|
Государственное
санитарно-эпидемиологическое нормирование 4.2.
МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И Метод микробиологического измерения Методические указания Москва 2018 1. Разработаны и подготовлены ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России (проф., д.б.н. Н.И. Шеина). 2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 24 ноября 2017 г. № 1). 3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 1 февраля 2018 г. 4. Введены впервые. СОДЕРЖАНИЕ
4.2.
МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И Метод
микробиологического измерения Методические указания 1. Назначение и область применения1.1. Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода микробиологического количественного анализа концентрации Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium flavum) H150 ВКПМ В-12692 в атмосферном воздухе населенных мест в диапазоне концентраций от 5 до 50000 клеток в 1 м3 воздуха. 1.2. Методические указания носят рекомендательный характер. 2. Биологическая характеристика штамма Corynebacterium
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
Барометр-анероид с диапазоном измерения атмосферного давления 5 - 790 мм рт. ст. и с пределом допустимой погрешности ±2,5 мм рт. ст. |
ТУ 2504-1799-75 |
|
Весы лабораторные аналитические, наибольший предел взвешивания 110 г, предел допустимой погрешности ±0,2 мг |
|
|
Колбы мерные 2-100-2, 2-250-2, 2-1000-2 |
|
|
Пипетки градуированные 2-го класса точности вместимостью 1,0; 2,0; 5,0; 10 см3 |
|
|
Цилиндры мерные 2-го класса точности вместимостью 25 и 50 см3 |
|
|
Термометр лабораторный шкальный, пределы измерения 0 - 55 °С |
ТУ 25-2021.003-88 |
|
Аспирационный аппарат и устройство для отбора проб воздуха |
|
Примечание. Допускается использование других средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.
|
Шкаф сушильный стерилизационный, позволяющий поддерживать температуру (160 ± 5) °С |
ТУ 9452-010-00141798-02 |
|
Термостаты, позволяющие поддерживать рабочую температуру (30 ± 2) и (37 ± 2) °С |
ТУ 9452-002-00141798-97 |
|
Автоклав электрический |
ГОСТ 9586-75 ГОСТ Р ЕН 13060-11 |
|
Стерилизаторы паровые медицинские |
|
|
Дистиллятор |
ТУ 4952-007-33142130-2000 |
|
Облучатель бактерицидный настенный |
ТУ 9444-015-03965956-08 |
|
Холодильник бытовой |
|
|
Микроскоп биологический с иммерсионной системой |
|
|
Лупа с увеличением ×10 |
|
|
Пробирки типов П1, П2 |
|
|
Спиртовки лабораторные стеклянные |
|
|
Чашки биологические (Петри) или одноразовые из полимерных материалов |
|
|
Воронки конусные диаметром 40 - 45 мм |
|
|
Груша резиновая |
ТУ 9398-005-0576-9082-03 |
|
Петля бактериологическая |
|
|
Марля медицинская |
ГОСТ 9412-77 |
|
Вата медицинская гигроскопическая |
ГОСТ 25556-81 |
|
Бумага фильтровальная лабораторная |
Примечание. Допускается использование другого оборудования с аналогичными или лучшими характеристиками.
|
Агар микробиологический |
|
|
Вода дистиллированная |
ГОСТ 6709-90 |
|
Дрожжевой экстракт, сухой |
ГОСТ 17206-84 |
|
Натрий хлористый |
|
|
Патока мальтозная |
ГОСТ 55316-12 |
|
Спирт этиловый технический |
|
|
Спирт этиловый ректификованный |
|
|
Триптон |
|
Примечание. Допускается использование других питательных сред и диагностических препаратов с аналогичными характеристиками.
При выполнении измерений концентрации клеток бактерий в атмосферном воздухе населенных мест соблюдают следующие требования.
6.1. Санитарные правила «Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней», СП 1.3.2322-08.
6.2. Дополнения и изменения 1 к СП 1.3.2322-08. Санитарно-эпидемиологические правила СП 1.3.2518-09.
6.3. Правила техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76.
6.4. Требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-09 и инструкции по эксплуатации прибора.
6.5. Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами.
К выполнению измерений и обработке их результатов допускают лиц с высшим или средним специальным образованием, прошедших соответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области микробиологических исследований.
Приготовление сред, подготовку к анализу проводят в следующих условиях:
- температура воздуха (20 ± 5) °С;
- атмосферное давление (60 ± 20) мм рт. ст.;
- влажность воздуха не более 80 %.
