Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей
и благополучия человека

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Определение остаточных количеств
флорасулама в кукурузном масле
методом высокоэффективной
жидкостной хроматографии

Методические указания
МУК 4.1.2453-09

1. Разработаны Российским государственным аграрным университетом - МСХА им. К.А. Тимирязева, Учебно-научным консультационным центром «Агроэкология пестицидов и агрохимикатов», Минсельхоза России (В.А. Калинин, профессор, канд. с-х. наук, Е.В. Довгилевич, ст. науч. сотр., канд. биол. наук, А.В. Довгилевич, ст. науч. сотр., канд. хим. наук, Н.В. Устименко, ст. науч. сотр., канд. биол. наук).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 25 декабря 2008 г. № 3).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 2 февраля 2009 г.

4. Введены в действие с 29 апреля 2009 г.

5. Введены впервые.

Содержание

 

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Определение остаточных количеств
флорасулама в кукурузном масле методом
высокоэффективной жидкостной хроматографии

Настоящие методические указания устанавливают метод высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения массовой концентрации флорасулама в диапазоне 0,025 - 0,25 мг/кг в кукурузном масле.

Флорасулам Название действующего вещества по ИЮПАК:

К-(2,6-дифторфенил)-8-фтор-5метокси-1,2,4-триазоло[1,5-с]пиримидин-2-сульфонамид.

Структурная формула:

Агрегатное состояние: порошок.

Цвет, запах: белого цвета.

Давление паров 1×10⁵ Ра (при 25 °С).

Коэффициент распределения октанол-вода: lgK_OW - 1,00, K_OW = 10 (pH 4,0); lgK_OW = -1,22, K_OW = 0,0603 (pH 7,0); lgK_OW = -2,06, K_OW = 0,0087 (pH 10,0).

Температура плавления: 193 - 230 °C (с разложением).

Растворимость в воде: 84 мг/л дм³ (pH 5,0, 20 °С); 6,36 (pH 7,0, 20 °С); 94,2 г/дм³ (pH 9,0, 20 °С); в очищенной воде - 121 мг/дм³.

Растворим в органических растворителях (г/дм³ при 20 °С): ацетон - 123,0, ацетонитрил - 72,1, дихлорметан - 3,75, метанол - 9,81, этилацетат - 15,9, ксилол - 227,0 мг/л, н-гептан - 0,019 мг/дм³, октанол - 184,0 мг/дм³.

Константа диссоциации рКа - 4,54.

Краткая токсикологическая характеристика: флорасулам относится к мало опасным веществам по острой пероральной (ЛД₅₀ для крыс - более 6000 мг/кг) и накожной (ЛД₅₀ для кроликов > 2000 мг/кг) токсичности, но к умеренно опасным веществам (ЛС₅₀ для крыс составляет более 5000 мг/м) по ингаляционной токсичности. Побочные отрицательные эффекты не обнаружены.

Область применения: флорасулам - гербицид системного действия, проникает в растения через корни и листья, но не проникает в зерно, ингибирует ацетолактатсинтазу - ключевой фермент в пути синтеза изолейцина и валина.

Флорасулам вызывает хлороз, обесцвечивание жилок и некроз в течение 2 - 4 недель.

В России применяется в качестве гербицида в посевах кукурузы и зерновых культур с нормой расхода 2,5 - 5,0 г/га по д. в. в смеси с другими гербицидами при однократной обработке в фазу кущения или 3 - 4 листьев кукурузы.

В России гигиенические нормативы не установлены.

1. Метрологическая характеристика метода

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности Р = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительные интервалы среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в табл. 2.

Таблица 1

Метрологические параметры для флорасулама

Таблица 2

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для флорасулама

2. Метод измерений

Метод основан на определении флорасулама с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием ультрафиолетового детектора после его экстракции из образцов органическим растворителем, очистке перераспределением между двумя несмешивающимися фазами, последующего метилирования и очистки метильных производных на концентрирующих патронах, содержащих обращенную фазу С8.

Идентификация веществ проводится по времени удерживания, а количественное определение методом абсолютной калибровки.

В предлагаемых условиях анализа метод специфичен. Специфичность обеспечивается подбором состава подвижной фазы и выбором колонок различной полярности.

3. Средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и материалы

3.1. Средства измерений

Допускается использование средств измерений с аналогичными или лучшими характеристиками.

3.2. Реактивы

Допускается использование реактивов иных производителей с аналогичными или лучшими характеристиками.

3.3. Вспомогательные устройства и материалы

Допускается применение хроматографических колонок и другого оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4. Требования безопасности

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 «Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны». Организация обучения работников безопасности труда по ГОСТ 12.0.004.

