«УТВЕРЖДАЮ»
		Руководитель Департамента ветеринарии
		Минсельхоза России
		___________________ Е.А. Непоклонов
		«11» 05 2004 г.
		№ 13-5-02/1043
МИНИСТЕРСТВО
СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА
РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
(Минсельхоз России)
ДЕПАРТАМЕНТ ВЕТЕРИНАРИИ
107139, Москва, Орликов пер., 1/11
Для телеграмм: Москва, 84
Минроссельхоз
Факс: (095) 975 58 50, тел: (095) 207 80 00
E-mail: chief@devet.mcx.ru
http://www.mcx.ru
11.05.2004 г. № 13-5-02/1043
на № ____________________

Методические рекомендации

«Выделение и идентификация бактерий

желудочно-кишечного тракта животных»

ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ

Методические рекомендации «Выделение и идентификация бактерий желудочно-кишечного тракта животных» разработаны для научно-исследовательских и учебных ветеринарных учреждений, ветеринарных лабораторий и других организаций и предназначены для выделения, количественного учета, идентификации и изучения биологических свойств условно-патогенных, патогенных и полезных бактерий желудочно-кишечного тракта животных, а также определения потенциальной этиологической значимости выделенных микроорганизмов при желудочно-кишечных болезнях животных.

В методических рекомендациях изложены количественные и качественные методы исследований микрофлоры кишечника животных, позволяющие рационализировать и упростить бактериологический анализ с целью прижизненной постановки диагноза на желудочно-кишечные болезни и дисбактериоз, экономить материальные средства и сократить затраты труда, что позволит проводить обследование большого поголовья животных в короткие сроки и охарактеризовать этиологическую структуру острых кишечных болезней в хозяйстве, а также дать оценку степени защищенности животных полезной микрофлорой и определять лечебно-профилактическую эффективность различных препаратов.

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

В последние годы с несомненностью установлена полиэтиологичность острых кишечных заболеваний человека и животных с существенным удельным весом возбудителей, относящихся к условно-патогенным бактериям. Между тем причины желудочно-кишечных болезней животных часто остаются нерасшифрованными, что затрудняет анализ, учет заболеваемости и проведение лечебно-профилактических мероприятий. В результате, невозможно целенаправленно конструировать специфические биологические препараты и объективно оценивать их эффективность.

Выделение, количественный учет и точная идентификация условно-патогенных, патогенных и полезных бактерий желудочно-кишечного тракта животных вызывают определенные затруднения. Существующие на сегодняшний день методики определения микробного состава содержимого кишечника предусматривают, как правило, проведение качественного анализа с использованием, для биохимической идентификации бактерий, набора жидких дифференциально-диагностических сред. Это не позволяет полноценно характеризовать микробный биоценоз и не всегда обеспечивает стандартность получаемых результатов. Описанный ранее метод количественного анализа микрофлоры кишечника (Р.В. Эпштейн-Литвак, Ф.К. Вильшанская, 1969, модифицированный К.Я. Соколовой, 1972) дает исчерпывающий ответ. Однако трудоемкость этого метода ограничивает его практическое применение, особенно в условиях крупных животноводческих хозяйств. Метод можно использовать при углубленных исследованиях или при динамическом наблюдении за приживляемостью в кишечнике лакто- и бифидобактерий, при лечебно-профилактическом применении соответствующих препаратов.

Представленные в данных методических рекомендациях методы исследований фекалий животных, а также выделения и идентификации бактерий, позволяют рационализировать и упростить бактериологический анализ, с целью прижизненной постановки диагноза на желудочно-кишечные болезни и дисбактериоз.

Нами предложен сокращенный метод количественной оценки состава микрофлоры желудочно-кишечного тракта животных для проведения широкого обследования поголовья и характеристики этиологической структуры острых кишечных болезней в хозяйстве, а также для оценки степени защищенности животных полезной микрофлорой по количеству лакто- и бифидобактерий. За счет обоснованного выбора критериев оценки микробного состава, число разведений материала для количественного бактериологического анализа сокращено вдвое, что уменьшает затраты труда, количество лабораторной посуды и питательных сред.

На этапе идентификации выделяемых бактерий мы рекомендуем использовать коммерческие тест-системы ПБДЭ (пластины биохимические дифференцирующие энтеробактерии) или СИБ (системы индикаторные бумажные). Использование стабильных тест-систем обеспечивает унификацию исследований, экономию материальных средств и сокращение затрат времени. Тест-системы удобны для транспортировки, хранения, особенно незаменимы при работе в экспедиционных условиях.

Для определения потенциальной этиологической значимости при желудочно-кишечных болезнях выделенных бактерий, наряду с установлением их видовой принадлежности, количественной характеристикой и серотипированием, мы рекомендуем использовать выявление одного из существенных признаков патогенности некоторых микроорганизмов - адгезивной активности.

1. БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

1.1. Микрофлора кишечника здоровых животных

С организмом животного ассоциированы, как правило, десятки и сотни видов различных микроорганизмов. Многие микроорганизмы обнаруживаются в разных областях тела, изменяясь лишь количественно, в зависимости от вида млекопитающих. Однако большинству животных свойственны общие усредненные показатели микрофлоры.

В таблице 1 представлены группы микроорганизмов, выявляемые в содержимом кишечника нижних отделов желудочно-кишечного тракта животных.

Таблица 1

Микрофлора нижних отделов желудочно-кишечного тракта животных

В настоящее время установлено, что на долю анаэробных и факультативно-анаэробных видов микроорганизмов в кишечнике приходится 95 - 99 %, а все аэробные бактерии составляют 1 - 5 %.

