4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Измерение массовой концентрации
акролеина в крови
методом высокоэффективной
жидкостной хроматографии

Методические указания

МУК 4.1.3158-14

Москва 2014

1. Разработаны: ФБУН «Федеральный научный центр медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения» (Т.С. Уланова. Н.В. Зайцева, Т.Д. Карнажицкая, Е.О. Пшеничникова).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 26 декабря 2013 г. № 4).

3. Утверждены врио руководителя Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главного государственного санитарного врача Российской Федерации А.Ю. Поповой 24 февраля 2014 г.

4. Введены впервые.

СОДЕРЖАНИЕ

 

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Измерение массовой концентрации акролеина
в крови методом высокоэффективной
жидкостной хроматографии

Свидетельство о метрологической аттестации № 88-16374-008-01/00076-2013 от 08.02.2013.

1. Назначение и область применения

1.1. Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для измерения массовой концентрации акролеина в крови в диапазоне концентраций от 0,1 до 5,0 мг/дм³.

1.2. Методические указания по измерению массовой концентрации акролеина в крови методом высокоэффективной жидкостной хроматографии предназначены для использования территориальными органами и службами Роспотребнадзора, лечебными и научными учреждениями, осуществляющими деятельность в области профпатологии и экологии человека, научно-исследовательскими институтами, занимающимися вопросами гигиены окружающей среды.

1.3. Методические указания носят рекомендательный характер.

2. Физико-химические и токсикологические свойства

Акролеин (акриловый альдегид, этиленальдегид, 2-пропеналь) - бесцветная, легко воспламеняющаяся слезоточивая жидкость с резким запахом. Выделяется в атмосферный воздух с отработавшими газами автотранспорта, в процессе горения органического топлива, при приготовлении пищи (жарение, копчение). Относится к опасным веществам. Гигиенический норматив в Российской Федерации не установлен.

Регистрационный номер CAS	107-02-8
Формула	С3Н4О
Молекулярная масса	56,06
Тпл., °С	-87,7
Ткнп., °С	52,7
Плотность при 20 °С, г/см3	0,8389
Растворимость в воде при 20 °С, %	20,85
Растворим	в этаноле, ацетонитриле, ацетоне, диэтиловом эфире
Давление насыщенных паров при 20 °С, кПа	29
ПДК, мг/дм3	отсутствует
Класс опасности	2

Краткая токсикологическая характеристика. Обладает выраженным раздражающим, общетоксическим, аллергенным, мутагенным действием. Угнетает синтез ДНК и клеточное деление, ингибирует ДНК-полимеразу. Оказывает цитотоксическое действие.

3. Метрологические характеристики методики
выполнения измерений

При соблюдении всех регламентированных условий и проведении анализа в точном соответствии с данной методикой значения погрешности (и её составляющих) результатов измерений не превышают значений, приведенных в табл. 1.

Таблица 1

Диапазон измерений, значения точности (правильности и прецизионности)
методики

Значения показателя точности используют при:

- оформлении результатов измерений, выдаваемых лабораторией;

- оценке деятельности лабораторий на качество проведения измерений;

- оценке возможности использования результатов измерений при реализации методики измерений в конкретной лаборатории.

4. Метод измерения

Измерение массовой концентрации акролеина в крови основано на взаимодействии акролеина с 3-аминофенолом с образованием производного 7-гидроксихинолина и его анализе методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на обращенной фазе и флуориметрическом детектировании.

Нижний предел измерения в анализируемом объеме пробы - 2 нг. Средняя полнота извлечения свободного акролеина из крови - 84 %.

5. Средства измерений, вспомогательные устройства,
реактивы и материалы

5.1. Средства измерений

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

5.2. Реактивы

Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией

5.3. Вспомогательные устройства и материалы

Примечание. Допускается использование других вспомогательных устройств и материалов аналогичного назначения, технические характеристики которых не уступают указанным.

6. Требования безопасности

6.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-2009, а также требования, изложенные в технической документации на эксплуатацию жидкостного хроматографа.

6.2. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией и соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83.

6.3. Содержание вредных веществ в воздухе рабочей зоны не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и 2.2.5.2308-07.

