Государственное санитарно-эпидемиологическое нормирование 4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ Измерение массовых концентраций Сборник методических указаний Москва 2013 1. Разработаны Федеральным бюджетным учреждением науки «Федеральный научный центр медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения» Роспотребнадзора (Т.С. Уланова, Н.В. Зайцева, Е.В. Стенно, Г.А. Вейхман, М.А. Баканина, Ю.В. Шардакова, Т.Л. Карнажицкая, А.В. Кислицина). 2. Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 7 сентября 2012 г. 3. Введены в действие с момента утверждения. 4. Введены впервые. СОДЕРЖАНИЕ
4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ Измерение массовой концентрации
бенз(а)пирена Методические
указания 1. Область применения и общие положенияСвидетельство об аттестации от 30.11.2010 № 223.1.0332/01.00258/2010. 1.1. Настоящие методические указания устанавливают метод высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения массовой концентрации бенз(а)пирена в крови в диапазоне 0,02 - 2,00 мкг/дм3. 1.2. Методические указания предназначены для использования органами и организациями Роспотребнадзора, а также иными организациями, деятельность которых связана с вопросами гигиены окружающей среды. 1.3. Бенз(а)пирен
Молекулярная масса - 252,32. Бенз(а)пирен (3,4-бензпирен) - светло-желтые кристаллы, температура плавления 175 - 180,5 °С, температура кипения 456 °С, плотность 1,351 - 1,282 г/см3. Растворим в ацетонитриле, этаноле, метаноле, гексане, метиленхлориде и других органических растворителях [1]. Растворимость бенз(а)пирена в пресной воде 0,11 мкг/дм3, в соленой воде - 0,13 мкг/дм3 [2]. Присутствует в атмосферном воздухе, природной воде, растениях, копченых продуктах как загрязнитель. Краткая токсикологическая характеристика Бенз(а)пирен - вещество 1-го класса опасности. Обладает мутагенным, канцерогенным, эмбриотоксическим и тератогенным эффектами [3]. 2. Погрешность измеренийПогрешность измерений, соответствует характеристикам, приведенным в табл. 1. Таблица 1 Диапазон измерений, значения показателей точности, повторяемости, внутрилабораторной прецизионности, воспроизводимости
3. Метод измеренийИзмерение концентрации бенз(а)пирена в крови основан на экстракции бенз(а)пирена из биопробы ацетонитрилом в присутствии высаливателей, очистке экстракта на сорбенте C18 и анализе очищенного экстракта на жидкостном хроматографе с использованием флуориметрического детектора. Определению не мешают ароматические углеводороды, фенол, стирол, полиядерные ароматические углеводороды. Диапазон измерений массовой концентрации бенз(а)пирена в крови - 0,02 - 2,00 мкг/дм3. Средняя полнота извлечения свободного бенз(а)пирена из крови составляет 62 %. 4. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы4.1. Средства измерений
Примечание. Допускается использование средств измерения иных производителей с аналогичными или лучшими характеристиками. 4.2. Реактивы
Примечание. Допускается использование реактивов иных производителей с аналогичной или более высокой квалификацией. 4.3. Вспомогательные устройства, материалы
Примечание. Допускается применение оборудования и материалов иных производителей с аналогичными или лучшими техническими характеристиками. 5. Требования безопасности и охраны окружающей среды5.1. При работе с реактивами соблюдают требования безопасности по ГОСТ 12.1.007-76 и 12.1.005-88. 5.2. При выполнении измерений с использованием жидкостного хроматографа соблюдают меры безопасности, указанные в руководстве по правилам эксплуатации прибора, правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-2009, противопожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и имеют средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83, обучение и инструктаж по безопасности труда проводится в соответствии с ГОСТ 12.0.004-90. 5.3. Помещение должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией. 5.4. При работе с биологическими средами необходимо соблюдать правила в соответствии с требованиями СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней». 