5. Требования к квалификации операторов

К выполнению измерений допускают специалистов, имеющих квалификацию не ниже лаборанта-исследователя, с опытом работы на жидкостном хроматографе.

К проведению пробоподготовки допускают оператора с квалификацией «лаборант», имеющего опыт работы в химической лаборатории.

6. Условия измерений

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

• процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 ± 5) °С и относительной влажности не более 80 %.

• выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

7. Подготовка к выполнению определений

Выполнению измерений предшествуют следующие операции: очистка растворителей (при необходимости), приготовление растворов, кондиционирование хроматографической колонки, подготовка концентрирующих патронов Диапак С 8 для очистки экстракта, проверка хроматографического поведения вещества на патронах, построение калибровочной кривой.

7.1. Подготовка органических растворителей

7.1.1. Очистка ацетона. Ацетон перегоняют над небольшим количеством перманганата калия (А. Гордон, Р. Форд Спутник химика. Москва, 1976, с. 438 - 439).

7.1.2. Очистка ацетонитрила. Ацетонитрил перегоняют.

7.1.3. Очистка гексана. Гексан встряхивают с концентрированной серной кислотой, промывают бледно-розовым раствором перманганата калия до тех пор, пока раствор не перестанет обесцвечиваться, затем промывают водой, сушат над безводным хлористым кальцием и перегоняют (А. Гордон, Р. Форд Спутник химика. Москва, 1976, с. 441).

7.1.4. Очистка бидистиллированной воды. Бидистиллят кипятят в течение 6 часов с марганцовокислым калием, добавленным из расчета 1 г/л и затем перегоняют.

7.1.5. Очистка диэтилового эфира. Диэтиловый эфир перегоняют.

7.2. Приготовление растворов для проведения анализа

7.2.1. Приготовление подвижной фазы для ВЭЖХ. Для приготовления подвижной фазы используют свежеперегнанные ацетонитрил и очищенную воду.

В плоскодонную колбу объемом 1 дм³ помещают 450 см³ ацетонитрила и 500 см³ очищенной воды. Смесь тщательно перемешивают, пропускают через нее газообразный гелий со скоростью 20 см/мин в течение 5 мин, после чего помещают в ультразвуковую ванну для удаления растворенных газов на 1 мин.

7.2.2. Приготовление градуировочных растворов.

7.2.2.1. Стандартный раствор с концентрацией флорасулама 1,0 мг/см³. Взвешивают 50 мг флорасулама в мерной колбе объемом 50 см³. Навеску растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки ацетонитрилом.

7.2.2.2. Стандартный раствор с концентрацией флорасулама 10,0 мкг/см. Из стандартного раствора флорасулама с концентрацией 1,0 мг/см отбирают пипеткой 1 см, помещают в мерную колбу объемом 100 см³ и доводят объем до метки ацетонитрилом при перемешивании.

7.2.2.3. Стандартные растворы флорасулама с концентрацией 2,5; 1,0; 0,5 и 0,25 мкг/см³ для внесения в образцы масла. Методом последовательного разведения ацетоном готовят растворы, содержащие по 2,5; 1,0; 0,5 и 0,25 мкг/см³ и используют эти растворы для внесения в образцы масла.

Для хроматографического исследования стандарт подвергают процедурам очистки на концентрирующих патронах и метилированию, чтобы нивелировать потери, возникающие при этих манипуляциях при очистке фортифицированных проб. Эти операции проводят каждый раз при анализе очередной партии образцов.

7.2.2.4. Метилирование стандартов. В круглодонную колбу объемом 100 см³ помещают 1 см³ стандартного раствора флорасулама в ацетонитриле с концентрацией 10,0 мкг/см³. Туда же добавляют последовательно 100 мкл триэтиламина и 100 мкл йодистого метила, помещают смесь в ультразвуковую ванну на 5 с и выдерживают при температуре 22 - 25 °С в течение часа. По истечении этого времени смесь упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе (на стенках колбы образуются белые кристаллы).

К сухому остатку добавляют 10 см³ насыщенного раствора хлористого натрия, тщательно обмывают стенки концентратора и переносят раствор в делительную воронку. Концентратор обмывают 10 см³ диэтилового эфира, переносят его в ту же делительную воронку и интенсивно встряхивают в течение 2 мин. После разделения фаз в воронке верхний слой (диэтиловый эфир) собирают в концентратор, пропуская его через безводный сульфат натрия. Экстракцию диэтиловым эфиром повторяют еще 2 раза, используя по 10 см растворителя. Экстракт объединяют и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.

