4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Измерение массовых концентраций
химических соединений и элементов
в биологических средах

Сборник методических указаний
по методам контроля
МУК 4.1.3037-12; 4.1.3040-12; 4.1.3041-12

Москва 2013

1. Разработаны Федеральным бюджетным учреждением науки «Федеральный научный центр медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения» Роспотребнадзора (Т.С. Уланова, Н.В. Зайцева, Е.В. Стенно, Г.А. Вейхман, М.А. Баканина, Ю.В. Шардакова, Т.Д. Карнажицкая, А.В. Кислицина).

2. Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 7 сентября 2012 г.

3. Введены в действие с момента утверждения.

4. Введены впервые.

СОДЕРЖАНИЕ

 

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Измерение массовых концентраций меди, цинка в желчи
методом атомно-абсорбционной спектрометрии

1. Область применения и общие положения

Свидетельство об аттестации от 30.11.2010 № 223.1.0239/01.00258/2010.

1.1. Настоящие методические указания устанавливают метод атомно-абсорбционной спектрометрии в пламени для определения в желчи массовой концентрации меди и цинка в диапазонах измерений в анализируемом растворе 0,05 - 0,5 мкг/см³ и 0,1 - 2,0 мкг/см³ соответственно. Методика может быть использована для определения более высоких концентраций элементов после разбавления минерализата.

1.2. Методические указания по определению массовых концентраций меди и цинка в желчи предназначены для использования органами и организациями Роспотребнадзора, а также лечебными и научными организациями, осуществляющими деятельность в области профпатологии и экологии человека, научно-исследовательскими институтами, занимающимися вопросами гигиены окружающей среды.

1.3. Методические указания разработаны с целью обеспечения контроля содержания металлов в биологических средах у населения, проживающего в районах с повышенным уровнем загрязнения окружающей среды.

1.4. Медь (Cu), атомная масса - 63,55.

Медь - розовый или красноватый металл. Т_пл - 1083 °С, Т_кип. - 2543 °С, плотность - 8,93 г/см³. Растворим в HNO₃ и горячей концентрированной H₂SO₄. Порошкообразная медь растворяется в 0,3 %-м растворе HCl и желудочном соке [1].

Краткая токсикологическая характеристика

Относится к 2-му классу опасности [1].

Гепатотоксичность меди и ее соединений связана со способностью повышать проницаемость мембран митохондрий [2].

Токсическая доза 200 - 250 мг/сут. [3].

1.5. Цинк (Zn), атомная масса - 65,37.

Цинк - голубовато-серебристый металл. Т_пл. - 419,5 °С, Т_кип - 906,2 °С, плотность - 7,14 г/см³. Растворим в кислотах и щелочах [1].

Краткая токсикологическая характеристика

Относится к 3-му классу опасности [1].

Вдыхание паров цинка в течение 4 - 6 ч при сварке или гальванизации может приводить к возникновению «цинковой лихорадки».

Вдыхание хлорида цинка может вызывать воспаление слизистых оболочек верхних дыхательных путей, отек легких [2].

Токсическая доза - 600 мг/день [3].

2. Погрешность измерений

Методика обеспечивает выполнение измерений с погрешностью, не превышающей для меди ± 16 %, для цинка ± 14 % при доверительной вероятности 0,95, соответствует характеристикам, приведенным в табл. 1.

Таблица 1

Диапазон измерений, показатели точности измерений

3. Метод измерений

Измерения массовых концентраций меди и цинка выполняют методом атомно-абсорбционной спектрометрии, основанном на измерении величины поглощения света соответствующего длине волны исследуемого элемента в пламени.

Для измерения используется поглощение с длиной волны, соответствующей максимуму поглощения определяемого металла при прохождении через содержащий пары атомов металлов слой воздуха: меди - 324,8 нм, цинка - 213,9 нм [4].

Длительность выполнения анализа составляет около 4 ч, с учетом прогрева лампы, юстировки аппаратуры, приготовления градуировочных растворов, построения градуировочных характеристик.

Нижний предел измерения в анализируемом растворе для меди - 0,05 мкг/см³, для цинка - 0,1 мкг/см³.

Методика может быть использована для определения более высоких или низких концентраций элементов после разбавления или концентрирования минерализата.

4. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы

4.1. Средства измерений

Примечание. Допускается использование средств измерения иных производителей с аналогичными или лучшими характеристиками.

4.2. Реактивы

Примечание. Допускается использование реактивов иных производителей с более высокой квалификацией.

