Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав
потребителей 4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ Определение остаточных Сборник
методических указаний 1. Разработаны Московской сельскохозяйственной академией им. К.А. Тимирязева, Учебно-научным консультационным центром «Токсикология пестицидов и агрохимикатов» (Калинин В.А., Калинина Т.С., Рыбакова О.И., Калинин А.В.). 2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по санитарно-гигиеническому нормированию Минздрава России (протокол № 1 от 31 марта 2005 г.). 3. Утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 21 апреля 2005 г. 4. Введены в действие с 1 июля 2005 г. 5. Введены впервые. СОДЕРЖАНИЕ
4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ Определение остаточных
количеств имидаклоприда в Методические указания 1. Вводная частьДействующее вещество: имидаклоприд. Структурная формула:
1-(6-хлор-3-пиридилметил)-N-нитроимидазолидин-2-илиденамин (IUPAC). 1-[(6-хлор-3-пиридинил)метил]-N-нитро-2-имидазолидинимин (СА). Брутто формула: C9H10ClN5O2. Мол. масса: 255,7. Химически чистый имидаклоприд представляет собой бесцветные кристаллы со слабым характерным запахом. Температура плавления 144 °С. Давление паров 4×10-7 мРа (20 °С), 9×10-7 мРа (25 °С). Коэффициент распределения в системе н-октанол-вода Kow logP = 0,57 (21 °С). Растворимость (г/л) при 20 °С: в воде - 0,61; дихлорметане - 55; изопропаноле - 1,2; толуоле - 0,68; н-гексане < 0,1. Стабилен к гидролизу при рН 5 - 11. Острая пероральная токсичность LD50 для крыс - 450 мг/кг. Острая дермальная токсичность LD50 (24 ч) для крыс - более 5000 мг/кг. Не ирритант для глаз и кожи (кролики). Острая ингаляционная токсичность LC50 (4 ч) для крыс - более 5323 мг/м3, 69 мг/м3 воздуха (аэрозоль). LC50 (96 ч) для рыб - 211 (237) мг/л. Группа токсичности по ЕРА и ВОЗ-II. Мутагенной и тератогенной активности в стандартных тестах не обнаружено. Область применения: Имидаклоприд - системный инсектицид и инсекто-протравитель группы неоникотиноидов. Эффективно уничтожает листовую тлю, белокрылку, минеров, трипсов, колорадского жука, долгоносиков на хлопчатнике, рисе, картофеле, кукурузе, сахарной свекле, овощных культурах, цитрусовых, косточковых и семечковых плодовых в течение вегетационного периода. Может использоваться для обработки, как почвы, так и надземных органов растений.
2. Методика определения имидаклоприда в яблоках,
капусте,
|
Объект анализа |
Предел обнаружения, мг/кг |
Диапазон измеряемых концентраций, мг/кг |
Среднее значение определения, % (для каждого объекта n = 24) |
Относительное стандартное отклонение S, % |
Доверительный интервал среднего, n = 24, Р = 0,95 |
Яблоки |
0,01 |
0,01 - 0,1 |
86,6 |
6,1 |
5,6 |
Капуста |
0,01 |
0,01 - 0,1 |
82,9 |
5,7 |
5,0 |
Ботва свеклы |
0,02 |
0,02 - 0,2 |
84,9 |
6,8 |
6,0 |
Корнеплоды свеклы |
0,01 |
0,01 - 0,1 |
88,0 |
5,1 |
4,5 |
Семена кукурузы |
0,01 |
0,01 - 0,1 |
83,9 |
5,9 |
5,2 |
Семена подсолнечника |
0,01 |
0,01 - 0,1 |
84,3 |
6,2 |
5,4 |
Масло подсолнечника |
0,01 |
0,01 - 0,1 |
84,2 |
6,9 |
6,0 |
Присутствие других пестицидов, близких по химическому строению и области применения, определению не мешает.