5.5. При выполнении измерений на приборе соблюдают правила. указанные в руководстве по правилам эксплуатации жидкостного хроматографа. 6. Требования к квалификации операторовК выполнению измерений допускаются лица, имеющие квалификацию не ниже инженера-химика с опытом работы на жидкостном хроматографе, освоившие метод анализа и получившие удовлетворительные результаты оперативного контроля процедуры выполнения измерений. 7. Условия измерений7.1. Подготовку и проведение измерений проводят при следующих условиях: - температура воздуха (20 ± 5) °С, влажность не более 80 %; - атмосферное давление (630 - 800) мм рт.ст. 7.2. Выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендуемых технической документацией прибора. 8. Подготовка к выполнению измеренийПеред выполнением измерений проводят следующие работы: подготовка посуды, приготовление растворов, подготовка хроматографической колонки, установление градуировочной характеристики. 8.1. Подготовка посуды Используемую стеклянную посуду замачивают на 1 ч в хромовой смеси, промывают проточной водопроводной водой, ополаскивают дистиллированной водой, высушивают в сушильном шкафу при температуре 105 °С, ополаскивают ацетонитрилом. 8.2. Приготовление растворов 8.2.1. Элюент для хроматографии. Смесь ацетонитрила с дистиллированной водой в соотношении 60:40 % (объемная доля). Состав элюента задают на двух каналах насоса. 8.2.2. Хромовая смесь. В термостойкий стакан вместимостью 2 дм3 насыпают 50 г калия двухромовокислого, осторожно приливают по палочке частями, тщательно перемешивая, 1 дм3 концентрированной серной кислоты. 8.2.3. Исходный раствор бенз(а)пирена № 1, концентрация 1 мкг/см3. В мерную колбу вместимостью 100 см3 вносят 1,0 см3 ГСО с массовой концентрацией бенз(а)пирена 100 мкг/см3 и доводят ацетонитрилом до метки. Срок хранения раствора 60 дней при хранении в темном месте при температуре 4 - 6 °С. 8.2.4. Раствор 6енз(а)пирена № 2, концентрация 0,005 мкг/см3. В мерную колбу вместимостью 100 см3 вносят 0,5 см3 раствора бенз(а)пирена № 1 и доводят ацетонитрилом до метки. Используют свежеприготовленный раствор. 8.2.5. Раствор для идентификации бенз(а)пирена, концентрация 0,0005 мкг/см3. В мерную колбу вместимостью 25 см3 вносят 2,5 см3 раствора бенз(а)пирена № 2 и доводят содержимое колбы ацетонитрилом до метки. Используют свежеприготовленный раствор. 8.3. Подготовка хроматографической колонки 8.3.1. Колонку устанавливают в хроматограф и подают элюент со скоростью 1,5 см3/мин до установления равновесия колонки, которое определяют по стабильности нулевой линии детектора. 8.3.2. Проводят холостую разгонку с установлением ступеней градиента: от 0 до 2,5 мин - 60 % ацетонитрила, от 2,5 до 12 мин - повышение до 90 % ацетонитрила, от 12 до 20 мин - повышение до 100 % ацетонитрила, от 20 до 22,5 мин - 100 % ацетонитрила, от 22,5 до 23 мин - снижение до 60 % ацетонитрила, от 23 до 28 мин - 60 % ацетонитрила. 8.4. Установление градуировочной характеристики 8.4.1. Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пика на хроматограмме (единицы оптической плотности, е.о.п.) от массовой концентрации бенз(а)пирена (миг/дм3), устанавливают на градуировочных растворах бенз(а)пирена в ацетонитриле методом абсолютной градуировки. Градуировочную характеристику устанавливают по результатам измерений 6 серий по 5 концентрациям вещества в каждой серии. 8.4.2. Градуировочные растворы готовят в мерных колбах вместимостью 25 см3. В каждую пробирку вносят растворы бенз(а)пирена для градуировки № 1 и 2 в соответствии с табл. 2, доводят до метки ацетонитрилом и перемешивают. Таблица 2 Градуировочные растворы бенз(а)пирена в ацетонитриле
