Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей
и благополучия человека

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Микробиологическое измерение
концентрации Paenibacillus mucilaginosus
Pm 2906 ВКПМ В-12259 в атмосферном воздухе
населенных мест

Методические указания
МУК 4.2.3436-17

Москва 2017

1. Разработаны и подготовлены ФГБОУ ВО «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Минздрава России (Н.И. Шеина).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 22 декабря 2016 г. № 2).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 22 февраля 2017 г.

4. Введены впервые.

СОДЕРЖАНИЕ

 

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Микробиологическое измерение концентрации
Paenibacillus mucilaginosus Pm 2906 ВКПМ В-12259
в атмосферном воздухе населенных мест

1. Общие положения и область применения

1.1. Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода микробиологического количественного анализа концентрации Paenibacillus mucilaginosus Pm 2906 ВКПМ В-12259 в атмосферном воздухе населенных мест в диапазоне концентраций от 50 до 50000 клеток в 1 м³ воздуха.

1.2. Методические указания носят рекомендательный характер.

2. Биологическая характеристика штамма Paenibacillus
mucilaginosus Pm 2906 ВКПМ В-12259 и его гигиенический
норматив в атмосферном воздухе населенных мест

Штамм Paenibacillus mucilaginosus Pm 2906 выделен из окультуренных почв методом многоступенчатой аналитической селекции, не является генетически модифицированным штаммом. Предполагается использовать для производства бактериальных удобрений, а также для профилактики и лечения грибковых заболеваний в растениеводстве. Производственная активность штамма не менее 1,2×10⁸ кл/мл.

Таксономическое положение штамма

Paenibacillus (лат.) - род аэробных грамположительных спорообразующих палочковидных бактерий. Ранее представители этого рода входили в рРНК третью группу рода Bacillus, в 1993 году Эш, Прист и Коллинс предложили вывести представителей группы 3 в отдельный род Paenibacillus. Название рода произошло от латинского слова «paene» («почти») - в названии рода отражено сходство с родом Bacillus (название рода можно буквально перевести как «почти бациллы»).

Род представлен палочковидными бактериями, образующими термоустойчивые эндоспоры. Некоторые виды подвижны и имеют жгутики. Большинство представителей - мезофилы, есть термофильные представители. Представители рода обитают в почве, ризосфере растений, есть эндофитные представители, колонизирующие ткани растений. Многие представители продуцируют антимикробиальные вещества, проявляющие бактерицидное и фунгицидное действие.

Штамм Paenibacillus mucilaginosus Pm 2906 характеризуется следующими культурально-морфологическими признаками: на среде Эшби наблюдаются слизистые, прозрачные, бесцветные или светло-серые колонии, выпуклые или слегка приплюснутые, блестящие с ровными краями.

Микроскопически различаются неподвижные крупные палочковидные клетки правильной формы с округлыми краями, располагаются одиночно или парами, окруженные слизистой оболочкой, образуют эндоспоры.

Для культивирования используется агаризованная среда Эшби, оптимальная температура (30 ± 2) °С.

Физиолого-биохимические признаки: в качестве углерода усваивает глюкозу, сахарозу, мальтозу, лактозу, гидролизует крахмал. В качестве источника азота может быть использован аммонийный азот, карбамид, нитраты. Штамм обладает способностью растворять нерастворимые или малорастворимые соединения фосфора и калия (трикальций-фосфат, силикаты).

Штамм Paenibacillus mucilaginosus Pm 2906 не является зоо- и фитопатогенным, не относится к микроорганизмам, патогенным для человека (СП 1.3.2322-08), депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под номером ВКПМ В-12259.

Предельно допустимая концентрация (ПДК) в атмосферном воздухе населенных мест - 5000 кл/м³.

3. Пределы измерений

Методика обеспечивает выполнение измерений количества штамма в атмосферном воздухе населенных мест в диапазоне концентраций от 50 до 50000 клеток в 1 м³ воздуха при доверительной вероятности 0,95.

4. Методы измерений

Прямой метод основан на аспирации из атмосферного воздуха населенных мест бактерий на агаризованную среду Эшби и подсчете количества выросших колоний по типичным культурально-морфологическим признакам.

5. Средства измерений, вспомогательные устройства,
реактивы и материалы

При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства и материалы, реактивы и питательные среды.

5.1. Средства измерений

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

5.2. Вспомогательные устройства и материалы

Примечание. Допускается применение оборудования и материалов с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

5.3. Реактивы и питательные среды

Примечание. Допускается использование других питательных сред и диагностических препаратов с аналогичными характеристиками.