Ацетон, осч |
ТУ 6-09-3513-86 |
Ацетонитрил для ВЭЖХ, «В-230НМ» или хч |
ТУ 6-09-3534-87 |
Бумажные фильтры «красная лента» |
ТУ 6.091678-86 |
Вода бидистиллированная, деионизированная |
ГОСТ 6709-79 |
Дихлорметан, хч |
ТУ 6-09-3716-80 |
Имидаклоприд, аналитический стандарт с содержанием д.в. 99,9% (Sigma-Aldrich) |
|
Калий углекислый, хч |
|
Калия перманганат |
|
Кальция хлорид, хч |
ГОСТ 4161-77 |
Кислота серная, хч |
|
Натрий двууглекислый |
|
Натрий сернокислый безводный, ч, свежепрокаленный |
|
Натрия гидроксид, хч |
|
н-Гексан, хч, свежеперегнанный |
ТУ 2631-003-05807999-98 |
Подвижная фаза для ВЭЖХ: смесь ацетонитрил-вода (20:80, по объему) |
|
Силикагель для колоночной хроматографии 60 (0,040 - 0,063 mm) (Merck, Германия) |
|
Стекловата |
|
Фосфора пентоксид, ч |
МРТУ 6-09-5759-69 |
Элюент № 1 для колоночной хроматографии: смесь гексан-этилацетат (50:50, по объему) |
|
Элюент № 2 для колоночной хроматографии: смесь гексан-этилацетат (10:90, по объему) |
|
Этиловый эфир уксусной кислоты, чда |
Жидкостный хроматограф «Альянс» фирмы «Waters» с УФ детектором (Waters 2487) с дегазатором и автоматическим пробоотборником или аналогичный |
|
Колонка Symmetry С-18, (250×4,6) мм, 5 мкм (Waters) |
|
Предколонка Waters Symmetry С-18 |
|
Весы аналитические ВЛА-200 или аналогичные |
ГОСТ 34104-80Е |
Гомогенизатор |
МРТУ 42-1505-63 |
Установка ультразвуковая «Серьга» |
ТУ 3.836.008 |
Мельница лабораторная зерновая ЛМЗ |
ТУ 1-01-0593-79 |
Ротационный испаритель вакуумный ИР-1М или аналогичный |
ТУ 25-11-917-74 |
Бидистиллятор |
|
рН-метр универсальный ЭВ-74 |
ГОСТ 22261-76 |
Насос водоструйный |
МРТУ 42 861-64 |
Колбы плоскодонные на шлифах КШ500 29/32 ТС |
ГОСТ 10384-72 |
Колбы круглодонные на шлифах КШ10 и КШ250 29-32 ТС |
ГОСТ 10384-72 |
Воронки лабораторные В-75-110 |
|
Воронки делительные ВД-3-500 |
ГОСТ 8613-75 |
Цилиндры мерные, вместимостью 50, 100, 500 и 1000 см3 |
|
Колбы мерные, вместимостью 25, 50, 100 и 1000 см3 |
|
Пипетки мерные, вместимостью 1, 2, 5, 10 см3 |
|
Колонки стеклянные (25×1) см |
|
Отбор проб производится в соответствии с действующим ГОСТом. Пробы семян для определения остатков в урожае хранят в бумажной или тканевой упаковке при комнатной температуре. Пробы ботвы и корнеплодов свеклы, капусты и яблок хранят до анализа в морозильной камере при температуре не выше -18 °С в течение месяца. Перед анализом их гомогенизируют.
Перед началом работы рекомендуется проверить чистоту применяемых органических растворителей. Для этого 100 мл растворителя упаривают в ротационном вакуумном испарителе при температуре 40 °С до объема 1,0 мл и хроматографируют. При обнаружении мешающих определению примесей очистку растворителей производят в соответствии с общепринятыми методиками. Гексан и хлористый метилен встряхивают с небольшими порциями концентрированной серной кислоты до прекращения окрашивания свежей порции кислоты, затем промывают водой, 2 %-м раствором гидроксида натрия и снова водой, после чего его сушат над гидроксидом натрия и перегоняют. Ацетон перегоняют над перманганатом калия и поташом (на 1 л ацетона 10 г KMnO4 и 2 г K2CO3). Ацетонитрил сушат над пентоксидом фосфора и перегоняют; отогнанный растворитель повторно перегоняют над углекислым калием. Этилацетат промывают равным объемом 5 %-го раствора двууглекислого натрия, сушат над хлористым кальцием и перегоняют.