- колонка 4,6×150 мм, заполненная сорбентом Zorbax Eclipse XDB С18; - градиент: 2,5 мин подача подвижной фазы (60 % ацетонитрила и 40 % воды), увеличение ацетонитрила с 60 до 90 % от 2,5 до 12 мин, увеличение ацетонитрила с 90 до 100 % от 12 до 20 мин, подача 100 % ацетонитрила от 20 до 22,5 мин, снижение ацетонитрила до 60 % в течение 0,5 мин, подача 60 % ацетонитрила до уравновешивания колонки (5 мин); - скорость движения элюента 1,5 см3/мин; - температура термостата колонки 28 °С; - флуориметрический детектор: длина волны возбуждения 265 нм; длина волны эмиссии 412 нм; - время удерживания бенз(а)пирена: (12,5 ± 0,05) мин. Градуировочный коэффициент рассчитывают по формуле: где Сi - массовая концентрация бенз(а)пирена в градуировочном растворе, мкг/дм3; Si - среднее значение двух измерений площади пика бенз(а)пирена i-й концентрации, усл. ед.; n - количество градуировочных смесей (n = 5). 8.4.4. Контроль стабильности градуировочной характеристики. Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят 1 раз в квартал в анализируемой серии измерений. Образцами для контроля стабильности являются градуировочные растворы, выбранные таким образом, чтобы массовая концентрация бенз(а)пирена соответствовала нижней, верхней границам и середине диапазона построения градуировочной характеристики. Градуировка признается стабильной при выполнении условия: |X - C| ≤ 0,10 ∙ С, где С - заданная массовая концентрация бенз(а)пирена в градуировочном растворе, мкг/дм3; X - результат измерения массовой концентрации бенз(а)пирена в градуировочном растворе, мкг/дм3. При невыполнении условия стабильности градуировочной характеристики эксперимент повторяют с другим градуировочным раствором. При повторном невыполнении условия стабильности градуировочной характеристики выясняют и устраняют причины нестабильности градуировочной характеристики. 8.5. Отбор проб Отбирают венозную кровь объемом не менее 2 см3 в вакуумную пробирку для забора крови. Срок хранения проб в холодильнике 6 ч. 9. Выполнение измеренийВыполняют два параллельных измерения образца крови. В коническую пробирку с завинчивающейся крышкой вместимостью 15 см3 переносят 1 см3 пробы крови, прибавляют 1 см3 ацетонитрила, интенсивно встряхивают 1 мин, добавляют в качестве высаливателя 0,25 г смеси солей для экстракции из набора VetexQ, встряхивают интенсивно в течение 1 мин. центрифугируют 10 мин со скоростью 2 тыс. об./мин. В пробирку, содержащую 0,1 г смеси для очистки из набора VetexQ (сорбент С18), переносят 0,8 см3 верхнего слоя, встряхивают 1 мин, центрифугируют 10 мин со скоростью 2 тыс. об./мин и отбирают верхний слой. Полученный экстракт фильтруют через капроновый фильтр, используя медицинский шприц «Луер», в стеклянную виалу и анализируют 20 мм на жидкостном хроматографе в условиях, указанных в п. 8.4.3. Идентификацию бенз(а)пирена проводят путем сравнения времен удерживания хроматографических пиков в анализируемой пробе и стандартном растворе. 10. Обработка (вычисление) результатов измерений10.1. Массовую концентрацию бенз(а)пирена в пробах крови (мкг/дм3) вычисляют по формуле: X = Si ∙ К ∙ 1,65, где X - массовая концентрация бенз(а)пирена в анализируемой пробе, мкг/дм3; Si - площадь пика бега(а)пирена на хроматограмме, усл. ед.; К - градуировочный коэффициент; 1,65 - коэффициент, учитывающий степень экстракции бенз(а)пирена из крови, равную 62 %. Рассчитывается как отношение площадей пиков бенз(а)пирена до и после экстракции из крови. 10.2. За результат измерения принимают среднее арифметическое значение двух результатов измерений, полученных в условиях повторяемости X1, Х2 (параллельных определений), для которых выполняется условие: r - предел повторяемости. Значения предела повторяемости приведены в табл. 3. При невыполнении условия (1) получают дополнительно еще два результата измерений. За результат измерений принимают среднее арифметическое четырех результатов измерений, полученных в условиях повторяемости, для которых выполняется условие: CR0,95(4) - критический диапазон. CR0,95(4) = 18 %. При невыполнении условия (2) в качестве окончательного результата измерений принимают медиану четырех результатов измерений, полученных в условиях повторяемости (параллельных определений). Дополнительно выявляют и устраняют причины, приводящие к невыполнению условия (1). Таблица 3 Пределы повторяемости, внутрилабораторной прецизионности, воспроизводимости при вероятности Р = 0,95