4.3. Вспомогательные устройства, материалы

Примечание. Допускается применение оборудования и материалов иных производителей с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

5. Требования безопасности

5.1. При выполнении измерений массовых концентраций соблюдают требования противопожарной безопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.004-91, правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-2009, имеют средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83.

5.2. При работе необходимо соблюдать «Правила по технике безопасности и производственной санитарии при работе в химических лабораториях» [5] и «Правила устройства и безопасной эксплуатации сосудов, работающих под давлением» [6].

5.3. При работе с реактивами соблюдают требования безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами по ГОСТ 12.1.007-76 и ГОСТ 12.1.005-88. Помещение должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией.

5.4. При работе с биологическими средами необходимо соблюдать правила в соответствии с требованиями СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней».

5.5. При выполнении измерений на приборе соблюдают правила, указанные в руководстве по правилам эксплуатации атомно-абсорбционного спектрофотометра.

5.6. Обучение и инструктаж по безопасности труда проводят в соответствии с ГОСТ 12.0.004-90.

6. Требования к квалификации оператора

К выполнению измерений и обработке их результатов допускают лиц, имеющих квалификацию не ниже инженера-химика с опытом работы на атомно-абсорбционном спектрофотометре и получивших удовлетворительные результаты при проведении проверки процедуры измерений. Операции по подготовке проб желчи к анализу может выполнять лаборант или техник, имеющий опыт работы в химической лаборатории.

К обслуживанию атомно-абсорбционного спектрометра допускают лиц, имеющих квалификацию не ниже инженера КИП и А, прошедших инструктаж по технике безопасности на рабочем месте и ознакомленных с правилами обслуживания атомно-абсорбционного спектрофотометра.

7. Условия измерений

7.1. При подготовке к проведению измерений и приготовлении растворов соблюдают следующие условия:

- температура воздуха 15 - 25 °C;

- атмосферное давление 630 - 800 мм рт.ст.;

- влажность воздуха не более 80 %.

7.2. Выполнение измерений на атомно-абсорбционных спектрофотометрах проводят в условиях, рекомендуемых технической документацией к прибору.

8. Подготовка к выполнению измерений

При подготовке к выполнению измерений проводят следующие работы: подготовка химически чистой и обеззараженной посуды, подготовка атомно-абсорбционного спектрофотометра к работе, приготовление деионизованной воды, приготовление 1 %-й азотной кислоты (HNO₃), приготовление градуировочных растворов, построение градуировочной характеристики.

8.1. Подготовка посуды

Посуду моют в моющем средстве с добавлением 6 %-го раствора перекиси водорода, многократно ополаскивают проточной водой, на сутки замачивают в растворе азотной кислоты, приготовленной в соотношении 1:5, а затем 2 - 3 раза ополаскивают бидистиллированной и 1 - 2 раза деионизованной водой. Посуду, которая использовалась для отбора и хранения биологических сред, перед мытьем дезинфицируют с применением дезинфицирующих средств.

8.2. Подготовка прибора к анализу

Подготовку атомно-абсорбционного спектрофотометра к работе проводят в соответствии с инструкцией по эксплуатации.

Устанавливают необходимую для анализа спектральную лампу, прогревают не менее 20 мин и после настройки прибора выводят на рабочий режим согласно инструкции. Для настройки прибора в качестве нулевого раствора используют 1 %-й раствор азотной кислоты.

8.3. Приготовление растворов для установки градуировочной характеристики

8.3.1. Основной раствор с содержанием определяемого металла 100 мкг/см³ (раствор готовят отдельно для каждого определяемого металла).

Раствор готовят из ГСО с массовой концентрацией ионов металла 1 мг/см³. В мерную колбу вместимостью 50 см³ вносят 5 см³ ГСО состава раствора ионов металла и доводят объем в колбе до метки 1 %-м раствором азотной кислоты. Раствор устойчив в течение 1 месяца.

8.3.2. Рабочие растворы определяемых металлов (меди, цинка) с массовой концентрацией 5 мкг/см³.

Готовят из основного раствора с массовой концентрацией 100 мкг/см³. В мерную колбу вместимостью 100 см³ вносят 5 см³ основного раствора определяемого металла и доводят объем в колбе до метки 1 %-м раствором азотной кислоты. Раствор устойчив в течение 3 дней.

8.3.3. Рабочие растворы определяемых металлов с массовой концентрацией 5 мкг/см³ используют для получения градуировочных растворов. Объем рабочего раствора согласно табл. 2, 3 вносят в мерную колбу на 100 см³ и доводят до метки 1 %-м раствором азотной кислоты. Применяют свежеприготовленными.

