УТВЕРЖДАЮ

Главный государственный санитарный

врач Российской Федерации,

Первый заместитель Министра

здравоохранения Российской Федерации

Г.Г. Онищенко

29 июня 2003 г.

Дата введения: с момента утверждения

 

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Фотометрическое измерение
массовых концентраций b-галактозидазы
в воздухе рабочей зоны

Методические указания

 

МУК 4.1.1619-03

 

 

 

1. Область применения

Настоящие методические указания устанавливают количественный фотометрический анализ воздуха рабочей зоны на содержание b-галактозидазы в диапазоне массовых концентраций 2,0 - 20,0 мг/м³.

2. Характеристика вещества

b-галактозидаза представляет собой фермент, получаемый при глубинном культивировании продуцента b-галактозидазы - Penicillium canescens F-178. Обладает специфической b-галактозидазной активностью, которая характеризуется способностью фермента расщеплять b-галактозидазные связи с образованием галактозы.

Препарат предназначен для гидролиза лактозы молока и молочной сыворотки в молочной и хлебопекарной промышленности.

2.1. Физико-химические свойства.

b-галактозидаза - порошок светло-бежевого цвета, хорошо растворимый в воде.

Молекулярная масса - 120 кД.

Ферментативная активность - 5000 Ед/г.

Агрегатное состояние в воздухе - аэрозоль.

2.2. Токсикологическая характеристика.

b-галактозидаза является малотоксичным веществом при поступлении в организм через желудочно-кишечный тракт, обладает слабым раздражающим действием на слизистые оболочки глаз.

Предельно допустимая концентрация (ПДК) b-галактозидазы в воздухе рабочей зоны 4,0 мг/м³. Класс опасности - III, «А».

3. Погрешность измерений

Методика обеспечивает выполнение измерений массовых концентраций b-галактозидазы с погрешностью, не превышающей ± 22 %, при доверительной вероятности 0,95.

4. Метод измерений

Измерение массовой концентрации b-галактозидазы выполняется методом фотометрии.

Метод основан на определении концентрации орто-нитрофенола, образующегося при действии фермента b-галактозидазы на орто-нитрофенил-b-D-галактопиранозид (НФГ). Измерение концентрации орто-нитрофенола проводят при длине волны 440 нм.

За единицу активности b-галактозидазы принимают такое количество фермента, которое за 1 мин гидролизует 1 мкмоль НФГ в стандартных условиях (30 °С, рН 4,2).

Отбор проб проводят с концентрированием на фильтр.

Нижний предел измерения содержания b-галактозидазы в анализируемой пробе (1,0 см³) - 10,0 мкг.

Нижний предел измерения концентрации b-галактозидазы в воздухе при отборе 50 дм³ - 2,0 мг/м³.

Определению b-галактозидазы не мешает наличие в воздухе инвертазы и ксиланазы.

5. Средства измерений, вспомогательные устройства, материалы, реактивы

5.1. Средства измерений, вспомогательные устройства, материалы

Колориметр фотоэлектрический КФК-2; длина волны 440 нм, погрешность 0,01D	ТУ 3-3.1766-82
Фотометрическая кювета с толщиной оптического слоя 30 мм
Весы лабораторные аналитические ВЛА-200, ± 0,2 мг	ГОСТ 24104-88Е
Весы лабораторные общего назначения не ниже 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г	ГОСТ 24104-88
Ультратермостат, (30,0 ± 0,2) °С	ГОСТ 20790-75
рН-Метр-милливольтметр лабораторный рН-121 (0 - 14 ± 0,1) ед. рН	ТУ 25.05.1689-74
Термометр стеклянный ртутный группы 2	ГОСТ 13646-68
Холодильник бытовой, 4 - 6 °С	ГОСТ 16317-76
Секундомер	ТУ 25-1819.002-90
Бюксы (для взвешивания веществ), СВ 19/9 или СВ 24/10	ГОСТ 25336-82Е
Бюксы (для экстракции b-галактозидазы), СВ 30/45	ГОСТ 7148-70
Стаканы В-1-50С, В-1-100ТС, В-1-250ТС, В-1-500ТС	ГОСТ 25336-82Е
Цилиндры мерные 25-72-06-В-3-7, 100 см3	ГОСТ 1770-74
Колбы мерные 1-го или 2-го исполнения, 25, 50, 100 и 1000 см3	ГОСТ 1770-74Е
Пробирки П-2-16-150 ХС	ГОСТ 25336-82
Пипетки измерительные 1, 2, 5, 10 см3	ГОСТ 29227-91
Аспиратор для отбора проб воздуха модели 822, расход воздуха до 20 дм3/мин	ТУ 64-1-862-82
Фильтродержатель	ТУ 96-72-05-77
Фильтры АФА-ВП-10	ТУ 95-743-80

