4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ПЕСТИЦИДОВ
В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ, СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОМ
СЫРЬЕ И ОБЪЕКТАХ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ

Определение остаточных количеств Люфенурона в воде,
почве, яблоках и клубнях картофеля методом
высокоэффективной жидкостной хроматографии

СБОРНИК МЕТОДИЧЕСКИХ УКАЗАНИЙ
МУК 4.1.1140-02

ВЫПУСК 1

МОСКВА
2004

1. Сборник подготовлен: Федеральным научным центром гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана (чл.-корр. РАМН, проф. В.Н. Ракитский, проф. Т.В. Юдина); Московской сельскохозяйственной академией им. К.А. Тимирязева (проф. В.А. Калинин, к. хим. н. Довгилевич А.В.); Всероссийским НИИ фитопатологии (А.М. Макеев и др.); Всероссийским НИИ защиты растений (В.И. Долженко и др.); Санкт-Петербургским НИИ лесного хозяйства (Маслаков С.Е., Л.В. Григорьева и др.), при участии Департамента Госсанэпиднадзора Минздрава России (А.П. Веселов).

2. Методические указания рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Минздраве России.

3. Утверждены и введены в действие Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации, академиком РАМН Г.Г. Онищенко.

4. Введены впервые.

УТВЕРЖДАЮ

Главный государственный санитарный

врач Российской Федерации, Первый

заместитель Министра здравоохранения

Российской Федерации

Г.Г. Онищенко

Дата введения: 1 января 2003 г.

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Определение остаточных количеств Люфенурона в воде,
почве, яблоках и клубнях картофеля методом
высокоэффективной жидкостной хроматографии

1. Вводная часть

Фирма производитель: Сингента (Швейцария).

Торговое название: МАТЧ.

Действующее вещество: люфенурон (ЦГА 184699).

(RS)-1-/2,5-дихлор-4-(1,1,2,3,3,3-гексафторпропокси)фенил/-3-(2,6-дифторбензоил)мочевина (ИЮПАК).

C₁₇H₈Cl₂F₈N₂O₃                                                                                            M. м. 511,2

Бесцветное кристаллическое вещество без запаха.

Температура плавления: 168,7 - 169,4 °С.

Давление паров при 25 °С: 4 × 10^-6 Па.

Коэффициент распределения н-октанол-вода: К_ow logP = 5,12.

Хорошо растворим в ацетоне (460 г/л), толуоле (72 г/л), этаноле (41 г/л); плохо растворим в гексане (0,13 г/л) и практически не растворим в воде (0,06 мг/л).

Стабильность к гидролизу при 20 °С: DT₅₀ = 160 дней (рН 5), 70 дней (рН 7) и 32 дня (рН 9).

Стабилен на воздухе и на свету.

В биологически активных почвах в аэробных условиях люфенурон быстро разлагается: DT₅₀ = 13 - 20 дней.

Краткая токсикологическая характеристика

Острая пероральная токсичность (LD₅₀) для мышей и крыс - более 2000 мг/кг; острая дермальная токсичность (LD₅₀) для крыс - более 2000 мг/кг; острая ингаляционная токсичность (LC₅₀) для крыс - более 2,35 мг/л воздуха. Люфенурон не оказывает раздражающего действия на кожу и слизистую оболочку глаз кролика. LC₅₀ для рыб 30 - 70 мг/л (96 ч).

Инсектицид нетоксичен для диких животных, птиц, пчел, земляных червей, почвенных микроорганизмов и токсичен для дафний.

Гигиенические нормативы для люфенурона в России: ОДК в почве - 0,1 мг/кг; ПДК в воде водоемов - 0,005 мг/дм³; МДУ для яблок и картофеля - 0,04 мг/кг.

Область применения препарата

Люфенурон - инсектоакарицид из группы ингибиторов синтеза хитина, эффективно уничтожает листогрызущие личинки чешуекрылых и жесткокрылых, эриофиидных клещей на хлопчатнике, сое, овощных культурах, винограде, семечковых плодовых, картофеле и кукурузе в течение вегетационного периода.

2. Методика определения остаточных количеств Люфенурона в воде, почве, яблоках и клубнях картофеля методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

2.1. Основные положения

2.1.1. Принцип метода

Метод основан на определении люфенурона с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на обращенной фазе с ультрафиолетовым детектором после экстракции его из воды смесью гексан-диэтиловый эфир (9 : 1), из почвы водным метанолом, из растительного материала метанолом, очистки экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей, а также на колонке с силикагелем и концентрирующем патроне Диапак.

Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.

2.1.2. Избирательность метода

В предлагаемых условиях метод специфичен в присутствии пестицидов, применяемых при возделывании яблоневых садов и картофеля.

2.1.3. Метрологическая характеристика метода

Таблица 1

Метрологические параметры метода

2.2. Реактивы, растворы, материалы

Люфенурон с содержанием д. в. 99,7 %
Ацетонитрил, ч	ТУ 6-09-3534-82
Вода бидистиллированная	ГОСТ 7602-72
Гексан, ч	ТУ 6-09-3375-78
Натрий серно-кислый, безводный, хч	ГОСТ 4166-76
Натрий хлористый, хч	ГОСТ 4233-77
Спирт метиловый, хч	ГОСТ 6995-77
Этилацетат	ГОСТ 22300-76
Эфир диэтиловый	ГОСТ 6265-74
Элюент № 1 для колоночной хроматографии: смесь гексан-этилацетат, 90 : 10, по объему
Элюент № 2 для колоночной хроматографии: смесь гексан-этилацетат, 80 : 20, по объему
Элюент № 1 для Диапака: смесь ацетонитрил-вода, 40 : 60, по объему
Элюент № 2 для Диапака: смесь ацетонитрил-вода, 50 : 50, по объему
Концентрирующий патрон Диапак С8 (АО БиоХимМак, РФ)
Силикагель для адсорбционной хроматографии (Вельм, Германия) 1 степени активности или силикагель КСК (60 - 100 меш)
Стекловата
Целит 535 (2 - 15 мкм) /Серва, Германия/ или аналогичный
Фильтры бумажные «синяя лента»	ТУ 6-09-1678

2.3. Приборы, аппаратура, посуда

Жидкостный хроматограф с ультрафиолетовым детектором фирмы Altex (США) или аналогичный
Хроматографическая колонка стальная, длиной 25 см, внутренним диаметром 4 мм, заполненная Диасорбом 130-С16Т (АО БиоХимМак, РФ; 119899, Москва, Ленинские горы)
Шприц для ввода образца в жидкостный хроматограф
Медицинский шприц с разъемом типа Люер для ввода образцов в концентрирующий патрон Диапак
Весы аналитические типа ВЛР-200	ГОСТ 19401-74
Водоструйный насос	ГОСТ 10696-75
Встряхиватель механический	ТУ 64-1-1081-73
Гомогенизатор	МРТУ 42-1505-63
Прибор для перегонки при атмосферном давлении
Ротационный испаритель тип ИР-1М	ТУ 25-11-917-76
Сито с диаметром отверстий 1 мм
Баня водяная	ТУ 46-22-603-75
Воронка Бюхнера	ГОСТ 0147-73
Воронки делительные вместимостью 100, 250 и 500 мл	ГОСТ 25336-82
Воронки для фильтрования, стеклянные	ГОСТ 8613-75
Колба Бунзена	ГОСТ 5614-75
Колбы круглодонные на шлифе, вместимостью 100, 250 и 500 мл	ГОСТ 9737-70
Колбы конические с притертыми пробками, вместимостью 250 мл	ГОСТ 25336-82
Колбы мерные, вместимостью 25, 50, 100 и 1000 мл	ГОСТ 1770-74
Колбы грушевидные, вместимостью 100, 250 и 500 мл	ГОСТ 25336-82
Пипетки мерные, вместимостью 1, 2, 5 и 10 мл	ГОСТ 20292-74Е
Пробирки градуированные с притертыми пробками, вместимостью 5 и 10 мл	ГОСТ 10515-75
Цилиндры мерные, вместимостью 50, 100, 250 и 500 мл	ГОСТ 1770-74

2.4. Отбор проб

Отбор проб производится в соответствии с «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов» (№ 2051-79 от 21.08.79).

Отобранные пробы почвы, яблок и клубней картофеля хранят в стеклянной или полиэтиленовой таре в холодильнике не более трех дней. Для длительного хранения пробы почвы доводят до воздушно-сухого состояния и хранят в холодильнике; пробы яблок и клубней хранят до анализа в морозильной камере при температуре -18 °С. Пробы воды хранят при температуре не выше 4 °С в течение 3 дней, при температуре -18 °С в течение месяца.

Перед анализом сухую почву просеивают через сито с отверстиями диаметром 1 мм, а яблоки и клубни измельчают.

