4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Определение химических соединений
в биологических средах

Сборник методических указаний
МУК 4.1.763 - 4.1.779-99

Минздрав России
Москва 2000

1. Разработаны под редакцией академика РАЕН, д.м.н., проф. Зайцевой Н.В., к.б.н. Улановой Т.С., к.б.н. Нурисламовой Т.В., Карнажицкой Т.Д., Суетиной Г.Н., Поповой Н.В., Митрофановой В.М., Плаховой Л.В., Рудаковой Е.А. (ПНИКИ детской экопатологии).

2. Утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 6 июля 1999 г.

Содержание

 

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Газохроматографическое определение концентраций метилового,
этилового, изопропилового, пропилового, изобутилового и бутилового
спиртов в моче

Методические указания разработаны в соответствии с требованиями ГОСТа 8.563-96 «Методики выполнения измерений», ГОСТа Р 1.5-92 «Общие требования к построению, изложению, оформлению и содержанию стандартов». Методика анализа метрологически аттестована и обеспечивает определение Метилового, этилового, изопропилового, пропилового, изобутилового и бутилового спиртов в моче в следующих диапазонах:

МЕТИЛОВЫЙ СПИРТ

Метиловый спирт (метанол, древесный спирт) - бесцветная жидкость с характерным запахом. Т_кип - 64,51 °С, Т_плавл - минус 97,88 °С. Растворим в воде, этиловом спирте, эфире, ацетоне, бензоле. Сильный, преимущественно нервный и сосудистый яд с резко выраженным кумулятивным эффектом. Типичны поражения зрительного нерва и сетчатки глаза. Пары метилового спирта сильно раздражают оболочки глаз и дыхательных путей. Относится ко 2 классу опасности.

ЭТИЛОВЫЙ СПИРТ

Этиловый спирт (этанол, винный спирт) - бесцветная жидкость с характерным запахом. Т_кип - 78,39 °С, Т_плавл - минус 114,15 °С. Смешивается в любых отношениях с водой, спиртами, эфиром, глицерином и другими растворителями. Оказывает наркотическое действие, класс опасности 4.

ИЗОПРОПИЛОВЫЙ СПИРТ

Изопропиловый спирт (2-пропанол) - бесцветная жидкость с характерным спиртовым запахом. Т_{вспышки} - 22,50 °С, Т_плавл - минус 89,5 °С. Смешивается в любых отношениях с водой, этиловым спиртом, эфиром; растворим в ацетоне; хорошо растворим в бензоле. Раздражает слизистые оболочки глаз и верхних дыхательных путей. Пары могут повредить сетчатку глаза и зрительный нерв. Относится к 4 классу опасности.

ПРОПИЛОВЫЙ СПИРТ

Пропиловый спирт (пропанол) - бесцветная жидкость с характерным спиртовым запахом. Т_кип - 97,2 °С, Т_плавл - минус 126,2 °С. Смешивается в любых отношениях с водой, этиловым спиртом, эфиром; растворим в ацетоне; хорошо растворим в бензоле. Пары раздражают слизистые глаз и верхних дыхательных путей. Пропиловый спирт относится к 4 классу опасности.

БУТИЛОВЫЙ СПИРТ

Бутиловый спирт (1-бутанол) - бесцветная жидкость с характерным запахом. Т_кип - 117,4 °С, Т_плавл - минус 89,53 °С. Смешивается в любых отношениях с этиловым спиртом, эфиром; хорошо растворим в ацетоне. Наркотик с раздражающим действием паров на слизистые оболочки глаз и верхних дыхательных путей. Относится ко 2 классу опасности.

ИЗОБУТИЛОВЫЙ СПИРТ

Изобутиловый спирт - бесцветная жидкость с характерным запахом. Т_воспл. - 29 °С, коэффициент распределения масло/вода - 0,44. Смешивается в любых отношениях с этиловым спиртом, эфиром; хорошо растворим в ацетоне. Наркотик с раздражающим действием паров на слизистые оболочки глаз и верхних дыхательных путей. Относится ко 2 классу опасности.

Методика обеспечивает выполнение измерений с суммарной погрешностью результата измерений при доверительной вероятности 0,95:

Сущность метода

Методика основана на предварительном выделении спиртов из биологического материала путем нагревания объекта в герметичном объеме и последующего газохроматографического анализа равновесной паровой фазы над жидкой пробой.