5.2. Реактивы

b-галактозидаза, активность 5000 ЕД/г, содержание основного вещества не менее 95 %	ТУ 7384-034-19627570-00
Орто-нитрофенил-b-D-галактопиранозид, фирма Sigma (США), САS 369-07-3
Натрий углекислый, чда	ГОСТ 83-79
Натрий уксусно-кислый 3-водный, чда	ГОСТ 199-78
Уксусная кислота (ледяная), хч	ГОСТ 61-75
Дистиллированная вода	ГОСТ 6709-72

Допускается применение иных средств измерения, вспомогательных устройств, реактивов и материалов, обеспечивающих показатели точности, установленные для данной МВИ.

6. Требования безопасности

6.1. При работе с реактивами соблюдают требования безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами по ГОСТ 12.1.005-88.

6.2. При проведении анализов горючих и вредных веществ должны соблюдаться меры противопожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-76.

6.3. При выполнении измерений с использованием фотоэлектроколориметра соблюдают правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкцией по эксплуатации прибора.

Работа на фотоэлектроколориметре должна проводиться в чистом помещении, свободном от пыли, паров кислот и щелочей. Вблизи фотоэлектроколориметра не должны располагаться громоздкие изделия, создающие неудобства в работе оператора (ГОСТ 15150-69).

7. Требования к квалификации операторов

К выполнению измерений и обработке их результатов допускаются лица с высшим и средним специальным образованием, имеющие навыки работы на фотоэлектроколориметре.

8. Условия измерений

8.1. Приготовление растворов и подготовку проб к анализу проводят в нормальных условиях при температуре воздуха (20 ± 5) °С, атмосферном давлении 84 - 106 кПа и влажности воздуха не более 80 %.

8.2. Измерения на фотоэлектроколориметре проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

9. Подготовка к выполнению измерений

9.1. Приготовление растворов

9.1.1. Приготовление стандартного раствора b-галактозидазы, 1 г/дм³

Количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 см³ 0,1 г b-галактозидазы, объем доводят до метки дистиллированной водой и тщательно перемешивают.

Раствор готовят в день проведения анализа.

9.1.2. Приготовление раствора НФГ (субстрат), 0,01 моль/дм³

Навеску НФГ 0,075 г количественно переносят в мерную колбу вместимостью 25 см³, доводят до метки дистиллированной водой и тщательно перемешивают.

Раствор может храниться в холодильнике в течение 3-х суток. Пожелтевший раствор к употреблению непригоден.

9.1.3. Приготовление раствора натрия углекислого, 1 моль/дм³

В мерную колбу вместимостью 1000 см³ вносят 106 г натрия углекислого, доводят до метки дистиллированной водой и тщательно перемешивают.

Раствор может храниться до 6 месяцев в холодильнике.

9.1.4. Приготовление раствора кислоты уксусной, 0,2 моль/дм³

В мерную колбу вместимостью 1 дм³ вносят 11,6 см³ уксусной кислоты. Доводят до метки дистиллированной водой. Раствор тщательно перемешивают.

Раствор может храниться до года в посуде с притёртой пробкой.

9.1.5. Приготовление раствора натрия уксусно-кислого, 0,2 моль/л

В мерную колбу вместимостью 1 дм³ вносят 27,2 г натрия уксуснокислого. Доводят до метки дистиллированной водой. Раствор тщательно перемешивают.

Раствор может храниться до 2-х месяцев в холодильнике.

9.1.6. Приготовление ацетатного буфера, 0,2 моль/дм³, рН 4.2

Смешивают 73,5 см³ раствора уксусной кислоты концентрацией (0,2 моль/дм³) с 26,5 см³ раствора уксусно-кислого натрия (0,2 моль/дм³), тщательно перемешивают. Водородный показатель проверяют на рН-метре.

Раствор можно хранить при комнатной температуре в течение 15 суток.

9.2. Подготовка прибора

Подготовку фотоэлектроколориметра проводят в соответствии с руководством по его эксплуатации.

