Государственное
санитарно-эпидемиологическое нормирование Федеральная
служба по надзору в сфере защиты прав потребителей 4.2.
МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И Микробиологическое измерение концентрации Методические указания Москва 2017 1. Разработаны и подготовлены ФГБОУ ВО «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Минздрава России (Н.И. Шеина). 2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере зашиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 22 декабря 2016 г. № 2). 3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере зашиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 22 февраля 2017 г. 4. Введены впервые. СОДЕРЖАНИЕ
4.2.
МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И Микробиологическое измерение концентрации Методические указания 1. Назначение и область применения1.1. Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода микробиологического количественного анализа концентрации Beijerinckia fluminensis Bf 2806 ВКПМ В-12258 в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 50 до 500000 клеток в 1 м3 воздуха. 1.2. Методические указания носят рекомендательный характер. 2. Биологическая характеристика штамма Beijerinckia
|
Царство |
Bacteria |
Подцарство |
Proteobacteria |
Класс |
Alphaproteobacteria |
Порядок |
Rhizobiales |
Семейство |
Beijerinckiaceae |
Род |
Beijermckia |
Вид |
fluminensis |
Штамм |
Bf2806 |
Культурально-морфологические особенности штамма: на среде Федорова штамм образует круглые, выпуклые, непрозрачные, бесцветные, слизистые колонии диаметром 2,0 - 4,0 мм, гладкие с ровным краем, тягучей консистенции. На агаризованной среде Бэрка - блестящие голубоватые колонии.
При микроскопировании через 18 ч при температуре 28 - 30 °С можно видеть мелкие подвижные палочковидные клетки 1,0×2,0 мкм, длина варьирует вплоть до кокковидиой формы. В зрелой культуре через 48 ч роста наблюдаются мелкие укороченные палочки, в основном одиночно расположенные. Эндоспор не образует. Клетки подвижны, имеют перитрихиальные жгутики. Грамотрицательные, каталазоположительные, непротеолитические, но могут использовать нитрат, аммиак и аминокислоты как источники азота, а крахмал и манит в качестве источников углеводов.
Штамм Beijernickia fluminensis Bf 2806 не является зоо- и фитопатогенным, не относится к микроорганизмам, патогенным для человека (СП 1.3.2322-08), депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под номером ВКПМ В-12258.
Предельно допустимая концентрация (ПДК) в воздухе рабочей зоны - 50000 кл/м3.
Методика обеспечивает выполнение измерений количества клеток в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 50 до 500000 клеток в 1 м3 воздуха при доверительной вероятности 0,95.
Прямой метод основан на аспирации из воздуха производственных помещений бактерий на среду Федорова и подсчете количества выросших колоний по типичным культурально-морфологическим признакам.
При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства и материалы, реактивы и питательные среды.
Барометр-анероид с диапазоном измерения атмосферного давления 5 - 790 мм рт. ст. и с пределом допустимой погрешности ±2,5 мм рт. ст. |
ТУ 2504-1799-75 |
Весы лабораторные, аналитические, наибольший предел взвешивания 110 г, предел допустимой погрешности ±0,2 мг |
|
Колбы мерные 2-100-2, 2-250-2, 2-1000-2 |
|
Пипетки градуированные 2-го класса точности вместимостью 1,0; 2,0; 5,0; 10 см3 |
|
Цилиндры мерные 2-го класса точности вместимостью 25 и 50 см3 |
|
Термометр лабораторный шкальный, пределы измерения 0 - 55 °С |
ТУ 25-2021.003-88 |
Аспирационный аппарат и устройство для отбора проб воздуха |
|
Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.
Шкаф сушильный стерилизационный, позволяющий поддерживать температуру (160 ± 5) °С |
ТУ 9452-010-00141798-02 |
Термостаты, позволяющие поддерживать рабочую температуру (28 ± 2) и (37 ± 2) °С |
ТУ 9452-002-00141798-97 |
Автоклав электрический |
ГОСТ 9586-75 |
Стерилизаторы паровые медицинские |
|
Дистиллятор |
ТУ 4952-007-33142130-2000 |
Облучатель бактерицидный настенный |
ТУ 9444-015-03965956-08 |
Холодильник бытовой |
|
Микроскоп биологический с иммерсионной системой и материалы |
|
Лупа с увеличением ×10 |
|
Пробирки типов П1, П2 |
|
Спиртовки лабораторные стеклянные |
|
Чашки биологические (Петри) |
|
Воронки конусные диаметром 40 - 45 мм |
|
Груша резиновая |
ТУ 9398-005-0576-9082-03 |
Петля бактериологическая |
|
Марля медицинская |
ГОСТ 9412-77 |
Вата медицинская гигроскопическая |
ГОСТ 25556-81 |
Бумага фильтровальная лабораторная |
Примечание. Допускается применение оборудования и материалов с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.
Агар микробиологический |
|
Аммоний молибденовокислый, хч |
|
Вода дистиллированная |
ГОСТ 6709-90 |
Железо сернокислое, хч |
|
Калий однозамещенный фосфорнокислый, хч |
|
Кальций углекислый, хч |
|
Кислота борная, хч |
|
Магний сернокислый, хч |
|
Марганец сернокислый 5-водный, чда |
|
Меласса свекловичная |
|
Натрий хлористый, хч |
|
Спирт этиловый ректификованный |
|
Спирт этиловый технический |
Примечание. Допускается использование других питательных сред и диагностических препаратов с аналогичными характеристикам.