7. Требования к квалификации оператора

К выполнению измерений и обработке их результатов допускают лиц, имеющих квалификацию не ниже инженера-химика с опытом работы на жидкостном хроматографе, освоивших метод измерений и получивших удовлетворительные результаты оперативного контроля процедуры измерений.

8. Условия измерений

При приготовлении градуировочных растворов и подготовке проб к анализу соблюдают следующие условия:

- температура окружающего воздуха (22 ± 2) °С;

- атмосферное давление от 84 до 106 кПа;

- относительная влажность воздуха от 30 до 80 %.

Выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

9. Подготовка к выполнению измерений

Перед выполнением измерений проводят следующие работы: подготовка посуды, приготовление растворов, подготовка хроматографической колонки, установление градуировочной характеристики.

9.1. Подготовка посуды

Используемую посуду вымыть мыльным раствором, промыть проточной водопроводной водой, многократно ополоснуть дистиллированной водой и высушить при температуре 50 °С.

9.2. Приготовление растворов

9.2.1. Раствор для элюирования А. В стакан вместимостью 600 см³ вносят 500 см³ дистиллированной воды, устанавливают на магнитную мешалку, помещают в раствор электроды pH-метра, небольшими порциями с помощью стеклянной пипетки вносят концентрированную фосфорную кислоту при перемешивании до установления pH 2,5. Срок хранения раствора 5 дней.

9.2.2. Раствор для элюирования В. В мерный цилиндр 2-100-1 помещают 25 см³ метанола, доводят до 100 см³ ацетонитрилом, закрывают пришлифованной стеклянной пробкой, тщательно перемешивают. Срок хранения раствора 5 дней.

9.2.3. Элюент для хроматографии. Состав элюента задают на двух каналах насоса: смешивают раствор для элюирования А и раствор для элюирования В в соотношении 94:6 % (объемная доля).

9.2.4. Раствор 3-аминофенола, молярная концентрация 0,023 моль/дм³. В мерную колбу вместимостью 50 см³ помещают навеску 0,1255 г 3-аминофенола, растворяют в 40 - 45 см³ дистиллированной воды при температуре 40 - 50 °С, остужают до комнатной температуры, доводят дистиллированной водой до метки. Срок хранения раствора 30 дней в холодильнике при температуре 4 - 6 °С.

9.2.5. Раствор гидроксиламина соляно-кислого, молярная концентрация 0,043 моль/дм³. В мерную колбу вместимостью 50 см³ помещают навеску 0,1494 г гидроксиламина соляно-кислого, растворяют в 40 - 45 см³ дистиллированной воды, доводят дистиллированной водой до метки. Срок хранения раствора 30 дней в холодильнике при температуре 4 - 6 °С.

9.2.6. Раствор железа (III) сульфата, массовая концентрация 2,8 мг/см³. В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают навеску 0,28 г железа (III) сульфата, девятиводного, растворяют в 50 - 60 см³ дистиллированной воды, добавляют 1 см³ серной кислоты концентрированной, доводят до метки дистиллированной водой. Срок хранения раствора не ограничен.

9.2.7. Раствор серной кислоты в дистиллированной воде, 16 % (объемная доля). В термостойкий стакан вместимостью 50 см³ помещают 10 см³ дистиллированной воды и 2 см³ серной кислоты концентрированной. Осторожно перемешивают, остужают до комнатной температуры. Срок хранения раствора не ограничен.

9.2.8. Исходный раствор акролеина (раствор 1). В мерную колбу вместимостью 50 см³ помещают 40 - 45 см³ спирта этилового, 50 мм³ чистого акролеина (с учетом плотности 42 мг) и доводят этиловым спиртом до метки. Массовая концентрация акролеина в исходном растворе - 0,84 мг/см³. Срок хранения раствора 14 дней в холодильнике при температуре 4 - 6 °С.

9.2.9. Раствор акролеина для градуировки (раствор 2). В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 40 - 45 см³ спирта этилового, 0,6 см³ исходного раствора акролеина и доводят этиловым спиртом до метки. Массовая концентрация акролеина в разбавленном растворе составляет 0,005 мг/см³. Используют свежеприготовленный раствор.

