Государственное санитарно-эпидемиологическое нормирование 4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ Измерение концентраций действующих Сборник
методических указаний Москва 2013 1. Разработаны сотрудниками ГНУ «Всероссийский НИИ защиты растений» Россельхозакадемии, ФГУП «Всероссийский научно-исследовательский институт метрологии им. Д.И. Менделеева». 2. Введены в действие с момента утверждения. 3. Введены впервые. СОДЕРЖАНИЕ
4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ Измерение остаточных количеств мепикват
хлорида Методические
указания Свидетельство о метрологической аттестации от 9.04.2012 № 01.5.04.072/01.00043/2012. Настоящие методические указания устанавливают метод измерения массовой доли мепикват хлорида в воде в диапазоне 0,001 - 0,01 мг/дм3, в почве 0,025 - 0,25 мг/кг, в зерне зерновых, семенах и масле рапса в диапазоне концентраций 0,02 - 0,2 мг/кг, в зеленой массе и соломе зерновых - 0,05 - 0,5 мг/кг. Название действующего вещества по ICO: мепикват хлорид. Название действующего вещества по IUPAC: 1,1-диметилпиперидин. Структурная формула:
Эмпирическая формула: С7Н16ClN. Молекулярная масса: 149,7. Гигроскопичные кристаллы без цвета и запаха. Температура плавления: > 300 °С. Давление паров при 20 °С < 1 ∙ 10-11 мПа. Коэффициент распределения н-октанол/вода: Kow log P = -3,55 (рН 7). Растворимость в воде при 20 °С > 50 % (вес); в органических растворителях (г/100 мл при 20 °С) - в метаноле 48,7, n-октаноле - 0,962, ацетонитриле - 0,280, дихлорметане - 0,051, ацетоне - 0,002, в толуоле, n-гептане и этилацетате - < 0,001. Стабилен в водных растворах (30 дней при рН 3, 5, 7 и 9, 25 °С). Стабилен при воздействии солнечного света. Краткая токсикологическая характеристика Острая оральная токсичность (LD50) для крыс - 270 мг/кг, подкожная > 1160 мг/кг, не ирритант для кожи и глаз (кролики); ингаляционная токсичность (LC50) для крыс - более 2,84 мг/дм3 воздуха (7 ч). Класс токсичности по ВОЗ - III. DT50 в почве 11 - 40 дней при 20 °С. Область применения препарата - регулятор роста растений. 1. Погрешность измеренийПри соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности Р = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций. Таблица 1 Метрологические параметры
Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в табл. 2. Таблица 2
2. Метод измеренийМетодика основана на определении мепикват хлорида методом ВЭЖХ с масс-спектрометрическим детектированием после его извлечения из образцов органическим растворителем с последующей очисткой на патронах с оксидом алюминия. Мепикват хлорид идентифицируют по абсолютному времени удерживания. Массовую концентрацию мепикват хлорида в пробе определяют в режиме автоматической обработки данных по построенной ранее градуировочной характеристике. Избирательность метода определения мепикват хлорида достигается сочетанием условий подготовки проб и хроматографического анализа с масс-спектрометрическим детектированием. 3. Средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и материалы3.1. Средства измерений
Примечание. Допускается использование средств измерения иных производителей с аналогичными или лучшими характеристиками. 3.2. Реактивы
Примечание. Допускается использование реактивов иных производителей с более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очистки растворителей. 3.3. Вспомогательные устройства и материалы