Измерение концентрации метилового, этилового, пропилового, изопропилового, бутилового и изобутилового спиртов выполняют методом газовой хроматографии с пламенно-ионизационным детектированием.

Нижний предел измерения в объеме пробы :

Определению не мешают ароматические углеводороды, спирты, альдегиды, карбоновые кислоты и другие органические соединения. Длительность анализа, включая подготовку пробы, - 40 мин.

Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы

При выполнении анализа применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства, материалы и реактивы.

Средства измерений

Вспомогательные устройства

Материалы

Реактивы

Требования к безопасности

Помещение для проведения измерений должно соответствовать требованиям «Пожарных норм проектирования зданий и сооружений» (СНиП IIА-5-700) и «Санитарных норм проектирования промышленных предприятий» (СН-245-71) и СНиП-74.

При выполнении работ должны быть соблюдены меры противопожарной безопасности в соответствии с требованиями ГОСТа 12.1.004-85 и правила техники безопасности в соответствии с ГОСТом 12.1.007-76.

При работе необходимо соблюдать «Правила по технике безопасности и производственной санитарии при работе в химических лабораториях», утверждены МЗ СССР 20.12.82 (М.,1981), и «Правила устройства и безопасной эксплуатации сосудов, работающих под давлением», утверждены Госгортехнадзором СССР 27.11.87 (М.: Недра,1989).

При работе с реактивами соблюдают требования безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами по ГОСТу 12.1.005-88.

При выполнении измерений с использованием газового хроматографа соблюдают правила электробезопасности в соответствии с ГОСТом 12.1.019-79 и инструкции по эксплуатации прибора.

Требования к квалификации оператора

К выполнению хроматографических измерений биологических проб допускаются лица, прошедшие обучение работе на жидкостном хроматографе.

Условия измерений

При подготовке проб к анализу и приготовлении растворов соблюдают следующие условия:

- температура воздуха (20 ± 10) °С;

- атмосферное давление 630 - 800 мм рт. ст.;

- влажность воздуха - не более 80 % при температуре 25 °С.

Выполнение измерений на газовом хроматографе проводят в условиях, рекомендуемых технической документацией по прибору.

Подготовка к выполнению измерений

Перед выполнением измерений проводят следующие работы: подготовка хроматографической колонки, приготовление стандартных смесей, установление градуировочной характеристики.

Подготовка хроматографической колонки

Хроматографическую колонку перед заполнением неподвижной фазой промывают дистиллированной водой, ацетоном, гексаном, высушивают в токе инертного газа. Заполнение хроматографической колонки насадкой проводят под вакуумом. Концы колонки закрывают стекловатой и, не подключая к детектору, кондиционируют в токе газа-носителя (гелия) с расходом 30 см³/мин при температуре 150 °С в течение 18 ч. После охлаждения колонку подключают к детектору, записывают нулевую линию в рабочем режиме. При отсутствии мешающих влияний колонка готова к работе.

Приготовление стандартных смесей

Исходный стандартный раствор для градуировки. В колбу на 1000 см³ вводят микрошприцем по 10 мм³ метилового, этилового, пропилового, изопропилового, бутилового и изобутилового спиртов и доводят водой до метки. Содержание спиртов в исходной стандартной смеси составляет (с учетом плотности и содержания основного вещества):

метанол	7,97 мкг/см3;
этанол	7,89 мкг/см3;
изопропанол	7,85 мкг/см3;
пропанол	8,04 мкг/см3;
изобутанол	8,03 мкг/см3;
бутанол	8,10 мкг/см3.

Срок хранения исходного стандартного в холодном месте - не более 2 суток.

Установление градуировочной характеристики

Градуировочную характеристику устанавливают методом абсолютной градуировки на градуировочных смесях спиртов. Она выражает зависимость площади пика на хроматограмме (мм²) от концентрации соответствующего спирта в моче (мкг/см³) и строится по 5 сериям стандартных растворов для градуировки. Каждую серию, состоящую из 5 рабочих стандартных растворов, готовят в мерных колбах объемом 50 см³. Для этого в каждую колбу вносят исходный раствор в соответствии с таблицей и доводят мочой, не содержащей спирты, до метки. Срок хранения растворов - 8 ч.