9.2.10. Раствор 7-гидроксихинолина для идентификации продукта реакции акролеина с 3-аминофенолом. В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают навеску 0,0100 г 7-гидроксихинолина, растворяют в 5 - 6 мл раствора 0,1 Н хлористоводородной кислоты, доводят до метки дистиллированной водой. Концентрация 7-гидроксихинолина в растворе составляет 100 мкг/см³. Срок хранения раствора 60 дней в холодильнике при температуре 4 - 6 °С.

9.3. Подготовка хроматографической колонки

Колонку устанавливают в хроматограф, подают ацетонитрил со скоростью 0,2 см³/мин в течение 0,5 ч, затем подают элюент состава: 94 % (объемная доля) раствора для элюирования А, 6 % (объемная доля) раствора для элюирования В со скоростью 0,2 см³/мин до установления равновесия колонки, которое определяют по стабильности нулевой линии детектора. Проводят холостую разгонку с установлением ступеней градиента: 6 мин - 6 % раствора В, 13 мин - 8 % раствора В, 17 мин - 10 % раствора В, 22 мин - 20 % раствора В с увеличением скорости подвижной фазы до 0,5 см³/мин, 36 мин - остановка разгонки.

9.4. Построение градуировочной характеристики

9.4.1. Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пика 7-гидроксихинолина (дериват акролеина) от массовой концентрации акролеина в крови устанавливают методом абсолютной градуировки по трем сериям растворов. Каждую серию, состоящую из шести градуировочных растворов, готовят из раствора акролеина для градуировки № 2, приготовленного по п. 9.2.9.

9.4.2. Градуировочные растворы готовят в стеклянных пробирках с притертой пробкой вместимостью 10 см³. Для этого в каждую пробирку вносят 0,25 см³ цельной крови с гепарином, раствор акролеина для градуировки и этанол в соответствии с табл. 2. В соответствии с п. 11 проводят анализ холостой пробы. При наличии анализируемого вещества в холостой пробе вычитают его фоновое содержание при построении градуировки.

Таблица 2

Градуировочные растворы для определения акролеина в крови

Проводят реакцию дериватизации для перевода акролеина в форму производного (7-гидроксихинолина). В каждую пробирку с градуировочным раствором добавляют 2 см³ раствора 3-аминофенола, 2 см³ раствора гидроксиламина соляно-кислого, 0,1 см³ раствора сульфата железа, 0,2 см³. раствора серной кислоты. Пробирки закрывают пробкой и тщательно перемешивают содержимое интенсивным встряхиванием. Пробирки нагревают на водяной бане 15 мин при температуре 100 °С, периодически открывая пробки. После охлаждения очищают прореагировавшую смесь способом твердофазной экстракции. Для этого в пробирку добавляют 0,35 г магния серно-кислого 7-водного и 0,05 г сорбента для хроматографии С₁₈, интенсивно встряхивают смесь в течение 1 мин, переносят в конические пробирки из полипропилена и центрифугируют 10 мин со скоростью 2000 об./мин. Надосадочный слой отбирают и пропускают через пористый фильтр (размер пор 0,45 мкм), используя шприц медицинский типа Люэр, фильтрат собирают в виалу, анализируют 20 мм³ экстракта в рабочем режиме хроматографа.

9.4.3. Режим работы хроматографа:

- колонка 4,6 мм ×150 мм, заполненная сорбентом С₁₈;

- элюент: 94 % раствора А, 6 % раствора В;

- градиент элюирования: 6 мин - 6% раствора В, 13 мин - 8 % раствора В, 17 мин - 10 % раствора В, 22 мин - 20 % раствора В, 30 мин - остановка разгонки, время после анализа - 6 мин;

- скорость движения элюента	0,2 см3/мин;
- флуориметрический детектор:
- длина волны возбуждения	243 нм
- длина волны эмиссии	501 нм
- температура термостата колонки	27 °С.

