Государственное санитарно-эпидемиологическое
нормирование Российской Федерации

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТАТОЧНЫХ
КОЛИЧЕСТВ ПЕСТИЦИДОВ
В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ,
СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОМ СЫРЬЕ
И ОБЪЕКТАХ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ

Сборник методических указаний

МУК 4.1.1941 - 4.1.1954-05

Москва, 2009

1. Сборник подготовлен Федеральным научным центром гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана (академик РАМН, проф. В.Н. Ракитский, проф. Т.В. Юдина); при участии специалистов Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. Разработчики методов указаны в каждом из них.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

3. Утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации, академиком РАМН Г.Г. Онищенко.

4. Введены впервые.

УТВЕРЖДАЮ

Главный государственный санитарный врач

Российской Федерации,

Руководитель Федеральной службы

по надзору в сфере защиты прав потребителей и

благополучия человека

____________________ Г.Г. Онищенко

«18» января 2005 г.

МУК 4.1.1949-05

Дата введения 18.04.05

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
по определению остаточных количеств имидаклоприда в зеленой массе, зерне и соломе зерновых колосовых культур, зеленой массе, семенах и масле рапса методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

1. ВВОДНАЯ ЧАСТЬ

Фирма - производитель: Байер КропСайенс (Германия)

Торговое название: КОНФИДОР, ГАУЧО

Действующее вещество: имидаклоприд (NTN 33893)

1-(6-хлор-3-пиридилметил)-N-нитроимидазолидин-2-илиденамин (ИЮПАК)

1-[(6-хлор-3-пиридинил) метил]-N-нитро-2-имидазолидинимин (С.А.)

Эмпирическая формула: C₉H₁₀ClN₅O₂

Молекулярная масса: 255,7

Бесцветное кристаллическое вещество со слабым характерным запахом

Температура плавления: 144 °С

Давление паров при 20 °С: 4 ´ 10^-7 мПа

Коэффициент распределения н-октанол/вода: K_ow log P = 0,57

Растворимость (г/л) при 20 °С: вода - 0,61, гексан - менее 0,1 , дихлорметан - 55, изопропанол - 1,2, толуол - 0,68.

Вещество устойчиво к гидролизу при рН 5 - 11 (Т_1/2 более 1 года).

Имидаклоприд относительно слабо передвигается по почвенному профилю и очень быстро разрушается в почве под действием света и микрофлоры. В растениях соединение постепенно метаболизируется.

Краткая токсикологическая характеристика:

Острая пероральная токсичность (LD₅₀) для крыс 450 мг/кг; острая дермальная токсичность (LD₅₀) для крыс - более 5000 мг/кг; острая ингаляционная токсичность (LC₅₀) для крыс - 69 мг/м³ воздуха (аэрозоль). Имидаклоприд не вызывает раздражения слизистой оболочки глаз и кожи у кроликов. LC₅₀ для рыб 211 мг/л (96 час.).

Имидаклоприд практически нетоксичен для птиц, дождевых червей, водорослей, но опасен для пчел при прямом контакте.

Гигиенические нормативы для имидаклоприда в России: ПДК в почве - 0,04 мг/кг; ПДК в воде водоемов - 0,03 мг/дм³; МДУ в картофеле - 0,05, огурцах и томатах - 0,1 мг/кг.

Область применения препарата:

Имидаклоприд - инсектицид нервно-паралитического действия, эффективно уничтожает листовую тлю, белокрылку, минеров, трипсов, колорадского жука, долгоносиков на хлопчатнике, рисе, картофеле, кукурузе, сахарной свекле, овощных культурах, цитрусовых, косточковых и семечковых плодовых в течение вегетационного периода. Вещество обладает системной активностью и может использоваться для обработки почвы и надземных органов растений.

Проходит регистрационные испытания в России и странах СНГ в виде препарата Гаучо КС (600 г имидаклоприда в 1 л препарата), предназначенного для протравливания семян и посадочного материала ряда культур, и препаратов Конфидор, ВРК (200 г/л) и Конфидор, ВДГ (700 г/кг), рекомендованных для обработки вегетирующих растений.

2. МЕТОДИКА ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ИМИДАКЛОПРИДА В ЗЕЛЕНОЙ МАССЕ, ЗЕРНЕ И СОЛОМЕ ЗЕРНОВЫХ КОЛОСОВЫХ КУЛЬТУР, ЗЕЛЕНОЙ МАССЕ, СЕМЕНАХ И МАСЛЕ РАПСА МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

2.1 Основные положения

2.1.1 Принцип метода

Метод основан на определении имидаклоприда с использованием обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с ультрафиолетовым детектором после извлечения вещества из зерна водным ацетоном, из зеленой массы и соломы ацетоном, из семян рапса ацетонитрилом, а из масла водным метанолом, очистки экстрактов перераспределением в системе несмешивающихся растворителей и на колонках с силикагелем или флоризилом.

Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.

2.1.2 Избирательность метода

В предлагаемых условиях метод специфичен в присутствии пестицидов, применяемых при возделывании зерновых колосовых культур и рапса.

2.1.3. Метрологическая характеристика метода

Таблица

Метрологическая характеристика метода

2.2 Реактивы, растворы, материалы

Имидаклоприд с содержанием д.в. 99,6 % (Байер, Германия)

Ацетон, ГОСТ 2603-79

Ацетонитрил, ч., ТУ 6-09-3534-82

Вода бидистиллированная, ГОСТ 7602-72

Гексан, ч., ТУ 6-09-3375-78

Калия перманганат, ГОСТ 20490-75

Кальция хлорид, хч., ГОСТ 4161-77

Калий углекислый, хч., ГОСТ 4221-76

Кислота серная, хч., ГОСТ 4204-77

Натрий двууглекислый, ГОСТ 83-79

Натрия гидроксид, хч., ГОСТ 4328-77

Натрия сульфат безводный, хч., ГОСТ 4166-76

Натрия хлорид, ГОСТ 4233-77

Спирт метиловый, хч., ГОСТ 6995-77

Фосфора пентоксид, ч., МРТУ 6-09-5759-69

Этилацетат, ГОСТ 22300-76

Элюент №1 для колоночной хроматографии: смесь гексан-этилацетат (4:6, по объему)

Элюент №2 для колоночной хроматографии: смесь гексан-этилацетат (2:8, по объему)

Подвижная фаза для ВЭЖХ: смесь ацетонитрил-вода (25:75, по объему)

Силикагель для адсорбционной хроматографии (Вельм, Германия) 1 степени активности или силикагель КСК (60 - 100 меш)

Флоризил (100 - 120 меш) для адсорбционной хроматографии (Вариан Аэрограф, США) 1 степени активности

Вата хлопчатобумажная

Стекловата

Целит 535 (2 - 15 мкм) /Серва, Германия/ или аналогичный

Фильтры бумажные, синяя лента, ТУ 6-09-1678

2.3 Приборы, аппаратура, посуда

Жидкостный хроматограф с ультрафиолетовым детектором фирмы Altex (США) или аналогичный

Хроматографическая колонка стальная, длиной 15 см, внутренним диаметром 4 мм, заполненная Диасорбом 130-C10CN или Диасорбом 130-С16 Т (ЗАО БиоХимМак, РФ; 119899, Москва, Ленинские горы)

Шприц для ввода образцов в жидкостной хроматограф

Весы аналитические типа ВЛР-200, ГОСТ 19401-74

Водоструйный насос, ГОСТ 10696-75

Встряхиватель механический, ТУ 64-1-1081-83

Мельница электрическая лабораторная, ТУ 46-22-236-79 или аналогичная

Ротационный испаритель тип ИР-1М, ТУ 25-11-917-76

Сито с диаметром отверстий 1 мм

Баня водяная, ТУ 46-22-603-75

Воронка Бюхнера, ГОСТ 0147-73

Воронки делительные вместимостью 100, 250 мл, ГОСТ 25336-82

Воронки для фильтрования, стеклянные, ГОСТ 8613-75

Колба Бунзена, ГОСТ 5614-75

Колбы круглодонные на шлифе вместимостью 100 и 250 мл, ГОСТ 9737-70

Колбы конические с притертыми пробками вместимостью 250 мл, ГОСТ 25336-82

Колбы мерные вместимостью 25, 50, 100 и 1000 мл, ГОСТ 1770-74

Колбы грушевидные вместимостью 100 и 250 мл, ГОСТ 25336-82

Пипетки мерные вместимостью 1, 2, 5 и 10 мл, ГОСТ 20292-74Е

Пробирки градуированные с притертыми пробками вместимостью 5 и 10 мл, ГОСТ 10515-75

Цилиндры мерные вместимостью 50, 100, 250 и 500 мл, ГОСТ 1770-74

2.4 Отбор проб

Отбор проб производится в соответствии с «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов» (№ 2051-79 от 21.08.79 г.).