8.3.4. Раствор азотной кислоты 1 %-й.

Концентрированную азотную кислоту объемом 8 см³, плотностью 1,415 г/см³ смешивают с 512 см³ деионизованной воды.

Таблица 2

Растворы для установления градуировочной характеристики при определении концентрации меди

Таблица 3

Растворы для установления градуировочной характеристики при определении концентрации цинка

8.4. Установление градуировочной характеристики

Градуировочную характеристику устанавливают методом абсолютной градуировки на приготовленных градуировочных растворах металлов. Она выражает зависимость величины абсорбции от концентрации металла (мкг/см³). Градуировочную характеристику устанавливают по результатам измерений 4 серий по 4 концентрациям вещества в каждой серии.

Устанавливают начало отсчета, вводя в пламя 1 %-й раствор азотной кислоты (нулевой раствор). Для построения градуировочной характеристики для каждого элемента измеряют абсорбцию градуировочных растворов в порядке возрастания концентрации определяемого элемента. Измерения повторяют дважды. По результатам измерений строят график зависимости средней величины атомного поглощения определяемого металла от его массовой концентрации в градуировочном растворе.

Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят через 5 проб в анализируемой серии измерений. Содержание металла определяют в градуировочном растворе, концентрация которого соответствует середине градуировочного интервала. Градуировка признается стабильной, если расхождение между известным значением массовой концентрации иона металла в растворе для градуировки и измеренным значением концентрации металла в этом растворе не превышает 5 %:

|С - С_i| ≤ 0,05 ∙ С_i, где

С - измеренное значение массовой концентрации металла в растворе для градуировки, мкг/см³;

С_i - известное значение массовой концентрации металла в растворе для градуировки, мкг/см³.

8.5. Отбор проб

Отбор проб желчи производят из дуоденального содержимого при зондировании. Пробы для анализа на металлы объемом не менее 5 см³ отбирают в химически чистые, обеззараженные пробирки из полипропилена вместимостью 15 см³ с винтовыми крышками. Пробы помещают в морозильную камеру. Возможно хранение проб в холодильнике (от 0 до 4 °С) до 3 суток или длительное хранение при замораживании.

8.6. Подготовка проб к анализу

Замороженные пробы слегка размораживают и тщательно перемешивают стеклянной палочкой в целях гомогенизации исходного материала. Гомогенизированную пробу полностью размораживают, для минерализации отбирают 1 см³ желчи в химически чистую мерную пробирку, добавляют 1 см³ концентрированной азотной кислоты, выдерживают 15 - 20 мин, затем 5 мин в пробирочном электронагревателе при температуре 120 - 130 °С. Полученную смесь оставляют на 2,5 - 3,0 ч при комнатной температуре, добавляют 1 см³ концентрированной перекиси водорода, подогревают в пробирочном электронагревателе 5 - 10 мин при температуре 120 - 130 °С. Объем пробы желчи для минерализации можно увеличить до 2 см³, увеличивая объемы азотной кислоты и перекиси водорода также до 2 см³. Полученный раствор охлаждают.

Для каждой серии анализов ставят 2 холостые пробы, повторяя процедуру подготовки проб желчи. Для этого используют чистые пробирки из той же серии посуды, которая используется для анализа, и добавляют реактивы, как и в анализируемых пробах. Желчь в холостой пробе заменяют деионизованной водой.

Объемы полученных растворов проб желчи и холостой пробы доводят до 5 - 6 см³ (при отборе 1 см³ желчи) деионизованной водой и направляют на измерение на атомно-абсорбционном спектрометре.

Измерение холостых проб проводят вместе с подготовленными пробами желчи. Среднее значение концентрации холостой пробы учитывают в формуле расчета анализа каждой пробы (п. 10).

Подготовку проб к анализу проводят в вытяжном шкафу.

9. Выполнение измерений

9.1. Подготовленные к анализу растворы проб желчи (минерализаты) и холостые пробы анализируют на атомно-абсорбционном спектрофотометре для определения исследуемого металла (меди или цинка).

9.2. Спектральную лампу устанавливают в прибор и прогревают не менее 20 мин. Устанавливают монохроматор на нужную длину волны, выбирают ширину спектральной щели, ставят на распыление деионизованную воду, подбирают необходимое соотношение газов (ацетилен-воздух) для поддержания горения и поджигают пламя.

Капилляр, подающий раствор в пламя опускают в 1 %-й раствор азотной кислоты и определяют нулевую линию.