Перед началом анализа колонку (Symmetry С-18) кондиционируют в потоке подвижной фазы (1 мл/мин) до стабилизации нулевой линии в течение 1 - 2 ч.
Для получения 50 %-го водного ацетона в колбе емкостью 1 л смешивают 500 мл ацетона с 500 мл дистиллированной воды, используя мерные цилиндры.
Для получения 75 %-го водного ацетона в колбе емкостью 1 л смешивают 750 мл ацетона и 250 мл дистиллированной воды, используя мерные цилиндры.
Для приготовления 1М раствора NaOH 40 г едкого натра помещают в мерную колбу емкостью 1000 см3, растворяют при перемешивании в 600 см3 дистиллированной воды и доводят объем раствора до метки.
Для приготовления 0,02М раствора NaOH 20мл 1М раствора едкого натра помещают в мерную колбу емкостью 1000 см3 и доводят объем раствора до метки дистиллированной водой.
Для приготовления подвижной фазы смешивают ацетонитрил с водой в соотношении 20:80 по объему, используя мерные цилиндры.
Для приготовления элюента № 1 в колбе на 1 000 мл смешивают 500 мл н-гексана и 500 мл этилацетата. Для приготовления элюента № 2 в колбе на 1 000 мл смешивают 100 мл н-гексана и 900 мл этилацетата.
Приготовление стандартного и градуировочных растворов
Стандартный раствор с концентрацией 0,5 мг/мл. Берут точную навеску имидаклоприда (50 мг), переносят в мерную колбу на 100 мл, растворяют навеску в ацетонитриле и доводят до метки. Градуировочные растворы с концентрациями 0,1; 0,2; 0,5; 1,0 и 2,0 мкг/мл готовят методом последовательного разбавления по объему, используя раствор подвижной фазы (смесь ацетонитрил-вода (20:80, по объему).
Стандартный раствор можно хранить в холодильнике при температуре 0 - 4 °С в течение 1 месяца, градуировочные растворы - в течение суток.
При изучении полноты определения имидаклоприда используют ацетонитрильные растворы вещества. Для внесения в капусту, яблоки, ботву и корнеплоды свеклы, семена кукурузы и подсолнечника растворы с концентрациями 0,1 и 1,0 мкг/мл готовят из стандартного раствора с концентрацией 0,5 мг/мл методом последовательного разбавления по объему ацетонитрилом. Растворы для внесения в масло готовят из стандартного раствора с концентрацией 0,5 мг/мл методом последовательного разбавления по объему изопропиловым спиртом.
Для построения градуировочного графика (площадь пика - концентрация имидаклоприда в растворе) в хроматограф вводят по 20 мкл градуировочных растворов (не менее 3 параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4 точек по диапазону измеряемых концентраций), измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации имидаклоприда в градуировочном растворе (мкг/мл).
В нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см и внутренним диаметром 1 см помещают тампон из стекловаты, закрывают кран и вносят суспензию 5 г силикагеля в 30 мл смеси гексан-этилацетат (50:50, по объему). Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента. Колонку последовательно промывают 30 мл элюента № 2 и 30 мл элюента № 1 со скоростью 1 - 2 капли в с, после чего она готова к работе.
В круглодонную колбу емкостью 10 мл отбирают 0,1 мл стандартного раствора имидаклоприда с концентрацией 10 мкг/мл. Отдувают растворитель током теплого воздуха (температура не выше 40 °С), остаток растворяют в 5 мл элюента № 1 и наносят на колонку. Колбу обмывают еще 5 мл элюента № 1 и также вносят на колонку. Промывают колонку 120 мл элюента № 1, которые отбрасывают, затем 100 мл элюента № 2 со скоростью 1 - 2 капли в секунду. Отбирают фракции по 10 мл каждая, упаривают, остаток растворяют в 2 мл подвижной фазы для ВЭЖХ (п. 2.5.3) и анализируют на содержание имидаклоприда по п. 2.6.7.