При анализе количественного и качественного состава микрофлоры фекалий животных разных видов необходимо учитывать, что вся микрофлора желудочно-кишечного тракта условно подразделяется на нормальную (полезную), условно-патогенную и патогенную (табл. 2).

Таблица 2

Количество микроорганизмов в 1 г фекалий здоровых телят

Нормальные бактерии, представленные, в основном, непатогенной Е. соli, Lactobacillus, Bifidobacillus и споровыми анаэробами, у здоровых животных должны содержаться в концентрациях 10⁶ - 10⁷ и выше м. кл. в 1 г фекалий. При размножении, данные бактерии вырабатывают биологически активные вещества защищающие организм животных от других микроорганизмов и их токсинов, а также занимают экологическую нишу патогенных бактерий. При уменьшении концентрации полезных бактерий в желудочно-кишечном содержимом животных развивается дисбактериоз, на фоне которого может возникнуть то или иное заболевание.

Условно-патогенные бактерии, такие как Е. соli со слабо выраженными ферментативными свойствами, Enterococcus, Proteus, Klebsiella и др., могут постоянно находиться в желудочно-кишечном тракте животных и не вызывать нарушений пищеварения. Однако на фоне дисбактериоза, дефицита полезной микрофлоры, низкой резистентности организма и других причин, условно-патогенные бактерии приобретают вирулентные свойства и вызывают желудочно-кишечные болезни, проявляющиеся диареей, интоксикацией, обезвоживанием организма и др.

Как следует из таблицы 2, допустимая концентрация условно-патогенных бактерий в 1 г фекалий телят не должна превышать 10² - 10³ м. кл, а патогенные микроорганизмы не должны обнаруживаться в кишечнике животных.

Патогенные бактерии, как правило, обладают вирулентными свойствами и при попадании в организм животных могут вызвать заболевание. При выделении из фекалий животных таких бактерий как Е. соli энтеропатогенная (вызывающая гемолиз эритроцитов, обладающая адгезивными свойствами и др.), Salmonella, Yersinia и др. эти микроорганизмы можно рассматривать как этиологический фактор возникновения и развития болезни у животного.

У разных видов животных и птиц соотношение полезной, условно-патогенной и патогенной микрофлоры в желудочно-кишечном тракте может быть различным. Даже у одного и того же вида животных в норме микробный пейзаж может отличаться, в зависимости от содержания и кормления, качества кормов, индивидуальных особенностей организма и др.

1.2. Необходимые материалы, реактивы, питательные среды

При проведении бактериологических исследований фекалий животных для прижизненной постановке диагноза при желудочно-кишечных болезнях необходимые

- бактериологические пробирки или пенициллиновые флаконы, стерильные с резиновой пробкой и лопаточками дли забора материала. Вес пробирки (флакона) указан на этикетке из лейкопластыря;

- чашки Петри, ГОСТ-25336-82;

- пипетки градуированные, ГОСТ-20292-74 на 1 мл, 10 мл;

- бактериологическая петля из проволоки никелевого сплава, диаметром 0,5 - 0,5 м;

- груша резиновая малая;

- предметные стекла;

- пробирки агглютинационные, ГОСТ-25336-82;

- спирт этиловый для горения спиртовок, обжига шпателя;

- раствор хлорида натрия изотонический, pH = 7,2 - 7,4 (ИХН);

- агары: Эндо, Плоскирева, 5 %-ный кровяной, висмут-сульфит агар, солевой агар; СТБС (специальная среда для выделения иерсиний);

- среда обогащения (селенитовый бульон или хлормагниевая среда, или среда Мюллера);

- среда Блаурокка жидкая;

- среда МРС-2 полужидкая;

- мясопептонный 2 %-ный агар в пробирках по 5 мл;

- стерильное вазелиновое масло;

- растворы консервантов (см. приложение № 1);

- комбинированные среды типа Олькеницкого, Ресселя, Клиглера;

- наборы стабильных тест-систем для идентификации микроорганизмов по биохимическим свойствам (ПБДЭ или СИБ);

- наборы диагностических сывороток для серологической диагностики эшерихий, сальмонелл и других энтеробактерий.

Рецептура питательных сред, консервантов, характеристика ПБДЭ и СИБ дана в приложении.

1.3. Забор материала и подготовка к работе

При заборе материала необходимо исключить возможность загрязнения его микроорганизмами из окружающей среды. Для бактериологического исследования целесообразно брать пробы до начала фаго- и антибиотикотерапии.

Исследуемый материал (фекалий около 1 г) забирают в стерильные, предварительно взвешенные бактериологические пробирки или пенициллиновые флаконы. В сопроводительном документе необходимо указать вид и номер животного, его возраст, клиническое состояние, когда и какие виды бактериофагов, антибиотиков или других антибактериальных препаратов применяли, дату и время взятия пробы, первичность или повторность анализа. Исследуемый материал суспендируют в изотоническом растворе хлорида натрия (ИХН) pH - 7,2 - 7,4 в отношении 1:10 (из расчета 1 г материала и 9 мл ИХН) и высевают на питательные среды не позднее двух часов с момента взятия пробы.

При использовании консервантов материал пригоден для исследования в течение 12 - 24 ч. В качестве консервантов используют глицериновую смесь (pH - 7,8), буферный глицериново-солевой раствор, фосфатно-буферный раствор (pH - 8,0), ИХН (pH - 7,2 - 7,4) (см. приложение № 1).

Вес взятого для анализа материала определяют по разнице весов флакона с материалом (или флакона с материалом и консервантом) и веса пустого флакона (или флакона с консервантом).

Для приготовления материала в разведении 1:10 требуемое количество ИХН определяют по пересчетной таблице № 3. При использовании консерванта от установленного по таблице № 3 объема ИХН следует вычесть объем консерванта. Хранят материал при температуре 4 ± 1 °С.