Градуировочный коэффициент рассчитывают по формуле:

C_i - массовая концентрация акролеина в градуировочном растворе, мг/дм³;

S_i - среднее значение трех измерений площади пика акролеина в форме его производного (7-гидроксихинолина), полученное при анализе i-го градуировочного раствора, условные единицы (уcл. ед.);

n - количество градуировочных смесей (n = 6).

Градуировку проводят при смене реактивов или разделительной колонки.

9.4.4. Контроль стабильности градуировочной характеристики. Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят 1 раз в квартал в анализируемой серии измерений. Образцами для контроля стабильности являются градуировочные растворы, выбранные таким образом, чтобы массовая концентрация акролеина соответствовала нижней, верхней границам и середине диапазона построения градуировочной характеристики. Градуировка признается стабильной при выполнении условия:

С - заданная массовая концентрация акролеина в градуировочном растворе;

C_m - результат измерения массовой концентрации акролеина в образце для градуировки.

При невыполнении условия (1) стабильности градуировочной характеристики эксперимент повторяют с другим градуировочным раствором. При повторном невыполнении условия стабильности градуировочной характеристики выясняют и устраняют причины нестабильности градуировочной характеристики.

10. Выполнение измерений

10.1. Отбор проб

Отбирают пробу крови объемом 1 см³ в пробирку, содержащую 0,025 см³ гепарина. Отобранные пробы хранят в холодильнике при температуре 4 - 6 °С, срок хранения проб 8 ч.

10.2. Порядок выполнения измерений

Выполняют два параллельных измерения массовой концентрации акролеина в образце крови. Для этого в стеклянные пробирки с притертой пробкой вместимостью 10 см³ вносят по 0,25 см³ пробы крови, добавляют 0,25 см³ этанола, 2 см³ раствора 3-аминофенола, 2 см³ раствора гидроксиламина соляно-кислого, 0,1 см³ раствора сульфата железа, 0,2 см³ раствора серной кислоты, закрывают пробкой. Смесь интенсивно встряхивают, нагревают на водяной бане 15 мин при температуре 100 °С, периодически открывая пробирки. После охлаждения очищают прореагировавшую смесь способом твердофазной экстракции. Для этого в каждую пробирку добавляют 0,35 г магния серно-кислого 7-водного и 0,15 г сорбента для хроматографии C₁₈, интенсивно встряхивают смесь в течение 1 мин, переносят в конические пробирки из полипропилена и центрифугируют 10 мин со скоростью 2000 об./мин. Надосадочный слой отбирают и пропускают через пористый фильтр (размер пор 0,45 мкм), используя шприц медицинский типа Люэр, фильтрат собирают в виалу, анализируют 20 мм³ экстракта в рабочем режиме хроматографа.

11. Обработка результатов измерений

11.1. Массовую концентрацию акролеина в крови (мг/дм³) вычисляют по формуле:

С - массовая концентрация акролеина в анализируемой пробе, мг/дм³;

S_i - площадь пика 7-гидроксихинолина на хроматограмме, (усл. ед.);

K - градуировочный коэффициент.

11.2. За результат измерения  принимают среднее арифметическое значение двух результатов измерений, полученных в условиях повторяемости C₁, С₂ (параллельных определений), для которых выполняется условие:

r - предел повторяемости. Значения предела повторяемости приведены в табл. 3.

При невыполнении условия (2) получают дополнительно еще два результата измерений. За результат измерений принимают среднее арифметическое четырех результатов измерений, полученных в условиях повторяемости, для которых выполняется условие:

CR_0,95(4) - критический диапазон. Значения критического диапазона приведены в табл. 3.

Таблица 3

Значения пределов повторяемости, воспроизводимости и критического
диапазона при доверительной вероятности Р = 0,95

При невыполнении условия (3) в качестве окончательного результата измерений принимают медиану четырех результатов измерений, полученных в условиях повторяемости (параллельных определений). Выявляют и устраняют причины, приводящие к невыполнению условий (2) и (3).

12. Оформление результатов измерений

Результат измерений представляют в виде ( ± Δ) мг/дм³, где

 - средний результат измерений, мг/дм³;

Δ - характеристика погрешности, мг/дм³ при Р = 0,95, значение Δ рассчитывают по формуле:

δ - относительное значение характеристики погрешности, % (приведено в табл. 1).