Примечание. Допускается применение оборудования иных производителей с аналогичными или лучшими техническими характеристиками. 4. Отбор и хранение пробОтбор проб производится в соответствии с «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов» (от 21.08.79 № 2051-79), а также в соответствии с ГОСТ Р 51592-2000 «Вода. Общие требования к отбору проб»; ГОСТ Р 50436-92 (ИСО 950-79) «Зерновые. Отбор проб зерна»; ГОСТ 28168- 89 «Почвы. Отбор проб»; ГОСТ 10852-86 «Семена масличные. Правила приемки и методы отбора проб». Пробы зерна и соломы для определения остатков в урожае хранят в бумажной или тканевой упаковке при комнатной температуре. Семена рапса хранят при комнатной температуре в полотняных мешочках, перед анализом доводят до стандартной влажности и измельчают. Растительное масло хранят в холодильнике при температуре 0 - 4 °С в герметично закрытой стеклянной таре в течение 2 месяцев. Для длительного хранения пробы почвы подсушиваются при комнатной температуре в отсутствие прямого солнечного света. Сухие почвенные образцы могут храниться в течение года. Перед анализом сухую почву доводят до стандартной влажности, просеивают через сито с отверстиями диаметром 1 мм, зерно и солому измельчают на лабораторных мельницах. 5. Подготовка к проведению измерений5.1. Подготовка и очистка реактивов и растворителей Перед началом работы проверяют чистоту применяемых органических растворителей. Для этого 100 см3 растворителя упаривают в ротационном вакуумном испарителе при температуре 40 °С до объёма 1,0 см3 и хроматографируют. При обнаружении мешающих определению примесей очистку растворителей производят в соответствии с общепринятыми методиками. 5.2. Кондиционирование колонки Перед началом анализа колонку (Zorbax Eclipse XDB-C18) кондиционируют в потоке подвижной фазы (0,6 см3/мин) до стабилизации нулевой линии в течение 1 - 2 ч. 5.3. Приготовление растворов для подготовки проб Раствор 2М HCl: в мерную колбу на 1000 см3 вносят 197 г 36 %-й соляной кислоты, добавляют бидистиллированную воду до метки и перемешивают. Раствор 6М HCl: в мерную колбу на 1000 см3 вносят 605 г 36 %-й соляной кислоты, добавляют бидистиллированную воду до метки и перемешивают. Смесь 6М HCl-MeOH (9:1): в конической колбе на 1000 см3 вносят 900 см3 6М соляной кислоты и добавляют 100 см3 метанола. Экстрагент № 1: в колбе на 1000 см3 смешивают 650 см3 бидистиллированной воды, 350 см3 метанола и 50 см3 2М НСl. Элюент № 1 для очистки на патроне: в колбе на 500 см3 смешивают 100 см3 метанола с 400 см3 ацетонитрила (1:4), элюента № 2 - смешивают 50 см3 метанола с 450 см3 ацетонитрила (1:9). Раствор гидроксида натрия 1М: в мерную колбу на 100 см3 помещают 4 г гидроксида натрия, растворяют в 100 см3 дистиллированной воды, доводят водой до метки и перемешивают. Подвижная фаза А: в мерную колбу на 1000 см3 помещают 1000 см3 бидистиллированной деионизованной воды, затем микродозатором вносят 1 см3 муравьиной кислоты. Подвижная фаза Б: в мерную колбу на 1000 см3 помещают 1000 см3 метилового спирта, затем микродозатором вносят 1 см3 муравьиной кислоты. Смесь метанола с ацетонитрилом: в колбе на 100 см3 с помощью мерных цилиндров смешивают 20 см3 метанола с 80 см3 ацетонитрила (смесь 1:4) и 10 см3 метанола с 90 см3 ацетонитрила (смесь 1:9). 5.4. Приготовление растворов для градуировки Основной раствор мепикват хлорида с массовой концентрацией 10 мкг/см3. Точную навеску мепикват хлорида массой (10 ± 0,1) мг помещают в мерную колбу вместимостью 100 см3 и добавляют около 90 см3 бидистиллированной воды. Содержимое колбы тщательно перемешивают, выдерживают 20 мин при температуре 20 °С, после чего добавляют воду до метки. Затем 10 см3 полученного раствора с концентрацией 100 мкг/см3 вносят в мерную колбу на 100 см3 и доводят до метки бидистиллированной водой - получен основной раствор с концентрацией 10 мкг/см3. Градуировочные растворы с концентрациями 1,0; 5,0; 10,0; 15,0; 20,0 и 25,0 нг/см3 готовят из основного раствора методом последовательного разбавления, используя подвижную фазу