Государственное санитарно-эпидемиологическое нормирование 4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ Измерение концентраций действующих Сборник методических указаний Москва 2013 1. Разработаны сотрудниками ГНУ «Всероссийский НИИ защиты растений» Россельхозакадемии, ФГУП «Всероссийский научно-исследовательский институт метрологии им. Д.И. Менделеева». 2. Введены в действие с момента утверждения. 3. Введены впервые. СОДЕРЖАНИЕ
4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ Измерение остаточных количеств
эсфенвалерата Методические
указания Свидетельство о метрологической аттестации от 24.02.2012 № 01.5.04.068/01.00043/2012. Настоящие методические указания устанавливают метод газожидкостной хроматографии для определения в семенах рапса (горчицы) массовой концентрации эсфенвалерата в диапазоне концентраций 0,01 - 0,1 мг/кг, в масле - 0,02 - 0,2 мг/кг. Название действующего вещества по ИСО: эсфенвалерат. Название действующего вещества по ИЮПАК: (S)-α'-циано-3-феноксибензил-(S)-2-(4-хлорфенил)-3-метилбутират. Структурная формула: Эмпирическая формула: С25Н22ClNO3. Молекулярная масса: 419,9. Химически чистый препарат - бесцветное кристаллическое вещество (до 23 °С). Температура плавления: 59,0 - 60,2 °С. Давление паров при 25 °С - 2 ∙ 10-4 mPa. Коэффициент распределения н-октанол/вода: Kow log P = 6,22 (25 °С). Растворимость: в воде при 25 °С - 0,002 мг/л; в н-гексане - 10 - 50; метаноле - 70 - 100; в ксилоле, ацетоне, хлороформе, этилацетате, DMSO, DMFA - > 600 (в г/кг при 25 °С). Вещество относительно стабильно на свету, стабильно к гидролизу при рН 5,7 и 9 (25 °С). Краткая токсикологическая характеристика Класс токсичности по ВОЗ - II, ЕПА - II. Острая пероральная токсичность (LD50) для крыс 75 - 88 мг/кг. Область применения Инсектицид широкого спектра действия (группа пиретроидов), применяется на зерновых, масличных, плодовых и других культурах. 1. Погрешность измеренийМетодика обеспечивает выполнение измерений с погрешностью, не превышающей ± 25 %, при доверительной вероятности 0,95. Метрологическая характеристика метода представлена в табл. 1 и 2. Таблица 1 Метрологические параметры
Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20, Р = 0,95) приведены в табл. 2. Таблица 2 Полнота определения эсфенвалерата в семенах и масле рапса (N = 5 для каждой концентрации)
2. Метод измеренийМетодика основана на извлечении эсфенвалерата из семян и масла рапса (горчицы) водно-ацетоновым раствором или ацетонитрилом с последующей очисткой перераспределением между двумя несмешивающимися жидкостями и на колонке с флорисилом. Количественное определение проводят методом газожидкостной хроматографии с использованием электронозахватного детектора. Нижний предел измерения эсфенвалерата в пробе семян 0,01 мг/кг, масла - 0,02 мг/кг, средняя полнота извлечения из семян 82,4 % и из масла 77,4 %. 3. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы3.1. Средства измерений
Примечание. Допускается использование средств измерения иных производителей с аналогичными или лучшими характеристиками. 3.2. Реактивы
Примечание. Допускается использование реактивов иных производителей с более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очистки растворителей. 3.3. Вспомогательные устройства, материалы
Примечание. Допускается применение оборудования иных производителей с аналогичными или лучшими техническими характеристиками. 4. Требования безопасности4.1. При проведении работы необходимо соблюдать требования безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими, легковоспламеняющимися веществами (ГОСТ 12.1.007-76). При выполнении измерений с использованием газового хроматографа и работе с электроустановками соблюдать правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-2009 и инструкциями по эксплуатации приборов. 4.2. Помещение лаборатории должно соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и 2.2.5.2308-07. Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004-90. 4.3. При работе с газами, находящимися в баллонах под давлением до 15 мПа (150 кгс/см2) необходимо соблюдать «Правила устройства и безопасной эксплуатации стационарных компрессорных установок, воздуховодов и газопроводов под давлением» ПБ 03-576-03. Запрещается открывать вентиль баллона, не установив на нем понижающий редуктор. 5. Отбор и хранение пробОтбор проб семян и масла рапса (горчицы) - ГОСТ 10852-86 «Семена масличные. Правила приемки и методы отбора проб». Для длительного хранения семена рапса (горчицы) подсушивают при комнатной температуре в отсутствие света. Сухие образцы могут храниться в течение года. Перед анализом пробы семян доводят до стандартной влажности и измельчают. Пробы масла рапса хранят в холодильнике при 0 - 4 °С в закрытой стеклянной таре не более 2 месяцев. 6. Подготовка к определению6.1. Подготовка и очистка реактивов и растворителей Перед началом работы рекомендуется проверить чистоту применяемых органических растворителей. Для этого 100 мл растворителя упаривают в ротационном вакуумном испарителе при температуре 40 °С до объема 1,0 см3 и хроматографируют. При обнаружении мешающих определению примесей очистку растворителей производят в соответствии с общепринятыми методиками. 