2.5. Подготовка к определению

2.5.1. Подготовка и очистка реактивов и растворителей

Органические растворители перед началом работы сушат и перегоняют в соответствии с типовыми методиками.

2.5.2. Подготовка подвижной фазы для ВЭЖХ

Отмеряют 600 мл ацетонитрила, переносят в колбу на 1000 мл, добавляют 400 мл бидистиллированной воды, перемешивают и дегазируют.

2.5.3. Кондиционирование колонки

Промыть колонку для ВЭЖХ смесью ацетонитрил-вода (6 : 4, по объему) в течение 30 мин при скорости подачи растворителя 1 мл/мин. Включить детектор и подождать стабилизации базовой линии (5 - 15 мин).

2.5.4. Приготовление стандартных растворов

Основной стандартный раствор люфенурона с содержанием 100 мкг/мл готовят растворением 0,010 г препарата, содержащего 99,7 % д. в., в ацетонитриле в мерной колбе на 100 мл. Раствор хранят в холодильнике не более месяца.

Рабочие стандартные растворы с концентрациями 0,05, 0,1, 0,25 и 0,5 мкг/мл готовят из основного стандартного раствора люфенурона соответствующим последовательным разбавлением подвижной фазой для ВЭЖХ (п. 2.5.2). Рабочие растворы хранят в холодильнике не более недели.

2.5.5. Построение калибровочного графика

Для построения калибровочного графика в инжектор хроматографа вводят по 100 мкл рабочего стандартного раствора люфенурона с концентрацией 0,05, 0,1, 0,25 и 0,5 мкг/мл. Осуществляют не менее 5 параллельных измерений и находят среднее значение высоты хроматографического пика для каждой концентрации. Строят калибровочный график зависимости высоты хроматографического пика в мм от концентрации люфенурона в растворе в мкг/мл.

2.5.6. Подготовка колонки с силикагелем и концентрирующего патрона Диапак С8 для очистки экстрактов

В нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см и внутренним диаметром 0,8 см вставляют тампон из стекловаты, закрывают кран и приливают 10 мл гексана. Затем в колонку вносят суспензию 5 г силикагеля в 20 мл гексана. Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента и помещают на него слой безводного сульфата натрия высотой 1 см. Колонку промывают 20 мл гексана со скоростью 1 - 2 капли в секунду, после чего она готова к работе.

Концентрирующий патрон Диапак С8 промывают последовательно с помощью медицинского шприца 5 мл ацетонитрила и 5 мл бидистиллированной воды со скоростью 5 мл/мин.

2.6. Описание определения

2.6.1. Экстракция люфенурона

2.6.1.1. Вода. 250 мл предварительно отфильтрованной воды помещают в делительную воронку емкостью 500 мл. Добавляют 30 мл смеси гексан-диэтиловый эфир (9 : 1, по объему) и встряхивают 1 минуту. Верхний органический слой отделяют, собирая в коническую колбу емкостью 250 мл. Водный слой экстрагируют смесью гексан-диэтиловый эфир еще дважды порциями по 30 мл. Объединенную органическую фазу пропускают через слой безводного сульфата натрия и упаривают на роторном вакуумном испарителе досуха при температуре 30 °С. Остаток растворяют в 2 мл подвижной фазы для ВЭЖХ (п. 2.5.2) и анализируют на содержание люфенурона по п. 2.7.

2.6.1.2. Яблоки, клубни картофеля. К навеске (25 г) измельченного материала добавляют 100 мл метанола, гомогенизируют 3 минуты при 10000 об/мин и суспензию перемешивают в течение 20 минут на аппарате для встряхивания. Добавляют 2 г целита и фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через бумажный фильтр в колбу емкостью 500 мл. Остаток на фильтре промывают 20 мл метанола. Растительный материал повторно экстрагируют 60 мл метанола при встряхивании в течение 10 минут, и суспензию фильтруют. К объединенным экстрактам добавляют метанол до объема 200 мл и отбирают аликвоту раствора (40 мл), эквивалентную 5 г растительного материала.

2.6.1.3. Почва. Навеску (20 г) воздушно-сухой почвы помещают в коническую колбу емкостью 250 мл, приливают 20 мл дистиллированной воды и спустя 5 минут 80 мл метанола. Суспензию перемешивают в течение 1 часа на аппарате для встряхивания. Добавляют 2 г целита и фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через бумажный фильтр. Осадок на фильтре промывают 20 мл метанола. К объединенному фильтрату добавляют метанол до объема 120 мл и отбирают аликвоту раствора (60 мл), эквивалентную 10 г почвы.

