный гидролизат казеина	10,0
Двузамещенный фосфат натрия 12-водный (Na₂HPO₄ × 12Н₂O)	9,0
Однозамещенный фосфат калия (KН₂РO₄)	1,5

Компоненты растворяют в 1000 см³ дистиллированной воды, тщательно перемешивают, устанавливают pH 7,0 ± 0,2 при 25 °С, и автоклавируют при 121 °С в течение 15 мин.

4.2.7. Модифицированный лаурилсульфат триптозный бульон (мЛСТ) с ванкомицином

Состав среды	Концентрация, г/дм³
Хлорид натрия (NaCl)	34,0
Пептон ферментативный	20,0
Лактоза	5,0
Однозамещенный фосфат калия (KH₂РO₄)	2,75
Двузамещенный фосфат калия (K₂НРO₄)	2,75
Лаурилсульфат натрия (C₁₂H₂₅NaO₅S)	0,1

Компоненты растворяют в 1000 см³ дистиллированной воды, тщательно перемешивают, устанавливают pH 6,8 ± 0,2 при 25 °С, разливают по 10 мл в пробирки и автоклавируют при 121 °С в течение 15 мин.

Приготовление рабочего раствора ванкомицина: 10 мг ванкомицина растворяют в 10 см³ дистиллированной воды, тщательно перемешивают и стерилизуют методом мембранной фильтрации. Готовый раствор ванкомицина может храниться при температуре от 0 до 5 °С в течение 15 суток.

Для получения готовой среды раствор ванкомицина вносят в каждую пробирку со стерильной основой мЛСТ в количестве 0,1 см³ для получения конечной концентрации ванкомицина в готовой среде 10 мкг/см³. Готовая среда может храниться при температуре от 0 до 5 °С в течение 1 суток.

4.2.8. Enterobacter sakazakii хромогенный агар (ESIA™)

Состав среды	Концентрация, г/дм³
Панкреатический гидролизат казеина (триптон)	7,0
Дрожжевой экстракт	3,0
Хлорид натрия (NaCl)	5,0
Деоксихолат натрия	0,6
5-бромо-4-хлоро-3-индолил-α-D-глюкопиранозид (C₁₄H₁₅BrClNO₆)	0,15
Кристаллический фиолетовый	2 мг
Агар-агар	12,0 - 18,0^*
_____________ ^* В зависимости от способности агара к гелеобразованию

Компоненты растворяют в 1000 см³ дистиллированной воды, тщательно перемешивают, устанавливают pH 7,0 ± 0,2 при 25 °С, и автоклавируют при 121 °С в течение 15 мин. Стерилизованную агаровую среду охлаждают до температуры 44 - 47 °С и разливают по 15 см³ в стерильные чашки Петри.

Готовая среда может храниться при температуре от 0 до 5 °С в течение 1 суток.».

5. Раздел 6. «Проведение анализа» изложить в следующей редакции:

«6. Проведение анализа

6.1. Пробы продуктов массой 100 г, 125 г или 137,5 г вносят в забуференную пептонную воду (ЗПВ) по п. 4.2.6 в соотношении 1:9 по объему. Посевы термостатируют при температуре (37 ± 1) °С в течение (18 ± 2) ч.

6.2. При количественном анализе общая масса (объем) навески должна быть не менее 400 г (см³).

Из подготовленной по п. 5 пробы отбирают 4 навески (порции) продукта массой 100 г (см³) каждая для анализа. Производят посев каждой из трех навесок (порций) в 900 см³ ЗПВ и перемешивают.

Из четвертой навески (порции) массой (объемом) 100 г (см³) отбирают три навески (порции) продукта массой 10 г (см³) и производят посев в 90 см³ ЗПВ и перемешивают. Из этой же пробы отбирают три навески (порции) продукта массой 1 г (см³) и производят посев в 9 см³ ЗПВ. Для посева (при необходимости - предполагаемом высоком содержании Cronobacter spp. в продукте) меньших количеств продукта - 0,1 и 0,01 г, делают десятикратно убывающие разведения навески массой 10 г, и вносят по 1 см³ (х 3) соответствующих разведений в 9 см³ ЗПВ.

Посевы термостатируют при температуре (37 ± 1) °С в течение (22 ± 2) ч.