А. Раствор № 1 с концентрацией мепикват хлорида 25 нг/см3: в мерную колбу вместимостью 100 см3 вносят 0,25 см3 основного раствора и доводят объем до метки подвижной фазой А. Раствор № 2 с концентрацией мепикват хлорида 20 нг/см3: в мерную колбу вместимостью 100 см3 вносят ОД см3 основного раствора и доводят объем до метки подвижной фазой А. Раствор № 3 с концентрацией мепикват хлорида 15 нг/см3: в мерную колбу вместимостью 100 см3 вносят 0,15 см3 основного раствора и доводят объем до метки подвижной фазой А. Раствор № 4 с концентрацией мепикват хлорида 10 нг/см3: в мерную колбу вместимостью 10 см3 вносят 5,0 см3 раствора № 2 и доводят объем до метки подвижной фазой А. Раствор № 5 с концентрацией мепикват хлорида 5 нг/см3: в мерную колбу вместимостью 10 см3 вносят 5,0 см3 раствора № 4 и доводят объем до метки подвижной фазой А. Раствор № 6 с концентрацией мепикват хлорида 1 нг/см3: в мерную колбу вместимостью 10 см3 вносят 1 см3 раствора № 4 и доводят объем до метки подвижной фазой А. Основной и градуировочные растворы можно хранить в холодильнике при температуре 0 - 4 °С в течение месяца. Для внесения в контрольный образец при определении полноты извлечения используют основной раствор, разбавленный ацетонитрилом до нужного уровня концентраций методом последовательного разбавления. Растворы для внесения в масло готовят из основного раствора с концентрацией 100 мкг/см3 методом последовательного разбавления по объему изопропиловым спиртом. 5.5. Построение градуировочного графика Для каждого из градуировочных растворов регистрируют хроматограммы в условиях, указанных в п. 7 и определяют абсолютное время удерживания и площадь пика мепикват хлорида (в усл. ед.), соответствующего MRM (114→98). Одновременно в режиме автоматической обработки данных определяют соотношение площадей пиков, соответствующих MRM (11498) и MRM (114→58) (S98/S58). В режиме автоматической обработки данных строят градуировочную характеристику (площадь пика - концентрация мепикват хлорида в растворе). Для этого в хроматограф вводят по 10 мм3 градуировочных растворов (не менее 3 параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4 точек по диапазону измеряемых концентраций). Градуировочную характеристику необходимо проверять при замене реактивов, хроматографической колонки или элементов хроматографической системы, а также при отрицательном результате контроля градуировочного коэффициента: где λконтр. - норматив контроля градуировочного коэффициента, %. (λконтр. = 10 % при Р = 0,95). 5.6. Подготовка патронов с оксидом алюминия для очистки экстракта В картридж емкостью 10 см3 для твердофазной экстракции вносят 2,5 г оксида алюминия 2-й степени активности и уплотняют центрифугированием 10 мин при 8000 об./мин. Приготовление оксида алюминия 2-й степени активности: к 97 г Al2O3 (активность 1, влажность 0 %) добавляют 3 см3 воды и перемешивают в шейкере 2 ч при 300 rpm. Оксид алюминия готовят в день использования и хранят в эксикаторе. 5.7. Подготовка приборов и средств измерения Установка и подготовка всех приборов и средств измерения проводится в соответствии с требованиями технической документации. 6. Проведение определения6.1. Определение мепикватхлорида в воде Подщелачивают 25 см3 воды 1М раствором гидроксида натрия до рН 9 и пропускают через картридж с силикагелем (Диапак С) со скоростью 3 - 4 см3/мин. Мепикват хлорид элюирут от 5 см3 смеси 6М НСl-МеОН (9:1). Элюат выпаривают досуха. Сухой остаток растворяют в 5 см3 смеси (метиловый спирт : подвижная фаза А в соотношении 1:9) и 10 мм3 раствора вводят в жидкостный хроматограф. 