6. Требования безопасности

При выполнении измерений концентрации штамма в атмосферном воздухе населенных мест соблюдают требования, изложенные в следующих документах.

6.1. Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней: СП 1.3.2322-08.

6.2. Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней. Дополнения и изменения № 1 к СП 1.3.2322-08: СП 1.3.2518-09.

6.3. Правила техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.005-88.

6.4. Электробезопасность при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-79 и инструкции по эксплуатации прибора.

Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами.

7. Требования к квалификации операторов

К выполнению измерений и обработке их результатов допускают лиц с высшим или средним специальным образованием, прошедших соответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области микробиологических исследований.

8. Условия измерений

Приготовление сред, подготовку к анализу проводят в следующих условиях:

- температура воздуха (20 ± 5) °С;

- атмосферное давление (760 ± 20) мм рт. ст.;

- влажность воздуха не более 80 %.

9. Приготовление питательных сред

Для приготовления агаризованной среды Эшби используют компоненты следующего состава: маннит, сахароза или глюкоза - 20,0 г, калий сернокислый - 0,2 г, калий фосфорнокислый двузамещенный - 0,2 г, кальций углекислый - 5,0 г, магний сернокислый - 0,2 г, натрий хлористый - 0,2 г, агар-агар - 15,0 г. Сухие компоненты растворяют в 1000 см³ дистиллированной воды, перемешивают и нагревают до полного растворения агара.

Приготовленную среду разливают в стерильные колбы по 250 - 500 см³ и автоклавируют при 121 °С в течение 15 мин.

Готовые среды хранят в защищенных от света условиях при температуре не выше 8 °С в течение 14 дней, не более.

10. Проведение измерения

10.1. Отбор проб воздуха

Отбор проб воздуха проводят в соответствии с требованиями ГОСТ 17.2.4.02-81 «Охрана природы. Атмосфера. Общие требования к методам определения загрязняющих веществ» и Р 8.563-96 «Методики выполнения измерений».

Для этого воздух аспирируют при помощи пробоотборника на поверхность плотной питательной среды в соответствии с технической документацией (инструкцией) на прибор. Время аспирации и объем отбираемого воздуха зависят от предполагаемой концентрации микроорганизма.

Аппарат перед каждым отбором пробы воздуха тщательно протирают 96%-м этиловым спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенку прибора, наружную и внутреннюю стенки крышки. На подвижный диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо (количество питательной среды в чашки вносят в соответствии с инструкцией к прибору). После отбора пробы воздуха и остановки диска прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирации и дачу отбора пробы.

10.2. Выполнение анализа

При выполнении анализа воздуха прямым методом стерильную агаризованную среду Эшби расплавляют, остужают до 50 - 60 °С и разливают в чашки Петри.

Контроль чистоты розлива проводят в соответствии с п. 7.1.1 МУК 4.2.2316-08. Для этого чашки с застывшей средой помешают в термостат при температуре 37 °С не менее чем на 18 часов. Проросшие чашки бракуют, стерильные чашки используют для контроля воздуха. Разлитую в чашки питательную среду хранят при температуре 2 - 8 °С не более 10 дней.

После отбора проб воздуха чашки Петри помещают в термостат с температурой (30 ± 2) °С. Через 1 - 2 суток проводят подсчет выросших колоний по культурально-морфологическим признакам.

Ростовые свойства используемой питательной среды должны быть проверены до проведения анализа воздуха в соответствии с требованиями к ростовым свойствам питательных сред, руководствуясь МУК 4.2.2316-08. Для этого эталонный музейный штамм Paenibacillus mucilaginosus Pm 2906 ВКПМ В-12259 высевается на 2 - 3 чашки используемой среды.

Лиофилизованную культуру музейного штамма необходимо использовать 2 - 3 пассажа во избежание потери заданных ей ростовых свойств.

11. Вычисление результатов измерения

Расчет концентрации клеток проводят по формуле:

K - концентрация Paenibacillus mucilaginosus Pm 2906 ВКПМ В-12259 в воздухе, кп/м³;

П - количество типичных колоний, выросших на чашке Петри;

1000 - коэффициент перерасчета на 1 м³ воздуха;

С - скорость аспирации воздуха, л/мин;

Т - время аспирации, мин.

12. Оформление результатов измерений

Результаты измерений оформляют протоколом по следующей форме.