При выполнении измерений концентрации клеток в воздухе рабочей зоны соблюдают требования, изложенные в следующих документах:
6.1. Санитарные правила «Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней»: СП 1.3.2322-08.
6.2. Дополнения и изменения № 1 к СП 1.3.2322-08: СП 1.3.2518-09.
6.3. Правила техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.005-88.
6.4. Электробезопасность при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-79 и инструкции по эксплуатации прибора.
Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами.
К выполнению измерений и обработке их результатов допускают лиц с высшим или средним специальным образованием, прошедших соответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области микробиологических исследований.
Приготовление сред, подготовку к анализу проводят в следующих условиях:
- температура воздуха (20 ± 5) °С;
- атмосферное давление (760 ± 20) мм рт. ст.;
- влажность воздуха не более 80 %.
Для приготовления агаризованной среды Федорова смешивают указанные компоненты (г/дм3: калий однозамещенный фосфорнокислый - 0,5 г, магний сернокислый - 0,3 г, натрий хлористый - 0,3 г, железо сернокислое - 0,005 г, марганец сернокислый - 0,005 г, аммоний молибденовокислый - 0,005 г, борная кислота - 0,005 г, кальций углекислый - 3,5 г, меласса - 30,0 г, агар-агар - 17,0 г. Сухие компоненты растворяют в 1,0 дм3 дистиллированной воды, тщательно перемешивают.
Смесь нагревают до растворения агара, стерилизуют автоклавированием при 121 °С в течение 15 мин и охлаждают до 60 °С. Приготовленную среду разливают в стерильные колбы по 250 - 500 см3 и автоклавируют при 121 °С в течение 15 мин.
Готовую среду хранят в защищенных от света условиях при температуре не выше 8 °С в течение 14 дней, не более.
Отбор проб воздуха проводят с учетом требований ГОСТ 12.1.005-88 с изменением № 1 «ССБТ. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны» и ГОСТ 8.563-96. «ГСИ. Методики выполнения измерений».
Для этого воздух аспирируют при помощи пробоотборника на поверхность плотной питательной среды в соответствии с технической документацией (инструкцией) на прибор. Время аспирации и объем отбираемого воздуха зависят от предполагаемой концентрации микроорганизма.
Аппарат перед каждым отбором пробы воздуха тщательно протирают 96 %-м этиловым спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенку прибора, наружную и внутреннюю стенки крышки. На подвижный диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо (количество питательной среды в чашки вносят в соответствии с инструкцией к прибору). После отбора пробы воздуха и остановки диска прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы.
При выполнении анализа воздуха прямым методом стерильную агаризованную среду (среда Федорова) расплавляют, остужают до 50 - 60 °С и разливают в чашки Петри.
Контроль чистоты розлива проводят в соответствии с п. 7.1.1 МУК 4.2.2316-08. Для этого чашки с застывшей средой помещают в термостат при температуре 37 °С не менее чем на 18 часов. Проросшие чашки бракуют, стерильные чашки используют для контроля воздуха. Разлитую в чашки питательную среду хранят при температуре 2 - 8 °С не более 10 дней.
После отбора проб воздуха чашки Петри помещают в термостат с температурой (28 ± 2) °С. Через 1 - 2 суток проводят подсчет выросших колоний по культурально-морфологическим признакам.
Ростовые свойства используемой питательной среды должны быть проверены до проведения анализа воздуха в соответствии с требованиями к ростовым свойствам питательных сред, руководствуясь МУК 4.2.2316-08. Для этого эталонный музейный штамм Beijerinckia fluminensis Bf 2806 ВКПМ В-12258 высевается на 2 - 3 чашки используемой среды.
Лиофилизованную культуру музейного штамма необходимо использовать 2 - 3 пассажа во избежание потери заданных ей ростовых свойств.
Расчет концентрации клеток проводят по формуле:
|
K - концентрация Beijerinckia fluminensis Bf 2806 ВКПМ В-12258 в воздухе, кл/м3;
П - количество типичных колоний, выросших на чашке Петри;
1000 - коэффициент пересчета на 1 м3 воздуха;
С - скорость аспирации воздуха, л/мин;
Т - время аспирации, мин.
Результаты измерений оформляют протоколом по нижеприведенной форме.
Протокол
№ _____ 1. Дата проведения анализа ___________________________________________________ 2. Рабочее место (профессия работающего) ______________________________________ 3. Место отбора пробы (название и адрес организации, производство, технологическая стадия, точка отбора пробы) __________________________________________________ 4. Вид пробоотборника _______________________________________________________ 5. Дата последней метрологической поверки оборудования для отбора проб __________ 6. Питательная среда, время инкубации _________________________________________ 7. Результаты испытания ростовых свойств питательной среды _____________________ 8. Количественная и качественная характеристика выросших колоний (количество типичных колоний) __________________________________________________________ 9. Результаты идентификации микроорганизмов Beijerinckia fluminensis Bf 2806 ВКПМ В-12258 (морфологические признаки) __________________________________________ 10. Результаты расчета концентрации штамма ___________________________________ 1 1. Соотношение полученных результатов с уровнем ПДКв.р.з. ____________________ 12. Отбор пробы проведен (Ф. И. О., должность, дата, подпись) ____________________ 13. Идентификация штамма и расчет концентрации проведены (Ф. И. О., должность, дата, подпись) ______________________________________________________________ |