2.6.2. Очистка экстракта

Аликвоты растительного (из п. 2.6.1.2) и почвенного (из п. 2.6.1.3) экстрактов переносят в делительную воронку вместимостью 250 мл, приливают соответственно 40 или 50 мл дистиллированной воды, 20 или 30 мл насыщенного раствора хлорида натрия и 30 мл смеси гексан-диэтиловый эфир (9 : 1, по объему). Смесь встряхивают в течение 1 минуты и после ее разделения отделяют гексановый слой и пропускают его через стеклянный фильтр, заполненный безводным сульфатом натрия, в грушевидную колбу вместимостью 100 мл. Экстракцию водно-метанольной фракции смесью гексан-диэтиловый эфир повторяют еще два раза (по 20 мл). Объединенный гексановый экстракт упаривают на роторном испарителе досуха при температуре 30 °С.

2.6.3. Очистка на колонке с силикагелем

Остаток в колбе, полученный при упаривании очищенных по п. 2.6.2 экстрактов растительного материала и почвы, количественно переносят тремя 1-мл порциями смеси гексан-этилацетат (9 : 1, по объему) в подготовленную хроматографическую колонку (п. 2.5.6). Промывают колонку 50 мл смеси гексан-этилацетат (9 : 1, по объему), которые отбрасывают. Люфенурон элюируют 50 мл смеси гексан-этилацетат (8 : 2, по объему), собирая элюат в грушевидную колбу емкостью 100 мл. Раствор упаривают досуха на роторном испарителе при температуре 30 °С. Сухие остатки экстрактов почвы и яблок растворяют в 2 мл подвижной фазы для ВЭЖХ (п. 2.5.2) и анализируют по п. 2.7.

2.6.4. Очистка на концентрирующем патроне Диапак

Сухой остаток экстракта клубней картофеля (п. 2.6.3) количественно переносят двумя 1-мл порциями смеси ацетонитрил-вода (4 : 6, по объему) в подготовленный концентрирующий патрон Диапак С8 (п. 2.5.6). Патрон промывают 7 мл смеси ацетонитрил-вода (4 : 6, по объему) со скоростью 5 мл/мин, которые отбрасывают. Люфенурон элюируют 15 мл смеси ацетонитрил-вода (5 : 5, по объему) со скоростью 5 мл/мин. Элюат упаривают досуха на роторном испарителе при температуре 40 °С. Сухой остаток растворяют в 2 мл подвижной фазы для ВЭЖХ (п. 2.5.2) и анализируют на содержание люфенурона по п. 2.7.

2.7. Условия хроматографирования

Жидкостный хроматограф с ультрафиолетовым детектором Altex (США)

Колонка стальная длиной 25 см, внутренним диаметром 4 мм

Температура колонки                                                                                    комнатная

Подвижная фаза                                                     ацетонитрил-вода (60 : 40, по объему)

Скорость потока элюента                                                                             1 мл/мин

Рабочая длина волны                                                                                     254 нм

Чувствительность                                                  0,005 ед. абсорбции на шкалу

Объем вводимой пробы                                                                                100 мкл

2.7.1. Неподвижная фаза: Диасорб 130-С16Т, зернением 7 мкм

Время выхода люфенурона:                                                        около 16 минут.

2.7.2. Альтернативная неподвижная фаза: Lichrosorb RP-8 (5 мкм)

Время выхода люфенурона:                                                        около 13 минут

Линейный диапазон детектирования                                        5 - 50 нг

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор с концентрацией 0,5 мкг/мл, разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ.

2.8. Обработка результатов анализа

Содержание люфенурона рассчитывают методом абсолютной калибровки по формуле:

, где

Х - содержание люфенурона в пробе, мг/кг или мг/дм³;

H₁ - высота пика образца, мм;

Н₀ - высота пика стандарта, мм;

А - концентрация стандартного раствора люфенурона, мкг/мл;

V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, мл;

т - объем анализируемого образца (мл) или масса анализируемой части образца, г.

3. Требования техники безопасности

Необходимо соблюдать общепринятые правила безопасности при работе с органическими растворителями, токсичными веществами, электронагревательными приборами.

4. Разработчики

Дубовая Л.В.; Талалакина Т.Н.; Макеев А.М. к. биол. н.; Чкаников Д.И., профессор, д. биол. н.

ВНИИ фитопатологии, 143050, Московская обл., п/о Большие Вяземы.

Таблица 2

Полнота определения Люферона (n = 5)

СОДЕРЖАНИЕ