1.4. Схема бактериологического исследования

I день исследований - Исследуемый материал (содержимое кишечника, фекалии) разводят физиологическим раствором 1:10, согласно пересчетной таблице № 3.

Готовят разведения исследуемого материала от 10^-1 до 10^-8. Из каждого разведения делают посевы на пластинчатые питательные среды Эндо, висмут-сульфит агар, желточно-солевой агар, агар Плоскирева, кровяной агар), на среду МРС-2 и Блаурокка и инкубируют при температуре 37 °С 18 - 24 часа. Из разведения 1:10 делают также посев на среду обогащения (селенитовая среда) для выделения сальмонелл и инкубируют при температуре 37 °С 16 - 18 часов.

Таблица 3

II день исследований - С пластинчатых питательных сред отбирают изолированные колонии и делают посевы на среды для первичной идентификации микроорганизмов (среда Олькеницкого или среда Клиглера). Проводят количественный учет колоний. Делают посевы со среды обогащения на пластинчатые питательные среды (агар Плоскирева и висмут-сульфит агар), с дальнейшей родовой и видовой идентификацией. Все посевы инкубируют при температуре 37 ºС 18 - 20 часов.

III день исследований - Проводят учет результатов первичной идентификации бактерий. Делают посевы на среды минимального дифференцирующего ряда для определения рода. Проводят серологическую идентификацию с агглютинирующими и адгезивными сыворотками к сальмонеллам и энтеропатогенным E. coli (ЕРЕС). Используют диагностические бактериофаги.

IV день исследований - Делают заключение о родовой и видовой принадлежности микроорганизмов. Проводят постановку дополнительных тестов для идентификации некоторых видов энтеробактерий. Готовят мазки со сред Блаурокка и МРС-2 и просматривают их под микроскопом. Проводят серологическую идентификацию выделенных микроорганизмов в реакции агглютинации на стекле с использованием диагностических сывороток.

V день исследований - Окончательное определение видов, биоваров, количественная характеристика выделенных микроорганизмов.

1.5. Посев материала и выделение чистой культуры

При посеве материала для выделения чистой культуры используют пластинчатые селективно-дифференциальные среды, для выделения сальмонелл - среды обогащения.

Для количественной характеристики аэробной микрофлоры проводят дозированный посев на пластинчатые среды из четырех диагностически значимых разведений исходного материала (10^-4, 10^-5, 10^-6, 10^-8). Разведения готовят в пяти бактериологических пробирках. В две пробирки наливают по 9,9 мл изотонического раствора хлорида натрия (для разведений 10^-3, 10^-8), в три пробирки - 4,5 мл (для разведений 10^-4, 10^-5) и последовательно переносят взвесь из предыдущего разведения в последующее в объемах, указанных на рис. 1.

Всю работу проводят с соблюдением стерильности, со сменой пипеток при переходе от предыдущего разведения к последующему. Каждую взвесь хорошо перемешивают.

Перед работой пластинчатые среды подсушивают в сушильном шкафу при температуре 60 ± 1 °С в течение 20 мин, при 40 = 1 °С в течение 45 мин. На поверхности агара не должно оставаться конденсационной влаги.

Целесообразно использовать следующий набор сред, обеспечивающих выделение патогенных и условно-патогенных энтеробактерий:

- селективная среда Плоскирева, для выделения сальмонелл (посев проводят петлей из разведения 10^-1 и 10^-4);

- дифференциально-диагностическая среда Эндо, для выделения клебсиелл, протеев, энтеробактеров, гафний (посев проводят пипеткой в объеме 0,05 мл из разведения 10^-8);

- дифференциально-диагностическую среду Эндо для выделения энтеробактерий (посев проводят пипеткой, мерно, из разведений 10^-5 и 10^-6 в объеме 0,05 мл с последующим растиранием шпателем);

- 5 %-ный кровяной агар для выделения гемолитических форм микроорганизмов (проводят посев суспензий чистых культур микроорганизмов и посев из разведений 10^-5; 10^-6, пипеткой в объеме 0,05 мл с последующим растиранием шпателем).

Для выделения сальмонелл используют жидкие среды обогащения: хлор-магниевую, Мюллера, селенитовый бульон. Посев проводят пипеткой в объеме 1 мл из исходного (10^-1) разведения в 5 мл среды обогащения с последующим высевом петлей через 16 - 18 ч на дифференциально-диагностические среды.

Для выявления лакто- и бифидобактерий используют жидкие среды:

- Блаурокка - для обнаружения бифидобактерий (посев делают из разведения 10^-8 в объеме 1 мл);

- МРС-2 - для выявления лактобактерий (посев проводят из разведения 10^-8 в объеме 0,05 мл). Следует обратить внимание на необходимость создания анаэробных условий культивирования бактерий на среде Блаурокка и МРС-2, так как бифидо- и лактобактерии являются факультативными анаэробами. При посеве пипетку с микробной взвесью опускают на дно пробирки и осторожно выливают содержимое, стараясь не допускать появления пузырьков воздуха в пробирке.

Все посевы инкубируют в термостате при 37 ± 1 °С:

- среды Плоскирева, Эндо, селенитовый бульон, магниевую среду - 18 - 24 ч;

- 5 %-ный кровяной агар - 48 ч;

- среды МРС-2 и Блаурокка - 3 - 4 суток;

- висмут-сульфит агар - 48 ч.

При пересеве клеток микроорганизмов с одной среды на другую все манипуляции всегда проводят вблизи пламени горелки (но не в пламени!), по возможности быстро, чтобы не загрязнять культуру посторонними микроорганизмами. При взятии материала, пробирки (колбы) необходимо удерживать в наклонном положении, чтобы гарантировать стерильность культуры. Если держать их вертикально, то возможно попадание в культуру посторонней микрофлоры.