Отобранные пробы зеленой массы зерновых злаков и рапса хранят в стеклянной или полиэтиленовой таре в холодильнике не более одного дня; для длительного хранения пробы растительного материала замораживают и хранят до анализа в морозильной камере при температуре -18 °С. Пробы зерна, семян и соломы высушивают до стандартной влажности и хранят в холодной комнате при температуре 4 °С.

Перед анализом зерно, семена и солому размалывают на мельнице, а зеленую массу измельчают ножницами.

2.5 Подготовка к определению

2.5.1 Подготовка и очистка реактивов и растворителей

Органические растворители перед началом работы очищают, сушат и перегоняют в соответствии с типовыми методиками. Гексан встряхивают с небольшими порциями концентрированной серной кислоты до тех пор, пока свежая порция кислоты не перестанет окрашиваться. Затем гексан последовательно промывают водой, 2 %-ным раствором гидроксида натрия и снова водой, после чего его сушат над гидроксидом натрия и перегоняют.

Ацетон перегоняют над перманганатом калия и поташом (на 1 л ацетона 10 г КМnО₄ и 2 г К₂СО₃).

Ацетонитрил сушат над пентаксидом фосфора и перегоняют; отогнанный растворитель повторно перегоняют над углекислым калием.

Этилацетат промывают равным объемом 5 %-ного раствора двууглекислого натрия, сушат над хлористым кальцием и перегоняют.

2.5.2 Подготовка подвижной фазы для ВЭЖХ

Отмеряют 250 мл ацетонитрила, переносят в колбу на 1000 мл, добавляют 750 мл бидистиллированной воды, перемешивают, фильтруют, дегазируют.

2.5.3 Кондиционирование колонки

Промывают колонку для ВЭЖХ смесью ацетонитрил-вода (25:75, по объему) в течение 30 минут при скорости подачи растворителя 0,6 мл/мин. Включают детектор и ждут стабилизации базовой линии (5 - 15 минут).

2.5.4 Приготовление стандартных растворов

Основной стандартный раствор имидаклоприда с содержанием 100 мкг/мл готовят растворением 0,010 г препарата, содержащего 99,6 % д.в., в ацетонитриле в мерной колбе на 100 мл. Раствор хранят в холодильнике при температуре -12 °С не более месяца.

Рабочие стандартные растворы с концентрациями 0,04, 0,08, 0,20 и 0,40 мкг/мл готовят из основного стандартного раствора имидаклоприда соответствующим последовательным разбавлением подвижной фазой для ВЭЖХ (п. 2.5.2). Рабочие растворы хранят в холодильнике не более трёх дней.

При изучении полноты открывания имидаклоприда в модельных матрицах используются ацетонитрильные растворы вещества.

2.5.5 Построение калибровочного графика

Для построения калибровочного графика в инжектор хроматографа вводят по 50 мкл рабочего стандартного раствора имидаклоприда с концентрациями 0,04, 0,08, 0,20 и 0,40 мкг/мл. Осуществляют не менее 5 параллельных измерений и находят среднее значение высоты хроматографического пика для каждой концентрации. Строят калибровочный график зависимости высоты хроматографического пика в мм от концентрации имидаклоприда в растворе в мкг/мл (рис. 1).

2.5.6 Подготовка колонок с силикагелем и флоризилом для очистки экстракта

В нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см и внутренним диаметром 1,8 см вставляют тампон из стекловаты, закрывают кран и вносят суспензию 5 г сорбента в 10 мл смеси гексан-этилацетат (2:8, по объему). Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента и помещают на него слой безводного сульфата натрия высотой 1 см. Колонки последовательно промывают 40 мл смеси гексан-этилацетат (2:8, по объему) и 30 мл смеси гексан-этилацетат (4:6, по объему) со скоростью 1 - 2 капли в секунду, после чего они готовы к работе.

2.5.7 Проверка хроматографического поведения имидаклоприда на колонках с силикагелем и флоризилом.

В круглодонную колбу емкостью 10 мл отбирают 0,1 мл стандартного раствора имидаклоприда с концентрацией 10 мкг/мл. Отдувают растворитель током теплого воздуха, остаток растворяют в 3 мл элюента №1 (гексан-этилацетат, 4:6) и наносят на колонку. Промывают колонку 50 мл элюента №1, затем 70 мл элюента №2 (гексан-этилацетат, 2:8) со скоростью 1 - 2 капли в секунду. Отбирают фракции по 5 мл каждая, упаривают, остаток растворяют в 2 мл подвижной фазы для ВЭЖХ (п. 2.5.2) и анализируют на содержание имидаклоприда по п. 2.7.