Сухой остаток подвергают очистке на патроне Диапак С 8, элюат выпаривают досуха, сухой остаток растворяют в 10 см³ ацетонитрила (получают метилированный стандарт с концентрацией 1,0 мкг/см³). Далее методом последовательного разведения ацетонитрилом получают стандартные растворы с концентрацией 0,5; 0,2 и 0,1 мкг/см³.

7.3. Установление градуировочной характеристики

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади (высоты) пика от концентрации метилированного производного флорасулама в растворе (мкг/см³), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4-м растворам для градуировки с концентрацией 1,0; 0,5; 0,2 и ОД мкг/см³.

В инжектор хроматографа вводят по 20 мм каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.2. Осуществляют не менее 3-х параллельных измерений.

7.4. Подготовка концентрирующих Диапак С 8 для очистки экстрактов

7.4.1. Подготовка концентрирующего патрона Диапак С 8 (0,6 г) для очистки экстракта. Все процедуры происходят с использованием вакуума, скорость потока растворов не должна превышать 2 - 2,5 см³/мин.

Патрон Диапак С 8 устанавливают на алонж с отводом для вакуума, сверху в патрон вставляют шприц с разъемом типа Люер объемом не менее 10 см (используют как емкость для элюентов).

Кондиционирование: патрон промывают последовательно 5 см³ смеси ацетонитрил-вода в соотношении 1:1 и 10 см³ очищенной воды. Элюат отбрасывают. Нельзя допускать высыхания поверхности картриджа.

7.4.2. Проверка хроматографического поведения метилированного стандарта флорасулама на концентрирующем патроне Диапак С 8. Из раствора метилированного стандарта флорасулама в ацетонитриле, содержащего 2 мкг/см, отбирают 1 см и помещают в концентратор объемом 100 см³. Добавляют туда же 9 см³ очищенной воды, смесь тщательно перемешивают и полученный раствор вносят на патрон. Патрон промывают 10 см³ смеси ацетонитрил-вода в соотношении 1:5, элюат собирают, упаривают досуха при температуре не выше 30 °С, сухой остаток растворяют в 2 см³ ацетонитрила и хроматографируют. Далее патрон промывают последовательно 4 порциями по 5 см³ смеси ацетонитрил-вода в соотношении 1:1, элюат после внесения каждой порции упаривают досуха при температуре не выше 30 °С, сухой остаток растворяют в 1 см³ ацетонитрила и хроматографируют. Определяют фракции, содержащие метилированный флорасулам и объединяют их.

7.5. Подготовка и кондиционирование колонки для жидкостной хроматографии. Хроматографическую колонку Symmetry Shield RP18 с предколонкой Symmetry C18 устанавливают в термостате хроматографа и стабилизируют при температуре 25 °С и скорости потока подвижной фазы 1 см³/мин 3 - 4 ч.

8. Отбор проб и хранение

Отбор проб производится в соответствии с «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов», № 2051-79 от 21.08.79, а также в соответствии ГОСТ 8808-91 «Масло кукурузное, ТУ»

Пробы масла кукурузы хранят в плотно закрытой стеклянной или полиэтиленовой таре в холодильнике при температуре 0 - 4 °С не более 30 дней.

9. Проведение определений

9.1. Кукурузное масло

9.1.1. Экстракция. Пробу масла весом 10 г помещают в химический стакан объемом 100 см³, прибавляют туда же 20 см³ гексана, тщательно перемешивают и переносят в делительную воронку объемом 250 см³. Химический стакан обмывают последовательно двумя порциями гексана объемом 20 и 10 см³ и смывы переносят в ту же делительную воронку.

Затем в делительную воронку с гексановым раствором масла помещают 30 см³ ацетонитрила и интенсивно встряхивают 2 мин. После полного разделения фаз в делительной воронке нижний ацетонитрильный слой помещают в химический стакан объемом 200 см³, верхний гексановый слой оставляют в делительной воронке. Флорасулам экстрагируют еще тремя порциями ацетонитрила объемом по 30 см³ в тех же условиях. Ацетонитрильный экстракт объединяют в химическом стакане объемом 200 см³.

9.1.2. Очистка экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей. Ацетонитрильный экстракт, полученный по п. 9.1.1, переносят в чистую делительную воронку объемом 250 см³ , туда же прибавляют 50 см³ гексана и интенсивно встряхивают 2 мин. После полного разделения фаз в делительной воронке нижний ацетонитрильный слой собирают через слой безводного сульфата натрия толщиной 1 см в концентратор объемом 250 см³ и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С. Гексан отбрасывают.