Фракции, содержащие имидаклоприд, объединяют, упаривают досуха, остаток растворяют в 2 мл подвижной фазы для ВЭЖХ и вновь анализируют по п. 2.6.7. Рассчитывают содержание имидаклоприда в элюате, определяя полноту вымывания вещества из колонки и необходимый для этого объем элюента.
Примечание: параметры удерживания имидаклоприда и сопутствующих экстрактивных веществ могут меняться при использовании новой партии сорбента и растворителей.
Установка и подготовка всех приборов и средств измерения проводится в соответствии с требованиями стандартов и технической документации.
Навеску гомогенизированных яблок, капусты или корнеплодов свеклы, массой 20 г помещают в коническую колбу емкостью 250 мл, приливают 100 мл смеси ацетон-вода (3:1, по объему) и экстрагируют в течение 15 мин на ультразвуковой ванне. Суспензию фильтруют на стеклянной воронке через бумажный фильтр «красная лента». Осадок с фильтра количественно переносят назад в колбу и экстракцию повторяют с 50 мл 75 %-го водного ацетона. Объединенные экстракты упаривают до водного остатка (45 - 50 мл) на роторном испарителе при температуре не выше 40 °С. Объем экстракта доводят до 100 мл дистиллированной водой. Дальнейшую очистку экстракта проводят по пункту 2.6.5.
Навеску гомогенизированной ботвы свеклы, массой 20 г помещают в коническую колбу емкостью 250 мл, приливают 100 мл смеси ацетон-вода (1:1, по объему) и экстрагируют в течение 15 мин на ультразвуковой ванне. Суспензию фильтруют на стеклянной воронке через бумажный фильтр «красная лента». Осадок с фильтра количественно переносят назад в колбу и экстракцию повторяют с 50 мл 50 %-го водного ацетона. Из объединенного экстракта отбирают аликвоту, соответствующую 10 г ботвы. Экстракт упаривают до водного остатка (40 - 45 мл) на роторном испарителе при температуре не выше 40 °С. Объем экстракта доводят до 100 мл дистиллированной водой. Дальнейшую очистку экстракта проводят по пункту 2.6.5.
Навеску размолотых на лабораторной мельнице семян кукурузы и подсолнечника (20 г) помещают в коническую колбу емкостью 250 мл, приливают 75 мл ацетонитрила и экстрагируют в течение 15 мин на ультразвуковой ванне. Суспензию фильтруют на стеклянной воронке через бумажный фильтр «красная лента». Осадок с фильтра количественно переносят назад в колбу и экстракцию повторяют с 75 мл ацетонитрила. Объединенные экстракты помещают в делительную воронку объемом 250 мл и промывают трижды гексаном порциями по 30 мл, встряхивая смесь каждый раз в течение 2 - 3 мин и отбрасывая верхний гексановый слой. Экстракт упаривают досуха на роторном испарителе при температуре не выше 40 °С. Сухой остаток растворяют в 50 мл ацетона, выдерживая в течение 5 мин на ультразвуковой ванне. К экстракту добавляют 50 мл дистиллированной воды. Экстракт упаривают до водного остатка (45 - 50 мл) на роторном испарителе при температуре не выше 40 °С. Объем экстракта доводят до 100 мл дистиллированной водой, фильтруют через фильтр «красная лента». Дальнейшую очистку экстракта проводят по пункту 2.6.5.
Навеску масла массой 20 г растворяют в 100 мл гексана, помещают в делительную воронку емкостью 250 мл и экстрагируют имидаклоприд трижды дистиллированной водой порциями по 30 мл, встряхивая смесь каждый раз в течение 2 - 3 мин и собирая нижний водный слой. Объем экстракта доводят до 100 мл дистиллированной водой, фильтруют через фильтр «красная лента». Дальнейшую очистку экстракта проводят по пункту 2.6.5.