Если микроорганизмы высевают на плотную скошенную питательную среду, то бактериологической петлёй или иглой с культурой, по поверхности среды проводят прямую или волнообразную черту (лёгким движением, не разрезая среды). Такой способ называется «посев штрихом». Зигзагообразный штрих проводят в тех случаях, когда необходимо получить больше посевного материала (для смывов и т.д.). Если культуру высевают в столбик питательной среды, то иглу или петлю вводят в центральную часть, в толщу среды до дна пробирки. Такой способ называется «посев уколом».

Культуру помещают в термостат, проводят наблюдения за её развитием и описывают характер роста микроорганизмов.

Если посев делают в жидкую среду (или из жидкой среды), лучше пользоваться пипеткой или петлёй. Пробирки держат слегка наклонив, чтобы не замочить их края и пробки. Перед тем как закрыть пробирки, пробки и края пробирок обжигают в пламени.

Рис. 1. Схема сокращенного метода исследований
микрофлоры кишечника животных

2. ИДЕНТИФИКАЦИЯ ВЫДЕЛЕННЫХ КУЛЬТУР

2.1. Выделение чистой культуры и ее первичная идентификация

При посеве материала на плотные питательные среды необходимо получить рост изолированных колоний, в противном случае идентификация бактерий невозможна. Чашки с посевом просматривают невооруженным глазом.

Рис. 2. Характеристика колоний:

В числе характеристик колоний учитывают их размер (диаметр в мм), форму, возвышение над поверхностью (плоская, выпуклая), особенности края (ровный - S-форма, волнистый - R-форма) и поверхности (блестящая, матовая), цвет, плотность (прозрачная, мутная) и консистенцию (вязкая, пленчатая и др.).

Для определения качественного состава бактерий, колонии на чашке группируют по культуральным признакам (характер колонии), которые являются наиболее существенной особенностью роста микроорганизмов на плотной питательной среде.

Различают: 1) поверхностные; 2) глубинные; 3) донные колонии, в зависимости от того, где они развивались - на поверхности плотной питательной среды, в толще ее или на дне сосуда. Обычно изучают и описывают только колонии, выросшие на поверхности среды, так как именно эти колонии отличаются большим разнообразием. Глубинные колонии, напротив, довольно однообразны. Чаще всего они имеют вид более или менее сплющенных чечевичек, принимающих в проекции форму овалов с заостренными концами. Лишь у немногих микроорганизмов глубинные колонии напоминают пучки ваты с нитевидными выростами в питательную среду. Образование глубинных колоний часто сопровождается разрывом агаризованной среды вследствие выделения углекислоты или других газов развивающимися микроорганизмами. Донные колонии самых разнообразных микроорганизмов растут в виде тонких прозрачных пленок, стелющихся по дну.

При описании колонии необходимо указывать возраст культуры, состав среды и температуру культивирования.

Решающее значение при оценке энтеробактерий на пластинчатых средах имеет дифференциация по окраске изолированных колоний, зависящая от отношений бактерий к дифференцирующим компонентам питательной среды, например, лактозе (табл 4).

Таблица 4

Характеристика колоний энтеробактерий различных родов

Необходимо учитывать, что после культивирования бактерий при 37 °С и учета выросших колоний, чашки Петри необходимо выдержать еще сутки при комнатной температуре (для подращивания и выделения Erwinia, Serratia и Yersinia).

Дальнейшую работу проводят с колониями, имеющими ровный край. С чашек, на которые проводили мерно посев (с определенного разведения), подсчитывают выросшие колонии, определяя биологическую концентрацию микроорганизмов в 1 г фекалий (табл 5).

При наличии на чашках Петри нескольких типов колоний для дальнейшей работы отбирают не менее трех из них каждого типа.

С чашек со средой Плоскирева, прежде всего, отбирают колонии, сходные по культуральным свойствам с сальмонеллами (бесцветные, полупрозрачные, плоские); с клебсиеллами и энтеробактерами (розовые, с желтым центром, выпуклые, бежевые или желтые); с протеями (прозрачные или полупрозрачные, слегка выпуклые, с желтовато-розовым перламутровым оттенком); с цитробактерами и гафниями (выпуклые, полупрозрачные, окрашенные в тон среды, а также розовые или красные).

Р. vulgaris и Р. mirabilis проявляют способность к «роению», в результате высокой степени подвижности этих микроорганизмов. Для получения изолированных колоний рекомендуют использовать среду Эндо с желчью (способ приготовления см. в приложении 4).

Со среды Эндо отбирают, в первую очередь, лактозонегативные (бледно-розовые или розовые) колонии, подозрительные на сальмонеллы, лактозонегативные эшерихии, клебсиеллы, энтеробактеры, цитробактеры, и засевают на среду Клиглера или Олькеницкого. Для выявления ЕРЕС (энтеропатогенные эшерихии) колонии малинового цвета с металлическим блеском или без него или малиновые с розовым ободком отсевают одновременно на среду Клиглера или Олькеницкого и косой агар для дальнейшей серологической диагностики.

На 5 %-ном кровяном агаре по наличию зоны просветления (гемолиза) вокруг колонии выявляют гемолитические формы энтеробактерий. Результаты учитывают через 24 ч, окончательно - через 48 ч.

На висмут-сульфитном агаре отбирают колонии, подозрительные на сальмонеллы (черные, с характерным металлическим блеском и почернением среды вокруг колонии). Исключение составляют Salmonella choleraesuis, V. Kunzendorf, S. typhisuis.