9.1.3. Метилирование. Сухой экстракт, полученный по п. 9.1.2, растворяют в 1 см ацетонитрила. Туда же добавляют последовательно 100 мкл триэтиламина и 100 мкл йодистого метила, помещают смесь в ультразвуковую ванну на 5 с и выдерживают при температуре 22 - 25 °С в течение часа. По истечении этого времени смесь упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе (на стенках колбы образуются белые кристаллы).

К сухому остатку добавляют 10 см³ насыщенного раствора хлористого натрия, тщательно обмывают стенки концентратора и переносят раствор в делительную воронку. Концентратор обмывают 10 см³ диэтилового эфира, переносят его в ту же делительную воронку и интенсивно встряхивают в течение 2 мин. После разделения фаз в воронке верхний слой (диэтиловый эфир) собирают в концентратор, пропуская его через безводный сульфат натрия. Экстракцию диэтиловым эфиром повторяют еще 2 раза, используя по 10 см³ растворителя. Экстракт объединяют и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.

___________

* Повторное упаривание и перерастворение образца неприемлемо, так как при этом уменьшается содержание метилированного производного флорасулама в пробе.

9.1.4. Очистка экстракта на концентрирующих патронах Диапак С 8.

Сухой остаток после метилирования растворяют в 1,0 см ацетонитрила, тщательно обмывая стенки концентратора. Затем в концентратор добавляют 9,0 см³ воды, смесь тщательно перемешивают и полученный раствор вносят на патрон Диапак С 8. Патрон промывают 10 см³ смеси ацетонитрил-вода в соотношении 1:5. Элюат отбрасывают. Флорасулам элюируют с картриджа 15 см³ смеси ацетонитрил-вода в соотношении 1:1, элюат выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С. Сухой остаток растворяют в 2,5 см³ ацетонитрила и аликвоту объемом 20 мм³ вводят в хроматограф.

9.2. Условия хроматографирования. Хроматограф «Waters» или другой с аналогичными характеристиками с ультрафиолетовым детектором с изменяемой длиной волны.

Колонка стальная Symmetry Shield RP18, 4,6 мм×25 см, зернением 5 мкм. Предколонка стальная Symmetry С18, 3,9 мм×2 см, зернением 5 мкм. Температура колонки: 25 °С.

Подвижная фаза: ацетонитрил-вода в соотношении 45:50. Длина волны 260 нм.

Время удерживания флорасулама - 12,1 - 12,5 мин. Чувствительность 0,003 ед. оптической плотности на шкалу. Объем вводимой пробы 20 мм³. Линейный диапазон детектирования сохраняется в пределах 2 - 20 нг.

10. Обработка результатов

Для обработки результатов хроматографического анализа используется программное обеспечение химического анализа «Agilent Chemstation».

Альтернативная обработка результатов.

Содержание флорасулама рассчитывают по формуле:

X - содержание флорасулама в пробе, мг/кг;

S_СТ - высота (площадь) пика стандарта, мм;

S_ПР - высота (площадь) пика образца, мм;

А - концентрация стандартного раствора, мкг/см³;

V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, см³;

m - масса анализируемого образца, г (см);

Р - содержание флорасулама в аналитическом стандарте, %.

11. Проверка приемлемости результатов параллельных определений

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

X₁, Х₂ - результаты параллельных определений, мг/кг;

r - значение предела повторяемости (табл. 1), при этом r = 2,8σ_r.

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

12. Оформление результатов

Результат анализа представляют в виде:

 мг/кг при вероятности Р = 0,95, где

 - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

∆ - граница абсолютной погрешности, мг/кг;

δ - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

В случае если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

«содержание вещества в пробе менее 0,025 мг/кг»*

* - 0,025 мг/кг - предел обнаружения.

13. Контроль качества результатов измерений

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1 - 6-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом добавок.

Величина добавки С_д должна удовлетворять условию:

 - характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно) мг/кг, при этом:

∆_л = ±0,84∆, где

∆ - граница абсолютной погрешности, мг/кг;

δ - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, таблица 1), %.

Результат контроля процедуры K_K рассчитывают по формуле:

 - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11), содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце и концентрация добавки, соответственно, мг/кг;

Норматив контроля K рассчитывают по формуле:

Проводят сопоставление результата контроля процедуры (K_K) с нормативом контроля (K).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию:

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости:

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R)

X₁, X₂ - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

14. Разработчики

Калинин В.А., профессор, канд. с-х. наук, Довгилевич Е.В., ст. науч. сотр., канд. биол. наук, Довгилевич А.В., ст. науч. сотр., канд. хим. наук, Устименко Н.В., ст. науч. сотр., канд. биол. наук.

Приложение

Полнота извлечения флорасулама из кукурузного масла (5 повторностей для каждой концентрации, Р = 0,95)