9.3. Установление градуировочной характеристики

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость величины оптической плотности от массы анализируемого вещества в пробе, взятой для анализа, устанавливают при помощи градуировочных растворов b-галактозидазы в соответствии с табл. 1.

Таблица 1

Приготовление растворов для определения градуировочной характеристики b-галактозидазы

Градуировочные растворы готовятся непосредственно перед измерениями. Хранить не более 6 ч в бытовом холодильнике.

В пробирки наливают по 3,5 см³ ацетатного буфера и 0,5 см³ раствора НФГ (субстратный раствор), прогревают в ультратермостате при 30 °С 10 мин. Затем в пробирки вносят по 1 см³ градуировочных растворов, перемешивают и включают секундомер. Пробирки выдерживают в ультратермостате 10 мин, после чего из них отбирают по 1 см³ в ранее приготовленные пробирки, содержащие по 1 см³ 1-молярного раствора углекислого натрия.

Холостую пробу получают путём последовательного добавления в пробирку 3,5 см³ ацетатного буфера, 0,5 см³ раствора НФГ (субстратный раствор) и 1 см³ дистиллированной воды. Пробирки выдерживают в ультратермостате 10 мин. Далее отбирают 1 см³ в подготовленную пробирку, содержащую 1 см³ 1-молярного раствора углекислого натрия.

Во все пробирки добавляют по 8 см³ дистиллированной воды. В результате общий объем жидкости в каждой пробирке составляет 10 см³.

Холостая проба практически бесцветна. Растворы, содержащие b-галактозидазу, имеют желтую окраску, интенсивность которой тем сильнее, чем выше концентрация определяемого вещества.

Измеряют оптическую плотность растворов в кюветах с толщиной оптического слоя 30 мм при длине волны 440 нм по отношению к холостой пробе, не содержащей определяемого вещества (раствор № 1 по таблице).

Строят градуировочный график зависимости значения оптической плотности (при длине волны 440 нм, в кюветах толщиной оптического слоя 30 мм) от концентрации b-галактозидазы.

Рабочая зона оптического поглощения для градуировочного графика лежит в пределах 0,1 - 1,1.

Для построения каждой точки градуировочного графика вычисляют среднее арифметическое значение оптической плотности из пяти параллельных измерений.

Проверку градуировочного графика проводят 1 раз в 3 месяца или в случае смены партии реактивов, оборудования или приборов.

9.4. Отбор проб воздуха

Воздух с объемным расходом 10 дм³/мин аспирируют в течение 5 мин через фильтр АФА-ВП-10, помещенный в фильтродержатель. Для определения ¹/₂ ПДК b-галактозидазы следует отобрать 50 дм³ воздуха.

Отобранные пробы хранятся в условиях сухого помещения в закрытом сосуде при комнатной температуре до 5 суток.

10. Выполнение измерения

10.1. Экстракция b-галактозидазы с фильтра

Фильтр с отобранной пробой переносят в бюкс, приливают в него 5 см³ дистиллированной воды и оставляют на 10 мин, периодически помешивая стеклянной палочкой для лучшего растворения вещества. Полученный раствор отливают в пробирку, а экстракцию продолжают, добавив в стаканчик с фильтром 5 см³ раствора дистиллированной воды. Затем фильтр тщательно отжимают и удаляют. Растворы сливают в одну пробирку. Таким образом получают 10 см³ элюата b-галактозидазы.

Степень десорбции b-галактозидазы с фильтра (К_д) равняется 97 %.

10.2. Проведение анализа

Анализ 1,0 см³ элюата на содержание b-галактозидазы проводят точно так же, как при построении градуировочной характеристики.

Оптическую плотность анализируемого раствора измеряют аналогично градуировочным растворам по сравнению с холостым, который готовят одновременно и аналогично пробам, используя чистый фильтр.

По градуировочному графику находят количество b-галактозидазы в объеме пробы, взятой для анализа, соответствующее полученным значениям оптических плотностей.

Если значения оптических плотностей находятся за пределами рабочей зоны градуировочного графика, то опыт необходимо повторить с раствором, имеющим большее или меньшее содержание b-галактозидазы.

11. Расчет концентрации вещества в воздухе

Массовую концентрацию b-галактозидазы в воздухе (С, мг/м³) вычисляют по формуле:

 (мг/м³), где

а - содержание b-галактозидазы, найденное в анализируемом объеме раствора по градуировочному графику, мкг;

б - объем пробы, взятой для анализа, см³;

в - общий объем пробы, см³;

V - объем воздуха, отобранного для анализа и приведенного к стандартным условиям, дм³ (см. прилож. 1).