6.3. После термостатирования проб продукта в среде для первичного накопления 0,1 см³ суспензии пересевают в 10 см³ модифицированного лаурилсульфат триптозного бульона с ванкомицином (арбитражная среда) или в 10 см³ одной из жидких селективных сред для выделения бактерий семейства Enterobacteriaceae по ГОСТ 29184-91 - среду Кесслер с глюкозой, или буферный глюкозный бульон с бриллиантовым зеленым и желчью, или бульон Мак-Конки. Посевы термостатируют при температуре 44 °С в течение (24 ± 2) ч.

6.4. Из посевов после термостатирования, независимо от наличия или отсутствия признаков роста, делают пересев штрихом на поверхность хромогенного агара по п. 4.2.8 для выявления Cronobacter spp., содержащего 5-бромо-4-хлоро-3-индолил-α-D-глюкопиранозид (арбитражная среда), или на поверхность фиолетово-красного желчного агара с глюкозой (VRBG-aгap). Чашки с агаризованной средой предварительно подсушивают. Посевы термостатируют при температуре 44 °С в течение (24 ± 2) ч.

6.5. При отсутствии роста на поверхности хромогенного агара для выявления Cronobacter spp. или VRBG-aгapa анализ прекращают и дают заключение об отсутствии Cronobacter spp. в исследованной пробе.

6.6. После этапа селективного обогащения проб для обнаружения Cronobacter spp. (п. 6.3), допускается использовать ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в соответствии с процедурой, изложенной в МУК 4.2.2872-11. При получении отрицательных результатов исследований образцов предварительно обогащенных жидких селективных сред с применением ПЦР анализ прекращают и дают заключение об отсутствии Cronobacter spp. в исследованной пробе.

6.7. При обнаружении на чашках хромогенного агара для выявления Cronobacter spp. роста подозрительных культур для дальнейшего изучения отбирают 3-5 характерных колоний. При обнаружении на поверхности VRBG-aгapa роста дальнейшему изучению подвергают все обнаруженные варианты культур, для чего отбирают по 3 - 5 колоний каждого типа.

6.8. Отобранные для исследования 3 - 5 характерных колоний пересевают на поверхность триптон-соевого агара с дрожжевым экстрактом и термостатируют при температуре 25 °С в течение (48 ± 2) ч. В качестве положительного контроля используют референс-штамм Е. sakazakii (Cronobacter spp.), типичный по фенотипическим свойствам.

6.9. Культуры, растущие на триптон-соевом агаре с образованием желтого или желто-коричневого пигмента, подвергают дальнейшему изучению для подтверждения принадлежности к Cronobacter spp.».

6. Раздел 10. «Нормативные ссылки» изложить в следующей редакции:

10.1. ГОСТ Р 54005-2010 «Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий семейства Enterobacteriaceae».

10.2. ГОСТ ISO 7218-2011 «Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Общие требования и рекомендации по микробиологическим исследованиям».

10.3. ГОСТ Р 54004-2010 «Продукты пищевые. Методы отбора проб для микробиологических испытаний».

10.4. ГОСТ 26669-85 «Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализов».

10.5. ГОСТ 26670-91 «Продукты пищевые. Методы культивирования микроорганизмов».

10.6. ГОСТ 10444.1-84 «Консервы. Приготовление растворов, красок, индикаторов, питательных сред, применяемых в микробиологическом анализе».

10.7. ГОСТ 26809-86 «Молоко и молочные продукты. Правила приемки, методы отбора и подготовка проб к анализу».

10.8. ГОСТ Р ИСО 707-2010 «Молоко и молочные продукты. Руководство по отбору проб».

10.9. СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней».

10.10. МУК 4.2.577-96 «Методы микробиологического контроля продуктов детского, лечебного питания и их компонентов».

10.11. Стандарт ISO/TS 22964:2006 IDF/RM 210:2006 «Milk and milk products - Detection of Enterobacter sakazakii».

10.12. МУК 4.2.2872-11 «Методы выявления и идентификации патогенных бактерий - возбудителей инфекционных заболеваний с пищевым путем передачи в продуктах питания на основе ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией».

10.13. Технический Регламент Таможенного союза ТР ТС 021/2011 «О безопасности пищевой продукции».