Для количественной характеристики условно-патогенных энтеробактерий (табл. 5) подсчитывают колонии каждого типа на пластинчатых дифференциально-селективных средах (Эндо, 5 %-ный кровяной агар, среда Плоскирева 10^-4).

Таблица 5

Пример определения концентрации микроорганизмов
(метод БК)

На последующих этапах количество выросших колоний умножают на соответствующее разведение (из которого проводили высев на чашку) и на 20, если высевали 0,05 мл, или на 10, если высевали 0,1 мл.

Например, высев из разведения 10^-6 привел к развитию на чашке со средой Эндо трех колоний, однородных по характеристикам и отнесенных к роду Citrobacter. Для определения содержания их в 1 г фекалий 3 умножают на 10⁶ и на 20 (3·10⁶·20 = 6·10⁷). Таким образом, устанавливают, что в 1 г материала содержалось 6 10⁷ бактерий рода Citrobacter.

Для выявления некоторых морфологических особенностей, количественного учета микроорганизмов, проверки чистоты культуры и ряда других целей готовят фиксированные окрашенные препараты, которые могут храниться длительное время.

Приготовление фиксированных окрашенных препаратов включает следующие этапы: приготовление мазка, высушивание, фиксацию, окраску и определение размера клеток бактерий.

Приготовление мазка. На обезжиренное предметное стекло наносят маленькую каплю водопроводной воды и переносят в нее петлей небольшое количество исследуемого материала. Получившуюся суспензию равномерно размазывают петлей или краем покровного стекла на площади 1 - 2 см² как можно более тонким слоем. Мазок должен быть настолько тонок, чтобы высыхал почти тотчас же после приготовления.

Высушивание мазка. Лучше всего сушить препарат при комнатной температуре на воздухе. Хорошо приготовленный тонкий мазок высыхает очень быстро (не более 1 мин). Если высушивание мазка замедленно, то препарат можно слегка нагреть в струе теплого воздуха высоко над пламенем горелки, держа стекло мазком вверх.

Эту операцию следует проводить крайне осторожно, не перегревая мазок, иначе клетки микроорганизмов деформируются.

Фиксация. Фиксация препарата преследует несколько целей: убить микроорганизмы, т.е. сделать безопасным дальнейшее обращение с ними, обеспечить лучшее прилипание клеток к стеклу и сделать мазок более восприимчивым к окраске (мертвые клетки окрашиваются лучше, чем живые).

Самым распространенным способом фиксации является термическая обработка. Для этого препарат трижды проводят через наиболее горячую часть пламени горелки, держа предметное стекло мазком вверх. Не следует перегревать мазок, так как при этом могут произойти грубые изменения клеточных структур, а иногда и внешнего вида клеток, например их сморщивание.

Для исследования тонкого строения клетки прибегают к фиксации различными химическими веществами. Чаще всего пользуются этиловым спиртом (время фиксации 15 - 20 мин), метиловым спиртом (время фиксации 3 - 5 мин), смесью равных объемов этилового спирта и эфира (препарат погружают на 15 - 20 мин в смесь или заливают мазок и дают смеси испариться). По окончании фиксации препарат отмывают от фиксатора водопроводной водой и окрашивают.

Окраска. Для окрашивания клеток микроорганизмов чаще всего пользуются анилиновыми красителями, среди которых различают кислые и основные.

К кислым красителям относятся те, у которых ион, придающий окраску (хромофор), является анионом, у основных красителей хромофором является катион. Примером кислых красителей служат эозин, эритрозин, нигрозин, кислый фуксин - все эти красители интенсивно связываются с цитоплазматическими (основными) компонентами клетками.

Основные красители - основной фуксин, генцианвиолет, метиленовый синий, кристаллический фиолетовый, сафранин - более интенсивно связываются с ядерными (кислыми) компонентами клетки.

При исследовании микроорганизмов чаще применяют основные красители.

Различают простые и дифференциальные способы окрашивания клеток. При простой окраске прокрашивается вся клетка так, что хорошо видны ее форма и размеры. При дифференциальной окраске окрашивается не вся клетка, а определенные её структуры, и поэтому такой тип окраски используется для выявления и изучения конкретных клеточных структур. В этом случае окраску препарата проводят не одним, а несколькими красителями.

Для простого окрашивания клеток микроорганизмов чаще всего пользуются фуксином и генцианвиолетом. Для этого фиксированный препарат помещают на приспособления-перекладины или так называемые препаратодержатели (параллельно расположенные стеклянные палочки длиной 20 - 30 см, соединенные резиновыми трубками). Палочки устанавливают над фарфоровыми или стеклянными чашками или ваннами. Препарат обливают из пипетки раствором выбранного красителя. Следует обращать внимание на то, чтобы конец пипетки не касался мазка. Обычно бывает достаточно покрыть мазок несколькими каплями красителя. Время окрашивания указанными красителями колеблется от 1 до 3 мин. Нужно следить, чтобы во время окрашивания раствор красителя на мазке не подсыхал, в случае необходимости доливают новые порции.

По окончании окраски препарат промывают струёй воды до тех пор, пока стекающая вода станет бесцветной. Затем препарат высушивают на воздухе или осторожно промокают его фильтровальной бумагой и рассматривают с иммерсией. В правильно окрашенном и хорошо промытом препарате поле зрения остается совершенно светлым и чистым, а окрашенными оказываются только клетки микроорганизма.

Для получения более чистых препаратов краску можно наливать на мазок, покрытый фильтровальной бумагой, или воспользоваться модифицированным методом Синева, при котором применяют фильтровальную бумагу, заранее пропитанную красителем. В этом случае, на фиксированный мазок наносят несколько капель дистиллированной воды, накладывают полоску сухой фильтровальной бумаги, пропитанную красителем, и прижимают ее пинцетом к поверхности стекла. По истечении времени окрашивания фильтровальную бумагу снимают, препарат промывают водой, сушат и рассматривают с иммерсией.