9.3. Распыляют в пламя градуировочные растворы определяемого металла для построения градуировочной характеристики, затем вводят пробы и регистрируют значения концентраций исследуемых проб. Точность настройки прибора проверяют введением раствора заданной концентрации через каждые пять проб, в случае необходимости повторяют процедуру построения градуировочной характеристики. При высоком содержании определяемого компонента аликвоту пробы разбавляют 1 %-м раствором азотной кислоты, коэффициент разбавления учитывают при расчете результата анализа.

10. Обработка (вычисление) результатов измерений

10.1. Массовую концентрацию определяемого металла в желчи рассчитывают по формуле:

 где

С - массовая концентрация металла в пробе, мкг/см³;

а - массовая концентрация металла в растворе пробы, определяемая по градуировочной характеристике, мкг/см³;

хп - массовая концентрация металла в растворе холостой пробы, мкг/см³;

к - коэффициент разбавления;

V - объем раствора минерализованной пробы, см³;

V' - объем пробы желчи, взятой для анализа, см³.

10.2. За результат измерения  принимают среднее арифметическое значение двух параллельных определений С₁, С₂, для которых выполняется условие:

 где                                           (1)

r - предел повторяемости.

Значения предела повторяемости приведены в табл. 4.

При невыполнении условия (1) получают дополнительно еще два результата измерений. За результат измерений принимают среднее арифметическое четырех результатов измерений, полученных в условиях повторяемости, для которых выполняется условие:

 где                    (2)

СR_0,95(4) - критический диапазон.

Значения критического диапазона приведены в табл. 4.

При невыполнении условия (2) в качестве окончательного результата измерений принимают медиану четырех результатов измерений, полученных в условиях повторяемости (параллельных определений).

Дополнительно выявляют и устраняют причины, приводящие к невыполнению условия (1).

10.3. Расхождение между результатами измерений не должно превышать предел воспроизводимости:

 где                                        (3)

 и  - результаты измерений массовых концентраций металлов, полученные в разных лабораториях - средние арифметические двух результатов измерений, полученных в условиях повторяемости, для которых выполняется условие (1), мкг/см³;

R - значение предела воспроизводимости, приведенное в табл. 4.

При выполнении условия (3) приемлемы оба результата измерений, в качестве окончательного может быть использовано их среднее арифметическое значение. Значения предела воспроизводимости приведены в табл. 4.

Таблица 4

Пределы повторяемости, критического диапазона, внутрилабораторной прецизионности, воспроизводимости при вероятности Р = 0,95

11. Оформление результатов измерений

Результат измерений представляют в виде  мкг/см³, где Δ - характеристика погрешности, мкг/см³, при Р = 0,95, значение Δ рассчитывают по формуле:

 где

значение δ приведено в табл. 1.

Примечание. При представлении результата измерений в документах, выдаваемых лабораторией, указывают:

- количество результатов параллельных определений, использованных для расчета результата измерений;

- способ определения результата измерений (среднее арифметическое значение или медиана результатов параллельных определений).

12. Процедуры обеспечения достоверности измерений

Контроль стабильности результатов измерений в пределах лаборатории организуют и проводят в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002 и РМГ 76-2004 ГСИ.

Периодичность получения результатов контрольных процедур и формы их регистрации приводят в документах лаборатории, устанавливающих порядок и содержание работ по организации методов контроля стабильности результатов измерений в пределах лаборатории.

12.1. Алгоритм оперативного контроля процедуры измерений с использованием метода добавок

Оперативный контроль процедуры измерений проводят путем сравнения результата отдельно взятой контрольной процедуры К_к с нормативом контроля К.

Результат контрольной процедуры К_к (мкг/см³) рассчитывают по формуле:

 где

 - результат измерений массовой концентрации металла в пробе с известной добавкой - среднее арифметическое двух результатов измерений, полученных в условиях повторяемости, расхождение между которыми удовлетворяет условию (1), мкг/см³;

 - результат измерений массовой концентрации металла в исходной пробе - среднее арифметическое двух результатов измерений, полученных в условиях повторяемости, расхождение между которыми удовлетворяет условию (1), мкг/см³;

С_д - величина введенной добавки, мкг/см³.

Норматив контроля К рассчитывают по формуле:

 где

 - значения характеристики погрешности результатов измерений, установленные в лаборатории при реализации методики, соответствующие массовой концентрации металла в пробе с известной добавкой и в исходной пробе соответственно, мкг/см³.

Примечание. Допустимо характеристику погрешности результатов измерений при внедрении методики в лаборатории устанавливать на основе выражения: Δ_л = 0,84Δ с последующим уточнением по мере накопления информации в процессе контроля стабильности результатов измерений.