6.2. Кондиционирование колонки Перед началом анализа колонку, заполненную хроматоном N-Super (0,125 - 0,160 мм) с 5 % SE-30, не присоединяя к детектору, кондиционируют в токе инертного газа (азот) при температуре 250 °С в течение 8 - 10 ч. 6.3. Приготовление стандартного и градуировочных растворов Берут точную навеску эсфенвалерата (50 мг), переносят в мерную колбу на 50 см3, растворяют навеску в ацетоне и доводят до метки (стандартный раствор с концентрацией 1,0 мг/см3). Градуировочные растворы с концентрациями 0,1; 0,2; 0,5; 1,0 и 2,0 мкг/см3 готовят методом последовательного разбавления по объему, используя для разбавления гексан. Стандартный раствор можно хранить в холодильнике при температуре 0 - 4 °С в течение 6 месяцев, градуировочные растворы - в течение недели. Для внесения в образец при определении полноты извлечения используют градуировочные растворы. 6.4. Построение градуировочного графика Для построения градуировочного графика (площадь пика - концентрация эсфенвалерата в растворе) в хроматограф вводят по 1 мм3 градуировочных растворов (не менее 3 параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4 точек по диапазону измеряемых концентраций), измеряют высоты или площади пиков и строят график зависимости среднего значения высоты (площади) пика от концентрации эсфенвалерата в градуировочном растворе (мкг/см3). Методом наименьших квадратов рассчитывают градуировочный коэффициент (К) в уравнении линейной регрессии: С = KS, где S - площадь пика градуировочного раствора. Градуировку признают удовлетворительной, если значение коэффициента линейной корреляции оказывается не ниже 0,99. Градуировочную характеристику необходимо проверять при замене реактивов, хроматографической колонки или элементов хроматографической системы, а также при отрицательном результате контроля градуировочного коэффициента. Градуировочную зависимость признают стабильной при выполнении следующего условия: где С - аттестованное значение массовой концентрации эсфенвалерата в градуировочном растворе; Ск - результат контрольного измерения массовой концентрации эсфенвалерата в градуировочном растворе; λконтр. - норматив контроля градуировочного коэффициента, % (λконтр. = 10 % при P = 0,95). 6.5. Подготовка колонки с флорисилом для очистки экстракта В нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см и внутренним диаметром 1 см помещают тампон из стекловаты и вносят суспензию 4,5 г флорисила в 20 см3 смеси гексан-этилацетат (1:1, по объему), дают растворителю стечь до верхнего края сорбента. Колонку промывают 25 см3 этой же смеси со скоростью 1 - 2 капли в секунду, после чего она готова к работе. 6.6. Проверка хроматографического поведения эсфенвалерата на колонке с флорисилом В круглодонную колбу емкостью 10 см3 отбирают 0,5 см3 стандартного раствора эсфенвалерата с концентрацией 1 мкг/см3. Отдувают растворитель током теплого воздуха, остаток растворяют в 2 см3 элюента № 1 и вносят в колонку. Колбу обмывают еще 2 см3 элюента № 1 и также вносят в колонку. Затем промывают колонку 25 см3 гексана и элюируют эсфенвалерат 60 см3 элюента № 2 со скоростью 1 - 2 капли в секунду. Отбирают фракции по 10 см3 каждая, упаривают досуха, остаток растворяют в 2 см3 гексана и анализируют на содержание эсфенвалерата по п. 2.6.4. Фракции, содержащие эсфенвалерат, объединяют, упаривают досуха, остаток растворяют в 2 см3 гексана и анализируют по п. 2.6.4. Рассчитывают содержание эсфенвалерата в элюате, определяя полноту вымывания вещества из колонки и необходимый для этого объем элюента. Примечание. Профиль вымывания эсфенвалерата может меняться при использовании новой партии сорбента. 6.7. Подготовка приборов и средств измерения Установка и подготовка всех приборов и средств измерения проводится в соответствии с требованиями технической документации. 7. Проведение определения7.1. Экстракция эсфенвалерата из семян рапса Навеску измельченных на лабораторной мельнице семян массой 10 г помещают в коническую колбу на 250 см3, заливают 50 - 100 см3 смеси растворителей ацетон-вода (в соотношении 1:1) и экстрагируют эсфенвалерат в ультразвуковой ванне в течение 15 мин. Экстракт фильтруют через бумажный фильтр («красная лента»). Экстракцию повторяют дважды 30 см3 той же смеси. Объединенный фильтрат помещают в делительную воронку и переэкстрагируют эсфенвалерат гексаном трижды порциями по 30 см3. Объединенные гексановые экстракты фильтруют через слой безводного сернокислого натрия. Полученный раствор выпаривают на ротационном испарителе при температуре бани 50 °С до полного удаления гексана. Далее проводят очистку экстрактов по п. 7.3. 