Фракции, содержащие имидаклоприд, объединяют, упаривают досуха, остаток растворяют в 4 мл подвижной фазы для ВЭЖХ и вновь анализируют по п. 2.7. Рассчитывают содержание имидаклоприда в элюате, определяют полноту вымывания вещества из колонки и необходимый для очистки экстракта объем элюента.

ПРИМЕЧАНИЕ: Профиль вымывания имидаклоприда может меняться при использовании новой партии сорбента и растворителей.

2.6 Описание определения

2.6.1 Экстракция имидаклоприда

2.6.1.1 Зеленая масса, солома. К навеске измельченной зеленой массы (25 г) или соломы (5 г) добавляют 125 мл ацетона и суспензию перемешивают в течение 30 минут на аппарате для встряхивания. К суспензии добавляют 2 г целита и фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через бумажный фильтр в колбу емкостью 250 мл. Растительный остаток повторно экстрагируют 30 мл ацетона при встряхивании в течение 30 минут и суспензию фильтруют. Из объединённого ацетонового экстракта отбирают аликвоту раствора, эквивалентную 5 г зеленой массы колосовых культур, 2,5 г зелёной массы рапса или 1 г соломы, добавляют к ней 20 мл воды и дальнейшую очистку экстракта проводят по пп. 2.6.2 - 2.6.4.

2.6.1.2 Зерно. К навеске (10 г) размолотого зерна добавляют 125 мл 75 %-ного водного ацетона и суспензию перемешивают в течение 30 минут на аппарате для встряхивания. К суспензии добавляют 2 г целита и фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через бумажный фильтр в колбу емкостью 250 мл. Растительный остаток повторно экстрагируют 50 мл 75 %-ного водного ацетона при встряхивании в течение 30 минут и суспензию фильтруют. Из объединенного экстракта отбирают аликвоту раствора, эквивалентную 5 г зерна. Дальнейшую очистку экстракта проводят по пп. 2.6.2 и 2.6.3.

2.6.1.3 Семена рапса. К навеске (10 г) размолотых семян добавляют 125 мл ацетонитрила и суспензию перемешивают в течение 30 минут на аппарате для встряхивания. К суспензии добавляют 2 г целита и фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через бумажный фильтр в колбу емкостью 250 мл. Растительный остаток повторно экстрагируют 50 мл ацетонитрила при встряхивании в течение 30 минут и суспензию фильтруют. Из объединенного экстракта отбирают аликвоту раствора, эквивалентную 2,5 г семян, добавляют к ней 20 мл воды и дальнейшую очистку проводят по пп. 2.6.2 и 2.6.4.

2.6.1.4 Масло. Навеску (5 г) масла помещают в коническую колбу емкостью 100 мл, приливают 50 мл 80 %-ного водного раствора метанола и эмульсию энергично перемешивают в течение 30 минут на аппарате для встряхивания. Эмульсию центрифугируют 5 минут при 6000 g и отделяют метанольную фазу. Масло повторно экстрагируют 30 мл 80 %-ного водного раствора метанола и отделяют метанольную фазу центрифугированием. Объединенный метанольный экстракт пропускают через хлопчатобумажную вату и из фильтрата отбирают аликвоту, эквивалентную 2,5 г масла. Дальнейшую очистку экстракта проводят по пп. 2.6.2. и 2.6.4.

2.6.2 Очистка экстракта

Отобранные аликвоты растительных экстрактов (из п. 2.6.1.1 - 2.6.1.4) упаривают до водного остатка (около 10 мл) на роторном вакуумном испарителе при температуре 40 °С. Водный остаток переносят в делительную воронку вместимостью 100 мл, приливают 20 мл насыщенного раствора NaCl, 10 мл гексана и смесь встряхивают в течение 1 минуты. Органический слой отбрасывают. Обработку водной фазы гексаном повторяют еще раз. Затем водную фазу трижды обрабатывают дихлорметаном (30 + 30 + 20 мл) при встряхивании. Объединенный дихлорметановый экстракт промывают в делительной воронке 20 мл 0,05 М раствора К₂СО₃, а затем пропускают через слой безводного сульфата натрия и упаривают досуха на роторном испарителе при температуре 40 °С. Дальнейшую очистку экстрактов растительных образцов колосовых культур проводят по п. 2.6.3.

Для дополнительной очистки растительных образцов рапса полученные сухие остатки зеленой массы, семян и масла растворяют в 30 мл ацетонитрила. Растворы переносят в делительную воронку емкостью 100 мл, приливают 10 мл гексана и смесь встряхивают в течение 1 минуты. Гексан отбрасывают, а ацетонитрильные экстракты упаривают досуха на роторном испарителе при температуре 40 °С. Дальнейшую очистку экстрактов образцов рапса проводят по п. 2.6.4.