12. Оформление результатов анализа

Результат количественного анализа представляют в виде (С ± С · D/100) мг/м³, Р = 0,95, где D - характеристика погрешности, выраженная в процентах.

13. Контроль погрешности методики

Значения полученных метрологических характеристик погрешности, норматива оперативного контроля точности и норматива оперативного контроля воспроизводимости приведены в табл. 2.

Таблица 2

Результаты метрологической аттестации фотометрической методики

13.1. Оперативный контроль воспроизводимости

Оперативный контроль воспроизводимости выполняют в одной серии с анализом рабочих проб. Отбирают реальные пробы воздуха рабочей зоны из одного традиционного места отбора двумя пробоотборниками одновременно. Анализируют в соответствии с прописью методики, максимально варьируя условия проведения анализа: партии реактивов, набора мерной посуды и т.д., и получают два результата С₁ и С₂ анализов. Результаты анализа не должны отличаться друг от друга на величину, большую, чем норматив оперативного контроля воспроизводимости D (%):

При превышении расхождения между двумя результатами норматива оперативного контроля воспроизводимости эксперимент повторяют. При повторном превышении указанного норматива выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и устраняют их.

13.2. Оперативный контроль точности

Внутренний оперативный контроль точности проводят для каждого интервала определяемых концентраций. Единичные контрольные измерения выполняют в одной серии с КХА рабочих проб за период, в течение которого условия проведения КХА допустимо считать постоянными. Число контрольных измерений зависит от установленных планов статистического контроля точности.

Образцами для оперативного контроля точности являются стандартные образцы с известным содержанием измеряемого вещества, величина которого должна быть близкой к анализируемым пробам.

При контроле качества результатов КХА состава воздушных сред при отсутствии в лаборатории промышленных смесей или невозможности их создания, в качестве образца для контроля используют стандартный образец, нанесенный на фильтр или другое устройство, на которое концентрируют исследуемые вещества. При этом следует иметь в виду, что погрешность процедуры отбора проб контролируется путем поверки используемых пробоотборников, и расчет норматива контроля точности осуществляют, исходя из характеристики погрешности методики КХА за вычетом характеристики погрешности используемого пробоотборника и характеристики погрешности, связанной с неполным извлечением анализируемых компонентов.

Решение об удовлетворительной погрешности принимают при выполнении условия:

С_оа - содержание (концентрация) анализируемого вещества в образце для анализа (по приготовлению), мг/м³;

Х - измеренное содержание (концентрация) вещества, мг/м³;

K - величина характеристики оперативного контроля точности, %.

14. Нормы затрат времени на анализ

Для проведения анализа требуется 2,5 ч.

Методические указания разработаны Российским государственным медицинским университетом (А.В. Лиманцев).

Приложение 1

Приведение объема воздуха к стандартным условиям

Приведение объема воздуха к стандартным условиям (температура 20 °С и давление 101,33 кПа) проводят по формуле:

, где

V_t - объем воздуха, отобранного для анализа, дм³;

Р - барометрическое давление, кПа (101,33 кПа = 760 мм рт. ст.);

t - температура воздуха в месте отбора пробы, °С.

Для удобства расчета V₂₀ следует пользоваться таблицей коэффициентов (прилож. 2). Для приведения воздуха к стандартным условиям надо умножить V_t на соответствующий коэффициент.

Приложение 2

Коэффициенты для приведения объема воздуха к стандартным условиям

Приложение 3

Указатель основных синонимов, технических, торговых и фирменных названий веществ

1. Амиодарон

2. Амоксициллина тригидрат

3. Ацикловир

4. Витамин А

5. Галоперидол

6. Ксиланаза

7. Лоперамида гидрохлорид

8. Мексидол

9. Мексикор

10. Офлоксацин

11. Пиразинамид

12. Ретинола ацетат

13. Родопол-23

14. Симвастатин

15. Трамадол

16. Хладон-23

17. Хладон-31-10

18. Хладон-116

19. Хладон-122

20. Хладон-R11511

21. Цианборгидрид натрия

22. Этамбутола дигидрохлорид

Приложение 4

Вещества, определяемые по ранее утвержденным методическим указаниям

 

СОДЕРЖАНИЕ