Государственное санитарно-эпидемиологическое
нормирование Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав
потребителей 4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И Микробиологическое измерение Методические указания Москва 2017 1. Разработаны и подготовлены ФГБОУ ВО «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Минздрава России (Н.И. Шеина). 2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере зашиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 22 декабря 2016 г. № 2). 3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере зашиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 22 февраля 2017 г. 4. Введены впервые. СОДЕРЖАНИЕ
4.2.
МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И Микробиологическое измерение концентрации Методические указания 1. Назначение и область применения1.1. Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода микробиологического количественного анализа концентрации Trichoderma asperellum OPF-19 в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 50 до 500000 клеток в 1 м3 воздуха. 1.2. Методические указания носят рекомендательный характер. 2. Биологическая характеристика штамма Trichoderma
|
Класс |
Fungi imperfecti |
Порядок |
Hyphomycetales |
Род |
Trichoderma |
Вид |
asperellum |
Штамм |
OPF-19 |
Культурально-морфологические признаки. Растет на агаризованных средах (Мальц-агар, среда Чапека с дрожжевым автолизатом, сусло-агар, глюкозо-картофельный агар, среда Сабуро) при температуре 29 - 34 °С в течение 7 суток, pH 3,5 - 5,0.
После 72 часов роста на глюкозо-картофельном агаре при температуре 30 °С колония штамма Т. asperellum OPF-19 имеет максимальный диаметр 55 - 65 мм. Колонии образуют несколько концентрических колец, на поверхности которых заметно интенсивное спороношение.
В центральной части колония более темная, она раньше, чем периферия приобретает зеленую окраску. По мере удаления от центра формируется воздушный мицелий. При культивировании при температуре 25 °С в отсутствии света, конидии формируются через 35 - 45 часов. Диффузии пигмента в агар не происходит, у старых колоний присутствует слабый специфический запах.
При росте на агаризованной среде Сабуро в течение 5 суток при температуре 25 °С конидиальная зона сформирована конидиеносцами, сгруппированными в коремии и спородохии, имеющими вид многочисленных компактных подушечек диаметром до 2 мм, изначально белого цвета, с возрастом - зеленого. Подушечки образуются по всей поверхности колонии, обильно.
Конидиеносцы чаще формируются в подушечках и редко на воздушном мицелии, конидиеносцы симметричные, завершаются четырьмя фиалидами. Парные ответвления формируются ниже верхушки конидиеносца и располагаются под углом около 90° по отношению к основной оси. Первичные ветки по мере удаления от верхушки удлиняются, парные ответвления имеют одинаковую длину, на боковых ветвях первого порядка формируются неветвящиеся боковые ветви второго порядка. Ширина конидиеносца - 2,1 - 5,0 мкм.
Фиалиды образуются на концах ветвей первого и второго порядка, образуются скопления из 2 - 4 фиалид. Фиалиды прямые, колбовидные, немного расширенные в середине, длина - 5 - 10 мкм, ширина - 2,2 - 5,7 мкм. Интеркалярные фиалиды не формируются. Конидии имеют темно-зеленый цвет, форма - немного яйцевидная, часто ближе к шаровидной, диаметр - 3,5 - 4 мкм.
Штамм Trichoderma asperellum OPF-19 по критериям вирулентности, токсичности, токсигенности и диссеминации относится к непатогенным для теплокровных животных микроорганизмов.
Предельно допустимая концентрация (ПДК) в воздухе рабочей зоны 50000 кл/м3.
Методика обеспечивает выполнение измерений количества клеток в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 50 до 500000 клеток в 1 м3 воздуха при доверительной вероятности 0,95.
Метод основан на аспирации из воздуха производственных помещений бактерий на среду Сабуро и подсчете количества выросших колоний по типичным культурально-морфологическим признакам.
При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства и материалы, реактивы и питательные среды.
Барометр-анероид с диапазоном измерения атмосферного давления 5 - 790 мм рт. ст. и с пределом допустимой погрешности ±2,5 мм рт. ст. |
ТУ 2504-1799-75 |
Весы лабораторные аналитические, наибольший предел взвешивания 110 г, предел допустимой погрешности ±0,2 мг |
|
Колбы мерные 2-100-2, 2-250-2, 2-1000-2 |
|
Пипетки градуированные 2-го класса точности вместимостью 1,0; 2,0; 5,0; 10 см3 |
|
Цилиндры мерные 2-го класса точности вместимостью 25 и 50 см3 |
|
Термометр лабораторный шкальный, пределы измерения 0 - 55 °С |
ТУ 25-2021.003-88 |
Аспирационный аппарат и устройство для отбора проб воздуха |
|
Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.
Шкаф сушильный стерилизационный, позволяющий поддерживать температуру (160 ± 5) °С |
ТУ 9452-010-00141798-02 |
Термостаты, позволяющие поддерживать рабочую температуру (27 ± 2) °С и (37 ± 2) °С |
ТУ 9452-002-00141798-97 |
Автоклав электрический |
ГОСТ 9586-75 |
Стерилизаторы паровые медицинские |
|
Дистиллятор |
ТУ 4952-007-33142130-2000 |
Облучатель бактерицидный настенный |
ТУ 9444-015-03965956-08 |
Холодильник бытовой |
|
Микроскоп биологический с иммерсионной системой |
|
Лупа с увеличением ×10 |
|
Пробирки типов П1, П2 |
|
Спиртовки лабораторные стеклянные |
|
Чашки биологические (Петри) |
|
Воронки конусные диаметром 40 - 45 мм |
|
Груша резиновая |
ТУ 9398-005-0576-9082-03 |
Петля бактериологическая |
|
Марля медицинская |
ГОСТ 9412-77 |
Вата медицинская гигроскопическая |
ГОСТ 25556-81 |
Бумага фильтровальная лабораторная |
Примечание. Допускается применение оборудования и материалов с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.