Полученные по п.п. 2.6.1 - 2.6.4 водные экстракты промывают в делительной воронке емкостью 250 мл трижды гексаном порциями по 30 мл (верхний органический слой отбрасывают), встряхивая делительную воронку каждый раз в течение 1 - 2 мин. Водную фазу экстрагируют трижды хлористым метиленом порциями по 30 мл, встряхивая делительную воронку каждый раз в течение 2 - 3 мин и собирая нижний органический слой*. Объединенный метиленхлоридный раствор промывают в делительной воронке дважды 0,02М раствором NaOH порциями по 30 мл, пропускают через слой безводного сульфата натрия (2 г), осушитель промывают 10 - 15 мл хлористого метилена. После этого экстракт выпаривают досуха на ротационном испарителе при температуре не выше 40 °С. Дальнейшую очистку экстракта проводят по пункту 2.6.6**.
Внимание! Отделение водного слоя следует производить только после полного расслоения жидкостей в делительной воронке.
______________
* В случае образования сравнительно стойких эмульсий для сокращения времени расслоения можно добавить в делительную воронку: на стадии промывки экстрактов гексаном - небольшое количество (до 5 мл) этилового спирта, а на стадии переэкстракции - насыщенный раствор хлорида натрия (15 - 20 мл)
** В случаях, когда очистка экстрактов контрольных проб (п. 2.6.4) дает удовлетворительные результаты дополнительную очистку на колонке с силикагелем можно исключить.
Сухой остаток в колбе, полученный при упаривании очищенных по п. 2.6.5 экстрактов растительных материалов, количественно переносят двумя 5-мл порциями смеси гексан-этилацетат (50:50, по объему) в кондиционированную хроматографическую колонку (п. 2.5.5). Промывают колонку 120 мл элюента № 1. Элюат отбрасывают. Имидаклоприд элюируют 70 мл элюента № 2, собирая элюат в грушевидную колбу емкостью 250 мл. Раствор выпаривают досуха на вакуумном ротационном испарителе при температуре не выше 40 °С. Сухой остаток растворяют в 2 мл подвижной фазы для ВЭЖХ и 20 мкл раствора вводят в жидкостный хроматограф.
Жидкостный хроматограф «Альянс» фирмы Waters с УФ детектором (Waters 2487) или другой с аналогичными характеристиками.
Рабочая длина волны 268 нм.
Предколонка Waters Symmetry С-18 для защиты аналитической колонки.
Колонка Symmetry C-18 (250×4,6) мм, 5 мкм (Waters, USA).
Подвижная фаза: ацетонитрил-вода в соотношении 20:80. Скорость потока 1 мл/мин. Время удерживания имидаклоприда 11,9 ± 0,2 мин.
Объем вводимой пробы 20 мкл.
Линейный диапазон детектирования 0,1 - 2,0 мкг/мл.
Количественное определение проводят методом абсолютной градуировки, содержание имидаклоприда в образцах растительных материалов (X, мг/кг) вычисляют по формуле:
|
S1 - площадь пика имидаклоприда в стандартном растворе, мм2;
S2 - площадь пика имидаклоприда в анализируемой пробе, мм2;
V - объем пробы, подготовленной для хроматографического анализа, мл;
Р - навеска анализируемого образца, г;
С - концентрация стандартного раствора имидаклоприда, мкг/мл;
R - коэффициент извлечения имидаклоприда.
Содержание остаточных количеств имидаклоприда в анализируемом образце вычисляют как среднее из 2 параллельных определений.
Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор имидаклоприда 2 мкг/мл, разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ.
При проведении работы необходимо соблюдать общепринятые правила безопасности при работе в химических лабораториях, а также инструкции по эксплуатации жидкостного хроматографа и других используемых приборов.
Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости результатов измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ ИСО 5725-1 - 6.2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».
Цибульская И.А., Юзихин О.С., Привезенцев В.В. (ВНИИ защиты растений, Санкт-Петербург).