Описанный метод относится к так называемым позитивным способам окраски, когда окрашиваются клетки микроорганизмов. Помимо этого существует так называемое негативное контрастирование, когда краситель заполняет пространство, окружающее клетки, и не проникает в сами клетки, в результате чего микроорганизмы выглядят как светлые частицы на равномерно окрашенном фоне. Для негативного окрашивания чаще всего пользуются жидкой тушью, водными растворами конго-рота (3 %), нигрозина (10 %) и некоторыми другими красителями.

Окрашивание негативными красителями можно вести двумя путями: либо раствор красителя наносят на сухой фиксированный мазок, дают ему высохнуть и затем рассматривают с иммерсией, либо каплю исследуемой суспензии бактерий смешивают с красителем непосредственно на предметном стекле, покрывают ее покровным стеклом и изучают с сухой системой. В последнем случае негативное окрашивание можно комбинировать с прижизненной окраской клеток. Для этого каплю исследуемой суспензии микроорганизмов помещают вначале в каплю разбавленного раствора фуксина, а затем смешивают с каплей туши и закрывают покровным стеклом.

Определение размеров клеток проводят под микроскопом с помощью окулярной линейки (микрометра) или окулярного винтового микрометра, используя 24-часовые культуры микроорганизмов. Размеры клеток особенно удобно определять, пользуясь фазово-контрастным устройством. Если клетки подвижны, препарат слегка подогревают или к капле используемой суспензии добавляют каплю 0,1 %-ного водного раствора агар-агара. Фиксировать и окрашивать клетки нежелательно, так как это ведет к некоторому изменению их истинных размеров. Размеры клеток выражают в микронах.

Определение размеров клеток микроорганизмов под микроскопом включает три этапа: определение размеров клеток в делениях окулярной линейки, определение цены деления окулярной линейки в мкм и расчет размеров клеток в мкм.

1. Определение размеров клеток в делениях окулярной линейки существляют с помощью окулярной линейки (окуляр-микрометра), которую помещают на диафрагму окуляра, для чего вывинчивают глазную линзу окуляра, устанавливают окуляр-микрометр и вновь завинчивают линзу (рис. 3).

Рис. 3. Окулярный микромер

На столик микроскопа помещают препарат «раздавленная капля», препарат парафинируют для предохранения от высыхания нанесением расплавленного парафина на края покровного стекла. Фиксированные препараты для определения размеров клеток нежелательны, так как фиксация и окраска может изменить размеры клеток. Если клетки подвижны, препарат слегка подогревают или к капле исследуемой суспензии добавляют 0,1 % водный раствор агар-агара.

После установки препарата на столике микроскопа, проводят фокусировку объекта. Путем передвижения предметного столика в двух плоскостях располагают клетки на шкале окуляр-микрометра и определяют, скольким делениям линейки соответствует длина и ширина клетки при данном увеличении микроскопа. Чтобы результаты были достоверными, измеряют обычно не менее 10 - 20 клеток. У кокков измеряют диаметр, у других форм - длину и ширину.

2. Определение цены деления окулярной линейки в мкм проводят с помощью объективной линейки (объект-микрометра) для данного увеличения микроскопа.

Объективный микрометр представляет собой металлическую пластинку с отверстием в центре, в которое вставлено стекло. На стекло нанесена линейка длиной 1 мм, которая разделена на 100 частей, так что одно деление ее соответствует 0,01 мм или 10 мкм (рис. 4).

Для определения цены деления окулярной линейки на столик микроскопа вместо препарата помещают объективный микрометр и при малом увеличении фокусируют изображение линейки. Затем перемещают линейку объект-микрометра в центр поля зрения и меняют объектив на тот, при котором измеряли размер клеток. Перемещая столик микроскопа и поворачивая окуляр, устанавливают микрометры так, чтобы их шкалы были параллельны и одна перекрывала другую (рис. 5).

Совмещают одно из делений шкалы окулярного и объективного микрометров и находят следующее их совмещение. Устанавливают, какую часть деления объективного микрометра составляет одно деление окулярной линейки и умножают полученное число на 10. Таким образом получают цену деления окулярного микрометра в микрометрах для данного увеличения микроскопа:

а - цена деления окуляр-микрометра, мкм; п - число делений объект-микрометра; с - число делений окуляр-микрометра; 10 мкм - цена одного деления объект-микрометра.

Определение цены деления окуляр-микрометра проводят в трехкратной повторности, каждый раз сбивая совмещения и устанавливая новые. Результаты определений записывают в таблицу (табл. 6).

Таблица 6

Результаты определений цены деления окуляр-микрометра

3. Расчет размеров клеток в мкм. Зная, скольким делениям окулярной линейки соответствует длина и ширина изучаемого объекта, умножают цену деления окуляр-микрометра на эти числа:

N = с·а, где

N - длина или ширина клетки, мкм; с - число делений окуляр-микрометра; а - цена деления окуляр-микрометра.

Размеры клеток микроорганизмов в конечном счете записывают по форме:

(N_min - N_max) - (n_min - n_max) мкм, где

N_min и N_max - минимальное и максимальное значения длины клетки, n_min и n_max - минимальное и максимальное значение ширины клетки, мкм - единица измерения размеров клеток, например: (2 - 3) - (0,1 - 1,0).

Результаты определения размеров клеток микроорганизмов вносят в таблицу (табл. 7).

Таблица 7

Результаты определения размеров клеток

При извлечении части клеток для приготовления препарата микроорганизмов, выращенных на поверхности плотной среды, необходимо строго соблюдать условия, которые позволили бы предохранить культуру от загрязнения другими микроорганизмами. Клетки для препаратов берут бактериологической петлей или иглой и работают в стерильной зоне пламени.