Среда Сабуро |
|
Вода дистиллированная |
ГОСТ 6709-90 |
Натрий хлористый, хч |
|
Спирт этиловый ректификованный |
|
Спирт этиловый технический |
|
Бензилпенициллина натриевая соль |
|
Тетрациклин |
|
Примечание. Допускается использование других питательных сред и диагностических препаратов с аналогичными характеристиками.
При выполнении измерений концентрации клеток в воздухе рабочей зоны соблюдают следующие требования.
6.1. Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней: СП 1.3.2322-08.
6.2. Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней. Дополнения и изменения № 1 к СП 1.3.2322-08: СП 1.3.2518-09.
6.3. Правила техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.005-88.
6.4. Электробезопасность при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-79 и инструкции по эксплуатации прибора.
Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами.
К выполнению измерений и обработке их результатов допускают лиц с высшим или средним специальным образованием, прошедших соответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области микробиологических исследований.
Приготовление сред, подготовку к анализу проводят в следующих условиях:
- температура воздуха (20 ± 5) °С;
- атмосферное давление (760 ± 20) мм рт. ст.;
- влажность воздуха не более 80 %.
Для приготовления агаризованной среды Сабуро 62 г препарата размешивают в 1 дм3 воды, кипятят до полного растворения препарата и фильтруют через ватно-марлевый тампон. Стерилизуют среду в течение 15 мин при температуре (121 ± 1) °С. Для подавления роста посторонней микрофлоры в готовую и охлажденную до температуре (48 ± 2) °С среду добавляют по 100 мг бензилпенициллина и тетрациклина, после чего разливают в чашки Петри.
Среду хранят в герметично закрытой упаковке в помещении с относительной влажностью не более 60 % и температурой от 5 до 25 °С.
Отбор проб воздуха проводят с учетом требований ГОСТ 12.1.005-88 с изменением № 1 «ССБТ. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны» и ГОСТ 8.563-96. «ГСП. Методики выполнения измерений».
Для этого воздух аспирируют при помощи пробоотборника на поверхность плотной питательной среды в соответствии с технической документацией (инструкцией) на прибор. Время аспирации и объем отбираемого воздуха зависит от предполагаемой концентрации микроорганизма.
Аппарат перед каждым отбором пробы воздуха тщательно протирают 96 %-м этиловым спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенки прибора, наружную и внутреннюю стенки крышки. На подвижный диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо (количество питательной среды в чашки вносят в соответствии с инструкцией к прибору). После отбора пробы воздуха и остановки диска прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы.
При выполнении анализа воздуха стерильную среду Сабуро расплавляют, остужают до температуры (48 ± 2) °С и разливают в чашки Петри.
Контроль чистоты розлива проводят в соответствии с п. 7.1.1 МУК 4.2.2316-08. Для этого чашки с застывшей средой помещают в термостах при температуре 37 °С не менее чем на 18 часов. Проросшие чашки бракуют, стерильные чашки используют для контроля воздуха. Разлитую в чашки питательную среду хранят при температуре (2 - 8) °С не более 10 дней.
После отбора проб воздуха чашки Петри помещают в термостат с температурой (27 ± 2) °С. Через 1 - 2 суток проводят подсчет выросших колоний по культурально-морфологическим признакам.
Ростовые свойства используемой питательной среды должны быть проверены до проведения анализа воздуха в соответствии с требованиями к ростовым свойствам питательных сред, руководствуясь МУК 4.2.2316-08. Для этого эталонный музейный штамм Trichoderma asperellum OPF-19 высевается на 2 - 3 чашки используемой среды.
Лиофилизованную культуру музейного штамма необходимо использовать 2 - 3 пассажа во избежание потери заданных ей ростовых свойств.
Расчет концентрации клеток производят по формуле:
|
K - концентрация Trichoderma asperellum OPF-19 в воздухе, кл/м3;
П - количество типичных колоний, выросших на чашке Петри;
1000 - коэффициент пересчета на 1 м3 воздуха;
С - скорость аспирации воздуха, л/мин;
Т - время аспирации, мин.
Результаты измерений оформляют протоколом по нижеприведенной форме.
Протокол
№ _____ 1. Дата проведения анализа ___________________________________________________ 2. Рабочее место (профессия работающего) ______________________________________ 3. Место отбора пробы (название и адрес организации, производство, технологическая стадия, точка отбора пробы) __________________________________________________ 4. Вид пробоотборника _______________________________________________________ 5. Дата последней метрологической поверки оборудования для отбора проб __________ 6. Питательная среда, время инкубации _________________________________________ 7. Результаты испытания ростовых свойств питательной среды _____________________ 8. Количественная и качественная характеристика выросших колоний (количество типичных колоний) __________________________________________________________ 9. Результаты идентификации микроорганизмов Trichoderma asperellum OPF-19 (морфологические признаки) __________________________________________________ 10. Результаты расчета концентрации штамма ___________________________________ 11. Соотношение полученных результатов с уровнем ПДКв.р.з. _____________________ 12. Отбор пробы проведен (Ф. И. О., должность, дата, подпись) ____________________ 13. Идентификация штамма и расчет концентрации проведены (Ф. И. О., должность, дата, подпись) ______________________________________________________________ |