Таблица

Стандартные смеси для установления градуировочной характеристики при
определении концентрации метанола, этанола, изопропанола, пропанола,
изобутанола и бутанола в моче (фрагмент шкалы)

10 см³ рабочего стандартного раствора переносят в герметичный сосуд (рис. 1, прилож. А), закрывают его навинчивающейся крышкой с инертной прокладкой и добавляют через отверстие в крышке медицинским шприцем 1,0 см³ 30 %-ного раствора хлорида натрия. Затем сосуд термостатируют на водяной бане при температуре 95 - 96 °С в течение 10 мин. 5 см³ равновесной паровой фазы вводят в колонку хроматографа и анализируют при следующем режиме работы прибора:

На полученной хроматограмме определяют площади пиков соответствующих спиртов и по средним результатам из 5 серий строят градуировочную характеристику. Градуировку проверяют 1 раз в 3 месяца и при смене партии реактивов.

Отбор проб

Для отбора проб мочи используют стеклянную посуду с притертой пробкой. Отбирают 20 - 30 см³ мочи и сразу анализируют или хранят в холодильнике не более 48 ч при температуре не выше 4 °С.

Выполнение измерений

Для анализа 10 см³ мочи переносят пипеткой в сосуд, закрывают его инертной прокладкой и крышкой с отверстием в центре, добавляют медицинским шприцем (объемом 2,0 см³) 1,0 см³ 30 %-ного раствора хлорида натрия и термостатируют сосуд на водяной бане при температуре 95 - 96 °С в течение 10 мин. Затем отбирают подогретым стеклянным шприцем 5 см³ равновесной паровой фазы и вводят в колонку хроматографа при вышеуказанном режиме работы прибора.

Вычисление результатов измерений

Рассчитывают площадь пика соответствующего спирта по формуле:

h - высота пика, мм;

L - ширина пика на половине высоты, мм.

По градуировочному графику определяют концентрацию соответствующего спирта в моче (мкг/см³).

Внутренний оперативный контроль

Внутренний оперативный контроль качества результатов контрольного химического анализа (сходимость, воспроизводимость, точность) осуществляют с целью получения оперативной информации о качестве анализов и принятия при необходимости оперативных мер по его повышению (МИ 2335-95).

Оперативный контроль сходимости

Контролируемым параметром является относительный размах выходных сигналов хроматографа при вводах трех параллельных проб градуировочного раствора. Контроль осуществляется при проведении градуировки, при периодическом контроле градуировочных коэффициентов, а также при выполнении измерений.

Результат контроля признается положительным при выполнении условия:

S - площадь пика, мм²;

 - среднее арифметическое значение площади пиков при вводе 3 параллельных проб градуировочного раствора.

Оперативный контроль точности

Периодичность контроля погрешности измерений зависит от количества рабочих измерений за контролируемый период и определяется планами контроля.

Образцами для контроля являются представительные пробы биосред, к которым делаются добавки в виде раствора. Отбирают 2 пробы и к одной из них делают добавку в виде раствора таким образом, чтобы их содержание увеличилось по сравнению с исходным на 50 - 150 %. Каждую пробу анализируют в точном соответствии с прописью методики и получают результат анализа исходной рабочей пробы X и рабочей пробы с добавкой X'. Результаты анализа исходной рабочей пробы X и рабочей пробы с добавкой X' получают не по возможности, а в одинаковых условиях, т.е. их получает один аналитик с использованием одного набора мерной посуды, одной партии реактивов и т.д.

Результаты контроля признаются удовлетворительными, если выполняется условие:

С - добавка к пробе в виде раствора с концентрацией мкг/см³;

К_д - норматив оперативного контроля погрешности, мкг/см³.

При внешнем контроле (Р = 0,95) принимают

, где

 - характеристики погрешностей для исходной пробы и пробы с добавкой, мкг/см³.

При внутрилабораторном контроле (Р = 0,90) принимают, что

К'д = 0,84∙Кд

При превышении оперативного контроля погрешности эксперимент повторяют. При повторном превышении указанного норматива выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам контроля, и их устраняют.

Приложение А

Рис. 1. Установка для создания равновесной паровой фазы.

1 - термометр; 2 - накидная гайка; 3 - шприц; 4 - резиновая мембрана; 5 - равновесный сосуд;
6 - проба; 7 - термостатируемая жидкостная баня.

Рис. 2. Стакан с навинчивающейся крышкой для фиксации пробки на флаконе.

Приложение Б

Прибор для анализа равновесной паровой фазы:

1 - термометр; 2 - накидная гайка; 3 - шприц; 4 - резиновая мембрана;
5 - равновесный сосуд; 6 - проба; 7 - термостатируемая жидкостная баня

Приложение В

Установка для перегонки с водяным паром