13. Контроль качества результатов измерений

Контроль качества результатов измерений в пределах лаборатории организуют и проводят путем проведения оперативного контроля процедуры измерений и контроля стабильности результатов измерений в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-(1-6)-2002 и РМГ 76-2004.

Периодичность получения результатов контрольных процедур и формы их регистрации приводят в документах лаборатории, устанавливающих порядок и содержание работ по организации методов контроля стабильности результатов измерений в пределах лаборатории.

13.1. Алгоритм оперативного контроля процедуры измерений
с использованием метода добавок

Оперативный контроль процедуры измерений с использованием метода добавок проводят путем сравнения результата отдельно взятой контрольной процедуры K_k с нормативом контроля K.

Результат контрольной процедуры K_k рассчитывают по формуле

 - результат измерений массовой концентрации акролеина в пробе с известной добавкой - среднее арифметическое двух результатов измерений, полученных в условиях повторяемости, расхождение между которыми удовлетворяет условию (2);

 - результат измерений массовой концентрации акролеина в исходной пробе - среднее арифметическое двух результатов измерений, полученных в условиях повторяемости, расхождение между которыми удовлетворяет условию (2).

Норматив контроля K рассчитывают по формуле:

,  - значения характеристики погрешности результатов измерений, установленные в лаборатории при реализации методики, соответствующие массовой концентрации акролеина в пробе с известной добавкой и в исходной пробе соответственно.

Примечание. Допустимо характеристику погрешности результатов измерений при внедрении методики в лаборатории устанавливать на основе выражения: Δ_л = 0,84⋅Δ, с последующим уточнением по мере накопления информации в процессе контроля стабильности результатов измерений.

Процедуру измерений признают удовлетворительной при выполнении условия:

При невыполнении условия (4) контрольную процедуру повторяют. При повторном невыполнении условия (4) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.2. Алгоритм проведения контрольной процедуры
при контроле внутрилабораторной прецизионности

Образцами для контроля внутрилабораторной прецизионности являются пробы крови (рабочие пробы).

При реализации контрольной процедуры получают два результата контрольных измерений (первичного  и повторного ) массовой концентрации акролеина в условиях внутрилабораторной прецизионности.

Результат контрольной процедуры признают удовлетворительным при выполнении следующего условия:

 и  - результаты измерений массовых концентраций акролеина, полученные в условиях внутрилабораторной прецизионности, т.е. в одной лаборатории в разное время, разными операторами;

R_л - предел внутрилабораторной прецизионности, значения предела внутрилабораторной прецизионности приведены в табл. 4.

При невыполнении условия (5), процедуру повторяют. При повторном превышении предела внутрилабораторной прецизионности выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

Таблица 4

Значения предела внутрилабораторной прецизионности
при доверительной вероятности Р = 0,95

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений,
получаемых в условиях воспроизводимости

Образцами для проверки приемлемости результатов измерений, получаемых в условиях воспроизводимости, являются образцы крови с внесенными в них добавками аттестованного раствора акролеина, подготовленные в соответствии с п. 9.4.2.

Проверку приемлемости результатов измерений, получаемых в условиях воспроизводимости, проводят по результатам измерений массовых концентраций акролеина из образцов крови (специально подготовленные образцы крови с внесенными добавками аттестованного раствора акролеина) с одинаковым содержанием акролеина.

Результаты измерений признают приемлемыми при выполнении условия

 и  - результаты измерений массовых концентраций акролеина (средние арифметические параллельных определений), полученные в условиях воспроизводимости, т.е. в разных лабораториях;

R - предел воспроизводимости, значения предела воспроизводимости приведены в табл. 3.

При выполнении условия (6) результаты измерений, полученные в двух лабораториях, являются совместимыми и может быть рассчитано общее среднее арифметическое результатов измерений, полученных в двух лабораториях.

При невыполнении условия (6) могут быть проведены процедуры проверки приемлемости согласно раздела 5 ГОСТ Р ИСО 5725-6.