Для приготовления среды 2LB используют отдельные компоненты среды следующего состава (г/1000 см3): триптон - 20,0 г; 50 %-я патока мальтозная - 20,0 г; дрожжевой экстракт - 10,0 г; агар-агар - 15,0 г; натрий хлористый - 10,0 г; дистиллированная вода - 1000 см3.
Сухие компоненты растворяют в 1000 см3 дистиллированной воды, тщательно перемешивают и нагревают до полного растворения агара.
Приготовленную среду разливают в стерильные колбы по 250 - 500 см3 и автоклавируют при 121 °С в течение 15 мин.
Готовую среду хранят в защищенных от света условиях при температуре не выше 8 °С в течение 10 дней не более. Раствор мальтозы 50 %-й готовится и стерилизуется отдельно. При разливе среды в чашки Петри добавляется из расчета 40 мл/л 50 %-я мальтоза.
Отбор проб воздуха проводят в соответствии с требованиями ГОСТ 17.2.4.02-81 «Охрана природы. Атмосфера. Общие требования к методам определения загрязняющих веществ» и Р 8.563-96 «Методики выполнения измерений».
Для этого воздух аспирируют при помощи пробоотборника на поверхность плотной питательной среды в соответствии с технической документацией (инструкцией) на прибор. Время аспирации и объем отбираемого воздуха зависит от предполагаемой концентрации микроорганизма.
Аппарат перед каждым отбором пробы воздуха тщательно протирают 96° этиловым спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенку прибора; наружную и внутреннюю стенку крышки. На подвижной диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо (количество питательной среды в чашки вносят в соответствии с инструкцией к прибору). После отбора пробы воздуха и остановки диска прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы.
При выполнении анализа воздуха прямым методом стерильную агаризованную среду (2LB) расплавляют, остужают до 50 - 60 °С и разливают в чашки Петри. Затем добавляют из расчета 40 мл/л стерилизованный 50 %-й раствор мальтозы.
Контроль чистоты розлива проводят в соответствии с п. 7.1.1 МУК 4.2.2316-08. Для этого чашки с застывшей средой помещают в термостат при температуре 37 °С не менее чем на 18 часов. Проросшие чашки бракуют, стерильные чашки используют для контроля воздуха. Разлитую в чашки питательную среду хранят при температуре 2 - 8 °С не более 10 дней.
После отбора проб воздуха чашки Петри помещают в термостат с температурой (30 ± 2) °С. Через 1 - 3 суток проводят подсчет выросших колоний по культурально-морфологическим признакам.
Ростовые свойства используемой питательной среды должны быть проверены до проведения анализа воздуха в соответствии с требованиями к ростовым свойствам питательных сред, руководствуясь МУК 4.2.2316-08. Для этого эталонный музейный штамм Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium flavum) H150 ВКПМ В-12692 высевается на 2 - 3 чашки используемой среды.
Лиофилизованную культуру музейного штамма необходимо использовать 2 - 3 пассажа во избежание потери им заданных ростовых свойств.
Расчет концентрации клеток проводят по формуле:
|
К = (П×1000)/С×Т кл/м3, где |
К - концентрация штамма в воздухе, клеток/м3;
П - количество типичных колоний, выросших на чашке Петри;
1000 - коэффициент пересчета на 1 м3 воздуха;
С - скорость аспирации воздуха, л/мин;
Т - время аспирации, мин.
Результаты измерений оформляют протоколом по следующей форме.
|
Протокол
№ 1. Дата проведения анализа ___________________________________________________ 2. Рабочее место (профессия работающего) ______________________________________ 3. Место отбора пробы (название и адрес организации, производство, технологическая стадия, точка отбора пробы) __________________________________________________ 3. Вид пробоотборника _______________________________________________________ 4. Дата последней метрологической поверки оборудования для отбора проб __________ 5. Питательная среда, время инкубации _________________________________________ 6. Результаты испытания ростовых свойств питательной среды _____________________ 7. Количественная и качественная характеристика выросших колоний (количество типичных колоний) __________________________________________________________ 8. Результаты идентификации микроорганизмов Corynebacterium glutamicum Н150 ВКПМ В-12692 (морфологические признаки) ____________________________________ 9. Результаты расчёта концентрации штамма ____________________________________ 10. Соотношение полученных результатов с уровнем ПДКа.в. _______________________ 11. Отбор пробы проведён (Ф. И. О., должность, дата, подпись) ____________________ 12. Идентификация штамма и расчёт концентрации проведены (Ф. И. О., должность, дата, подпись) ______________________________________________________________ |