10.3. Расхождение между результатами измерений, полученными в двух лабораториях, не должно превышать предел воспроизводимости: где (3) и - результаты измерений массовой концентрации бенз(а)пирена, полученные в разных лабораториях - средние арифметические двух результатов измерений, полученных в условиях повторяемости, для которых выполняется условие (1), мкг/дм3. При выполнении условия (3) приемлемы оба результата измерений, и в качестве окончательного может быть использовано их среднее арифметическое значение. Значения предела воспроизводимости приведены в табл. 3. 11. Оформление результатов измеренийРезультат измерений в документах, предусматривающих его использование, может быть представлен в виде: мкг/дм3, Р = 0,95, где Δ - характеристика погрешности, мкг/дм3, при Р = 0,95, значение Δ рассчитывают по формуле:
Значение δ приведено в табл. 1. 12. Процедуры обеспечения достоверности измеренийОбеспечение достоверности измерений в пределах лаборатории организуют и проводят путем проведения оперативного контроля процедуры измерений и контроля стабильности результатов измерений в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-6 и РМГ 76-2004 ГСИ. Периодичность получения результатов контрольных процедур и формы их регистрации приводят в документах лаборатории, устанавливающих порядок и содержание работ по организации методов контроля стабильности результатов измерений в пределах лаборатории. 12.1. Алгоритм оперативного контроля процедуры измерений с использованием метода добавок Оперативный контроль процедуры измерений с использованием метода добавок проводят путем сравнения результата отдельно взятой контрольной процедуры Кк с нормативом контроля К. Результат контрольной процедуры (Кк, мкг/дм3) рассчитывают по формуле: где - результат измерений массовой концентрации бенз(а)пирена в пробе с известной добавкой - среднее арифметическое двух результатов измерений, полученных в условиях повторяемости, расхождение между которыми удовлетворяет условию (1), мкг/дм3; - результат измерений массовой концентрации бенз(а)пирена в исходной пробе - среднее арифметическое двух результатов измерений, полученных в условиях повторяемости, расхождение между которыми удовлетворяет условию (1), мкг/дм3; Сд - величина введенной добавки, мкг/дм3. Норматив контроля К рассчитывают по формуле: где - значения характеристики погрешности результатов измерений, установленные в лаборатории при реализации методики измерений, соответствующие массовой концентрации бенз(а)пирена в пробе с известной добавкой и в исходной пробе соответственно, мкг/дм3. Примечание. Допустимо характеристику погрешности результатов измерений при внедрении методики измерений в лаборатории устанавливать на основе выражения: Δл = 0,84 ∙ Δ с последующим уточнением по мере накопления информации в процессе контроля стабильности результатов измерений. Процедуру измерений признают удовлетворительной при выполнении условия: Кк ≤ К. (4) При невыполнении условия (4) контрольную процедуру повторяют. При повторном невыполнении условия (4) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению. 12.2. Алгоритм проведения контрольной процедуры при контроле внутрилабораторной прецизионности Контрольные процедуры при контроле промежуточной прецизионности получают с использованием рабочих проб крови. При реализации контрольной процедуры получают два результата контрольных измерений (первичного и повторного ) массовой концентрации бенз(а)пирена в условиях внутрилабораторной прецизионности. Результат контрольной процедуры признают удовлетворительным при выполнении следующего условия: (5) Значение предела внутрилабораторной прецизионности (Rл, %) не превышает 25 %. 13. РазработчикиУланова Т.С., Зайцева Н.В., Карнажицкая Т.Д., Кислицина А.В. (ФБУН «Федеральный научный центр медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения» Роспотребнадзора). Приложение 1
|