Петля представляет собой тонкую проволоку из платины или нихрома, прикрепленную к металлическому держателю. Конец проволоки загибают в виде кольца (диаметром около 2 мм), которым и захватывают небольшое количество микробной массы. Однако предварительно такую петлю необходимо простерилизовать, т.е. уничтожить имеющиеся на ней микроорганизмы.

Стерилизацию бактериологической петли проводят в пламени горелки, прокаливая докрасна проволоку и обжигая примыкающую к ней часть держателя, вводимую внутрь пробирки (колбы, чашки Петри). Петлю рекомендуется держать в пламени горелки почти вертикально, чтобы вся проволока была равномерно раскалена. Однако прикосновение к культуре клеток слишком горячей петлей приводит к их повреждению. Поэтому петлю следует предварительно остудить, прикоснувшись ею к внутренней поверхности пробирки (крышке чашки Петри) или к питательной среде, свободной от клеток микроорганизмов. При этом горячая петля вызывает плавление среды.

Чистоту выделенных культур проверяют одновременно несколькими способами - визуально, микроскопированием и высевом на ряд питательных сред.

Визуальный контроль проводят, просматривая рост выделенной культуры, на поверхности скошенной агаризованной среды. Если культура чистая, то характер её роста однороден по всему штриху и её оставляют для дальнейшей работы. Если рост культуры по штриху неоднороден, культуру считают загрязненной и отбрасывают.

Микроскопический контроль обязательный этап проверки чистоты выделенной культуры. Для этого готовят препарат фиксированных окрашенных клеток и исследуют его с иммерсионной системой. Чистые культуры многих бактерий, как правило, морфологически однородны. Однако клетки некоторых микроорганизмов очень полиморфны, поэтому определение чистоты таких культур при микроскопировании затруднительно.

Во многих случаях загрязнение культур посторонней микрофлорой выявляется уже с помощью микроскопического контроля и такие культуры «отбрасывают». Наиболее надежным способом проверки чистоты культуры является высев ее на ряд питательных сред.

Рассев на плотные среды проводят для того, чтобы получить изолированные колонии. Обязателен посев на мясо-пептонный агар - среду, благоприятную для развития многих гетеротрофных организмов. Выросшие колонии просматривают и сверяют их признаки с отмеченными при выделении. Однородность колоний и совпадение их признаков с описанными ранее являются свидетельством чистоты выделенной культуры.

2.2. Первичная идентификация микроорганизмов

Принадлежность микрорганизма к классу, порядку, семейству, а иногда даже к роду можно установить на основании морфологических признаков и тех сведений, которые исследователь получает в процессе выделения чистой культуры. Одним из таких признаков является способность клеток к окрашиванию методом Грама.

Окраска клеток микроорганизмов по методу Грама. Сущность окраски микроорганизмов по Граму заключается в том, что при обработке генцианвиолетом и йодом в клетках одних микроорганизмов образуется относительно устойчивый и нерастворимый в спирте комплекс. Клетки других микроорганизмов после обработки генцианвиолетом и йодом легко обесцвечиваются спиртом и приобретают красный цвет при последующей покраске фуксином. Первые микроорганизмы называются грамположительными, вторые - грамотрицательными.

Красить по Граму всегда следует клетки молодых культур (чаще всего суточные). Целесообразно одновременно окрашивать клетки контрольных микроорганизмов, отношение которых к окраске по Граму известно заранее. Мазок для окраски по Граму должен быть тонким, чтобы клетки равномерно распределялись по поверхности предметного стекла и не образовывали скоплений, так как от толщины мазка зависят результаты окрашивания.

Окраску проводят следующим образом:

1. На обезжиренное стекло нанести каплю физраствора, в которой суспендировать культуру.

2. Препарат высушить и зафиксировать над пламенем горелки, проведя над огнем 2 - 3 раза.

3. Наложить на мазок кусочек фильтровальной бумаги, пропитанный генцианвиолетом - 1 - 2 мин.

4. Удалить фильтровальную бумагу с красителем. Водой не смывать.

5. Налить раствор Люголя на 1 - 2 мин до почернения мазка.

6. Удалить раствор Люголя. Водой не смывать.

7. Налить на препарат 96° спирт на 20 секунд. Чтобы исключить излишнее обесцвечивание бактерий, к спирту следует добавить йод (2 мл 10 %-ного спиртового раствора йода на 100 мл этанола).

8. Промыть препарат водой.

9. Наложить на мазок кусочек фильтровальной бумаги, пропитанный водным раствором фуксина - 1 - 2 мин.

10. Удалить фильтровальную бумагу с красителем. Промыть мазок водой.

11. Высушить, микроскопировать с иммерсионным маслом.

При правильном окрашивании грамположительные бактерии имеют сине-фиолетовый цвет, грамотрицательные - красный или розовый цвет.

Энтеробактерии являются грамотрицательными микроорганизмами, кокки - грамположительными.

КОН-тест. Наиболее простой метод определения отношения бактерий к окраске по Грамму. В основе метода с применением гидроокиси калия (КОН) лежит способность клеточной стенки грамположительных бактерий сохранять целостность при воздействии КОН, тогда как клеточная стенка грамотрицательных бактерий разрушается.

Постановка пробы с КОН предусматривает суспендирование суточной агаровой культуры бактерий в капле 3 %-ного раствора КОН на предметном стекле.

При положительной реакции, свойственной грамотрицательным микроорганизмам, через 2 - 5 минут жидкость в капле становится вязкой, нити слизи тянутся за петлей на 0,5 - 2,0 см. Образование слизистой консистенции после обработки грамотрицательных бактерий КОН обусловлено выходом из разрушенных клеток ДНК, являющейся вязким компонентом. Учет этой пробы более нагляден на черном фоне.