7.2. Экстракция эсфенвалерата из рапсового масла Навеску масла 10 г растворяют в 60 см3 гексана и экстрагируют эсфенвалерат 50 см3 ацетонитрила в УЗ-ванне в течение 15 мин. Полученную смесь помещают в делительную воронку объемом 250 см3. После расслоения* нижний ацетонитрильный слой сливают, из верхнего гексанового слоя экстрагируют эсфенвалерат ацетонитрилом еще дважды порциями по 30 см3. К объединенному ацетонитрильному экстракту добавляют воду в соотношении ацетонитрил-вода (1:4) и переэкстрагируют эсфенвалерат хлороформом трижды порциями по 30 см3. Объединенные хлороформные экстракты сушат над безводным серно-кислым натрием и выпаривают досуха на ротационном испарителе при температуре 50 °С. Сухой остаток растворяют в 5 см3 ацетона и помещают в морозильную камеру с температурой -18 °С на 2 ч. Охлажденный ацетоновый раствор декантируют в круглодонную колбу на 10 см3 через фильтр «красная лента», после чего фильтр промывают 2 см3 ацетона. Полученный раствор упаривают на ротационном испарителе при температуре бани не выше 40 °С до полного удаления ацетона. Далее очистку проводят по п. 7.3. ______________ * В случае образования сравнительно стойких эмульсий можно добавить несколько мл насыщенного раствора хлористого натрия или этилового спирта. 7.3. Очистка экстрактов на колонке с флорисилом Остаток в колбе, полученный при упаривании очищенных по пп. 7.1 и 7.2 экстрактов семян или масла, количественно переносят двумя порциями по 2 см3 смеси гексан-этилацетат (1:1, по объему) в кондиционированную хроматографическую колонку (п. 6.2). Промывают колонку 25 см3 гексана, элюат отбрасывают. Эсфенвалерат элюируют 60 см3 элюента № 2 (гексан-этилацетат = 2:8). Весь элюат собирают в грушевидную колбу емкостью 100 см3. Раствор выпаривают досуха на ротационном испарителе при температуре не выше 50 °С. Сухой остаток растворяют в 1 - 2 см3 гексана и 1 мм3 раствора вводят в хроматограф. 7.4. Условия хроматографирования Газовый хроматограф «Цвет-550М» с ДПР (ДЭЗ). Колонка стеклянная 1 м×3 мм, заполненная хроматоном N-Super (0,125 - 0,160 мм) с 5 % SE-30. Температура колонки 240 °С, испарителя 250 °С, детектора 320 °С. Скорость газа-носителя (азот) через колонку 46 см3/мин. Шкала электрометра 8 ∙ 1010 (16 ∙ 1010). Объем вводимой пробы 1 мкл. Время удерживания эсфенвалерата 3 мин 20 с. Линейный диапазон детектирования 0,1 - 2 нг. 7.5. Обработка результатов анализа Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки, содержание эсфенвалерата в образце семян или масла (X, мг/кг) вычисляют по формуле: где Н1 - высота (площадь) пика эсфенвалерата в стандартном растворе, мм (мв ∙ с); Н2 - высота (площадь) пика эсфенвалерата в анализируемой пробе, мм (мв ∙ с); V - объём экстракта, подготовленного для хроматографирования, см3; Р - навеска анализируемого образца, г; С - концентрация эсфенвалерата в стандартном растворе, мкг/см3. Содержание остаточных количеств эсфенвалерата в анализируемом образце вычисляют как среднее из 2 параллельных определений. Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор эсфенвалерата 2 мкг/см3, разбавляют. 8. Проверка приемлемости результатов параллельных определенийЗа результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предел повторяемости: X1, X2 - результаты параллельных определений, мг/кг; r - значение предела повторяемости (r = 2,8σr). При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ. 9. Оформление результатовРезультат анализа представляют в виде: (X ± Д) мг/кг при вероятности Р = 0,95, где - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг; Δ - граница абсолютной погрешности, мг/кг: где δ - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %. В случае, если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде: содержание вещества в пробе «менее нижней границы определения» (например: менее 0,01 мг/кг*, где «*» - 0,01 мг/кг - предел обнаружения в семенах рапса). 10. Контроль качества результатов измеренийОперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1 - 6-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений». 10.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов. 10.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок. Величина добавки Сд должна удовлетворять условию: где - характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно), мг/кг, при этом: Δл = ±0,84Δ, где Δ - граница абсолютной погрешности, мг/кг: где δ - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %. Результат контроля процедуры Кк рассчитывают по формуле: Кк = Х' - Х - Сд, где X', X, Сд - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 4) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки соответственно, мг/кг. Норматив контроля К рассчитывают по формуле:
Проводят сопоставление результата контроля процедуры (Кк) с нормативом контроля (К). Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию процедуру анализа признают удовлетворительной. При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению. 10.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости. Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предел воспроизводимости (R): где (3) X1, Х2 - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг; R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций), %. 11. Требования к квалификации оператораИзмерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист-химик, имеющий опыт работы методом газожидкостной хроматографии, ознакомленный с руководством по эксплуатации хроматографа, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 10. 12. РазработчикиЦибульская И.А., Копытова Ф.И., Долженко О.В. (ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт защиты растений» Россельхозакадемии (ГНУ ВИЗР), Санкт-Петербург, Пушкин). |