Процедуру измерений признают удовлетворительной при выполнении условия:

|К_к| ≤ К.                                                            (4)

При невыполнении условия (4) контрольную процедуру повторяют. При повторном невыполнении условия (4) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

12.2. Алгоритм проведения контрольной процедуры при контроле внутрилабораторной прецизионности

Контрольные процедуры при контроле внутрилабораторной (промежуточной) прецизионности получают с использованием рабочих проб желчи. При реализации контрольной процедуры получают два результата контрольных измерений (первичного  и повторного ) массовой концентрации металла в условиях внутрилабораторной прецизионности.

Результат контрольной процедуры признают удовлетворительным при выполнении следующего условия:

                                             (5)

Значения предела внутрилабораторной прецизионности приведены в табл. 5.

Таблица 5

Значения предела внутрилабораторной прецизионности при доверительной вероятности Р = 0,95

13. Разработчики

Уланова Т.С., Зайцева Н.В., Стенно Е.В., Вейхман Г.А., Баканина М.А., Шардакова Ю.В. (ФБУН «Федеральный научный центр медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения» Роспотребнадзора).

Приложение 1
(справочное)

Библиография

1. Вредные вещества в промышленности: Справочник для химиков, инженеров и врачей /Под ред. Н.В. Лазарева и И.Д. Гадаскиной, Л.: «Химия», 1977, Т. III. С. 350, 444, 507.

2. Элленхорн М.Дж. Медицинская токсикология: диагностика и лечение. М.: Медицина. 2003. Т. 2.

3. Скальный А.В., Рудаков И.А. Биоэлементы в медицине. М.: «Мир», 2004. С. 92, 97, 98.

4. Ермаченко Л.А. Атомно-абсорбционный анализ в санитарно-гигиенических исследованиях: Методическое пособие. М., 1997. 207 с.

5. «Правила по технике безопасности и производственной санитарии при работе в химических лабораториях». Утверждены МЗ СССР 20.12.82. М., 1981.

6. «Правила устройства и безопасной эксплуатации сосудов, работающих под давлением». Утверждены Госгортехнадзором СССР 27.11.87. М.: Недра, 1989.

Приложение 2
(справочное)

В настоящих методических указаниях использованы ссылки на следующие документы.

ГОСТ Р 52501-2005 «Вода для лабораторного анализа. Технические условия».

ГОСТ 1770-74 «Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Технические условия».

ГОСТ 7328-01 «Гири. Общие технические условия».

ГОСТ 25336-82 «Посуда и оборудование лабораторное стеклянное. Типы, основные параметры и размеры».

ГОСТ 29227-91 «Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные». Ч. 1. Общие требования.

ГОСТ 12.1.004-91 «ССБТ. Пожарная безопасность. Общие требования».

ГОСТ 12.1.005-88 «ССБТ. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны».

ГОСТ 12.0.004-90 «ССБТ. Организация обучения безопасности труда. Общие положения».

ГОСТ 12.1.007-76 «ССБТ. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности».

ГОСТ 12.1.019-09 «ССБТ. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты».

ГОСТ 12.4.009-83 «ССБТ. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание».

СП 1.3.2322-08 «Санитарно-эпидемиологические правила «Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней».

ГОСТ 949-73 «Баллоны стальные малого и среднего объема для газов».

ГОСТ 11125-84 «Реактивы. Кислота азотная. Технические условия».

ГОСТ 5457-75 «Ацетилен растворенный и газообразный технический. Технические условия».

ГОСТ 177-88 «Водорода перекись. Технические условия».

ГОСТ Р 53228-2008 «Весы неавтоматического действия. Ч. 1. Метрологические и технические требования. Испытания».

ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».

РМГ 76-2004 ГСИ «Внутренний контроль качества результатов количественного химического анализа».

ТУ 2605-463-76 «Редуктор ацетиленовый».

ТУ 25-11.1592-81 «Бидистиллятор стеклянный БС».

ТУ 25-11.1630-84 «Шкаф вытяжной химический».

ТУ 64-2-300 «Пробирки из полипропилена с винтовыми крышками».

Примечание. При использовании настоящих методических указаний целесообразно проверить действие ссылочных стандартов на территории Российской Федерации по соответствующему указателю стандартов, составленному на 1 января текущего года, и по соответствующим информационным указателям, опубликованным в текущем году. Если ссылочный документ заменен (изменен), то при пользовании настоящими методическими указаниями следует руководствоваться замененным (измененным) стандартом. Если ссылочный документ отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.