2.6.3 Очистка экстрактов зелёной массы, зерна и соломы колосовых культур на колонке с силикагелем

Сухой остаток в колбе, полученный при упаривании очищенных по п. 2.6.2 растительных образцов колосовых культур, количественно переносят тремя 1 мл порциями смеси гексан-этилацетат (4:6, по объему) в подготовленную хроматографическую колонку (п. 2.5.6). Колонку промывают 50 мл элюента № 1, которые отбрасывают. Имидаклоприд элюируют 70 мл элюента № 2 и собирают элюат в грушевидную колбу емкостью 100 мл. Раствор упаривают досуха на роторном испарителе при температуре 40 °С. Сухой остаток растворяют в 2,5 мл подвижной фазы для ВЭЖХ (п. 2.5.2) и анализируют на содержание имидаклоприда по п. 2.7.

2.6.4 Очистка экстрактов зелёной массы, семян и масла рапса на колонке с флоризилом.

Сухой остаток в колбе, полученный при упаривании очищенных по п. 2.6.2 растительных образцов рапса, количественно переносят тремя 1 мл порциями смеси гексан-этилацетат (4:6, по объему) в подготовленную хроматографическую колонку (п. 2.5.6). Колонку промывают 50 мл элюента № 1, которые отбрасывают. Имидаклоприд элюируют 55 мл элюента № 2, отбрасывая первые 10 мл элюата и собирая последующие 45 мл в грушевидную колбу емкостью 100 мл. Раствор упаривают досуха на роторном испарителе при температуре 40 °С. Сухой остаток растворяют в 1,25 мл подвижной фазы для ВЭЖХ (п. 2.5.2) и анализируют на содержание имидаклоприда по п. 2.7.

2.7 Условия хроматографирования

Жидкостный хроматограф с ультрафиолетовым детектором Altex (США)

Колонка стальная длиной 15 см, внутренним диаметром 4 мм, содержащая Диасорб 130-C10 CN (7 мкм)

Температура колонки: комнатная

Подвижная фаза: ацетонитрил-вода (25:75, по объему)

Скорость потока элюента: 0,6 мл/мин

Рабочая длина волны: 268 нм

Чувствительность: 0,02 ед. абсорбции на шкалу

Объем вводимой пробы: 50 мкл

Время выхода имидаклоприда: 5 мин. 36 сек.

Линейный диапазон детектирования: 2 - 20 нг

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор с концентрацией 0,4 мкг/мл, разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ.

Альтернативная неподвижная фаза: Диасорб 130-С16 Т (5 мкм)

Подвижная фаза: метанол-вода (30:50, по объему)

Скорость потока элюента: 0,7 мл/мин

Время выхода имидаклоприда: 5 мин. 20 сек.

2.8 Обработка результатов анализа

Содержание имидаклоприда рассчитывают методом абсолютной калибровки по формуле:

где X - содержание имидаклоприда в пробе, мг/кг;

Н₁ - высота пика образца, мм;

Н₀ - высота пика стандарта, мм;

А - концентрация стандартного раствора имидаклоприда, мкг/мл;

V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, мл;

m - масса анализируемой части образца, г (для зеленой массы и зерна колосовых культур - 5 г, соломы - 1 г; для зелёной массы, семян и масла рапса - 2,5 г).

3. ТРЕБОВАНИЯ ТЕХНИКИ БЕЗОПАСНОСТИ

Необходимо соблюдать общепринятые правила безопасности при работе с органическими растворителями, токсичными веществами, электронагревательными приборами.

4. КОНТРОЛЬ ПОГРЕШНОСТИ ИЗМЕРЕНИЙ

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с рекомендациями МИ 2335-95. ГСИ. «Внутренний контроль качества результатов количественного химического анализа».

5. РАЗРАБОТЧИКИ

Талалакина Т.Н., научн. сотр., Назарова Т.А., научн. сотр., канд. биол. наук; Микитюк О.Д., ст. научн. сотр., канд. биол. наук, Макеев A.M., зав. лабораторией, канд. биол. наук.

ВНИИ фитопатологии, 143050 Московская обл., п/о Большие Вяземы, тел. 592-92-20

Подпись руки Талалакиной Т.Н., Назаровой Т.А., Микитюка О.Д., Макеева A.M. заверяю

Зав. канцелярией ВНИИФ

(Банюлис Г.Г.)

СОДЕРЖАНИЕ