Выявление у бактерий капсулы. Для окраски капсул бактерий применяют методы Хисса, Лейфсона, Антони, негативное контрастирование (например метод Гинса-Бурри) и др. Для негативного окрашивания чаще всего пользуются жидкой тушью, водными растворами конго-рота (3 %), нигрозина (10 %) и некоторыми другими красителями.

Наиболее часто применяют методы Антони и Гинса-Бурри.

Окраска бактериальных капсул по методу Гинса-Бурри:

- на обезжиренное стекло наносят каплю водного раствора фуксина, в которую стерильной бактериальной петлей вносят исследуемые бактерии;

- рядом с каплей фуксина помещают каплю туши. Обе капли тщательно смешивают стерильной бактериальной петлей;

- с помощью второго предметного стекла делают мазок (так же как делают мазок крови);

- мазок высушивают на воздухе и микроскопируют с иммерсионной системой.

В результате окрашивания на темно-дымчатом фоне препарата видны розовые клетки микроорганизмов, окруженные бесцветной капсулой.

Окраска бактериальных капсул по методу Антони:

- высушенный на воздухе мазок бактериальной культуры окрашивают в течение 2 мин 1 %-ным раствором кристаллического фиолетового;

- краситель отмывают 20 %-ным водным раствором сульфата меди, удаляют его избыток фильтровальной бумагой и подсушивают.

В результате капсулы выглядят светло-голубыми, а микроорганизмы - темно-фиолетовыми.

Первичная идентификация энтеробактерий. Отобранные для дальнейшего изучения колонии пересевают на одну из сред для первичной идентификации - комбинированные среды Олькеницкого или Клиглера (среды красного цвета), на которых выявляют одновременно несколько признаков: способность образовывать сероводород и отношение к глюкозе и лактозе (а также дополнительно, сахарозе и мочевине - на среде Олькеницкого).

Высевают колонии на комбинированную среду бактериологической иглой вначале по скошенной части штрихом, а затем уколом, в толщу агарового столбика. Посевы инкубируют при 37 ± 1 °С в течение 18 - 20 ч.

По совокупности биохимических свойств, выявленных на комбинированной среде, делают предположительное заключение о возможной родовой принадлежности культуры (рис. 6).

Рис. 6. Первичная идентификация энтеробактерий на среде Олькеницкого

О ферментации лактозы (сахарозы) судят по изменению цвета среды в скошенной части, а о ферментации глюкозы - в столбике, в котором при газообразовании появляются пузырьки воздуха (разрывы среды или ее отслоение от стенок пробирки). Образование сероводорода устанавливают по почернению среды. При росте культуры, гидролизующей мочевину, происходит щелочение, вследствие чего вся среда приобретает малиновый цвет. В случае указанного расщепления мочевины в среде Олькеницкого учет ферментации углеводов невозможен.

В случае если при культивировании микроорганизмов среда Олькеницкого или Клиглера не изменила цвет, данные микроорганизмы не относятся к энтеробактериям. Для уточнения вида микроорганизма, необходимо сделать мазок, окрасить его по Граму или провести КОН-тест и микроскопировать.

Схема 1. Ключевой биохимический тест для первичной идентификации
энтеробактерий

Приведенная схема 1 (ключ) дифференциации энтеробактерий с использованием комбинированных сред (Олькеницкого или Клиглера) поможет бактериологу в выборе наиболее значимых биохимических тестов с учетом результатов, полученных на комбинированной среде. Применение указанного ключа в сочетании с рядом дополнительных признаков, очевидных уже на начальных этапах изучения некоторых культур (особенности колоний, образование пигмента, способность к роению и др.), позволяет сузить перечень предполагаемых родов и более рационально выбрать тесты для дальнейшей дифференциации. Так, когда в число рассматриваемых родов входит Proteus, особое место отводится тесту на фенилаланиндезаминазу. В дифференциации Escherichia и Shigella первоочередными тестами являются ацетатный, нитратный тест Кристенса, а также определение подвижности. При определении представителей родов Hafnia и Yersinia учитывают изменение ряда признаков при различных температурах культивирования (22 - 25 °С и 37 ºС).

2.3. Дифференциация родов и видов

По сочетанию биохимических признаков на комбинированной среде можно заподозрить одновременно несколько родов энтеробактерий. Поэтому для установления родовой и видовой принадлежности бактерий следует использовать минимальный дифференцирующий ряд (табл. 8); для полной видовой идентификации - дополнительные биохимические тесты (табл. 9).

Таблица 8

Биохимическая характеристика энтеробактерий с помощью
минимального дифференцирующего ряда (Берги, 1984)

Примечание: - - отрицательная реакция; + - положительная реакция; х - различные штаммы дают разные реакции; (+ - замедленная реакция; d - различные виды, серотипы дают разную реакцию; Д¹ - β-галактозидаза: S. dysenteriae 1 всегда дает положительный результат; Д² - индол: S. dysenteriae 2 всегда продуцирует индол; Д³ - орнитин: S. boydii 13 всегда положительная (далее во всех таблицах обозначения аналогичны).

Таблица 9

Биохимическая идентификация микроорганизмов семейства
Enterobacteriaceae

Продолжение таблицы 9

Продолжение таблицы 9

Примечание: +, (+), d, (-), - - показывают процент позитивных биохимических реакций при t° = 36 ± 1 ºС через 48 часов инкубации (+ - 90 - 100 % положительных реакций; (+) - 76 - 89 %; d - 26 - 75 %; (-) - 11 - 25 %; - - 0 - 10 %).