6.2. Извлечение мепикват хлорида из почвы Навеску почвы (5 ± 0,1) г помещают в коническую колбу емкостью 250 см3 и добавляют 50 см3 дистиллированной воды. После перемешивания на аппарате для встряхивания в течение 5 мин в почвенную вытяжку добавляют карбонат магния до получения нейтральной реакции. В полученную смесь добавляют 100 см3 хлористого метилена и тщательно встряхивают. Затем ее выдерживают в ультразвуковой ванне в течение 10 мин и декантируют в делительную воронку на 250 см3 через стеклянную воронку с ватным фильтром. После разделения фаз нижний слой переносят в другую делительную воронку (верхний слой отбрасывают), добавляют к нему 50 см3 разбавленной соляной кислоты (125 см3 кислоты и 825 см3 воды) и энергично встряхивают в течение 1 мин. После разделения слоев водную фазу (верхний слой) собирают в колбу емкостью 100 см3. К органической фазе (оставшийся нижний слой) повторно добавляют 50 см3 разбавленной соляной кислоты. После разделения слоев водную фазу собирают в ту же колбу, органическую фазу отбрасывают. Из объединенной водной фазы (100 см3) отбирают аликвоту 2 см3 (1/50 экстракта) и упаривают ее на ротационном испарителе при температуре водяной бани 70 °С. Дальнейшую очистку проводят на патронах с оксидом алюминия по п. 6.7. 6.3. Извлечение мепикват хлорида из зерна Навеску измельченного зерна массой (5 ± 0,05) г помещают в коническую колбу емкостью 250 см3 и экстрагируют мепикват хлорид 100 см3 экстрагента № 1 (вода-метанол-2М НСl в соотношении 65:30:5) в ультразвуковой ванне в течение 10 мин. Затем в колбу добавляют 100 см3 бидистиллированной воды и энергично встряхивают колбу в течение 1 мин. Отбирают из колбы в пробирку 10 см3 смеси и центрифугируют 5 мин при 4000 об./мин. Затем отбирают из пробирки 4,0 см3 супернатанта и выпаривают до сухого остатка на роторном испарителе при 70 °С. Дальнейшую очистку проводят на патронах с оксидом алюминия по п. 6.7. 6.4. Извлечение мепикват хлорида из зеленой массы и соломы зерновых культур Навеску измельченной зеленой массы или соломы массой (5 ± 0,05) г помещают в коническую колбу емкостью 250 см3 и экстрагируют мепикват хлорид 100 см3 экстрагента № 1 (вода-метанол-2М HCl в соотношении 65:30:5) в ультразвуковой ванне в течение 10 мин. Затем в колбу добавляют 100 см3 бидистиллированной воды и энергично встряхивают колбу в течение 1 мин. Отбирают из колбы в пробирку 10 см3 смеси и центрифугируют 5 мин при 4000 об./мин. Затем отбирают из пробирки 2,5 см3 супернатанта и выпаривают до сухого остатка на роторном испарителе при 70 °С. Дальнейшую очистку проводят на патронах с оксидом алюминия по п. 6.7. 6.5. Извлечение мепикват хлорида из семян рапса Навеску измельченных семян массой (5 ± 0,05) г помещают в коническую колбу емкостью 250 см3 и экстрагируют мепикват хлорид 100 см3 экстрагента № 1 (вода-метанол-2М НСl в соотношении 65:30:5) в ультразвуковой ванне в течение 10 мин. Затем в колбу добавляют 100 см3 бидистиллированной воды и энергично встряхивают колбу в течение 1 мин. Отбирают из колбы в пробирку 10 см3 смеси и центрифугируют 5 мин при 4000 об./мин. Затем отбирают из пробирки 2,0 см3 супернатанта и выпаривают до сухого остатка на роторном испарителе при 70 °С. Дальнейшую очистку проводят на патронах с оксидом алюминия по п. 6.7. 6.6. Извлечение мепикват хлорида из масла рапса Навеску масла массой (5 ± 0,05) г помещают в коническую колбу емкостью 250 см3 и экстрагируют мепикват хлорид 100 см3 экстрагента № 1 (вода-метанол-2М HCl в соотношении 65:30:5) на ультразвуковой установке в течение 10 мин. Смесь помещают в делительную воронку емкостью 250 см3 и промывают двумя порциями хлористого метилена по 50 см3, встряхивая смесь каждый раз в течение 2 - 3 мин и собирая нижний водный слой. К водной фазе добавляют 100 см3 бидистиллированной воды и энергично встряхивают в течение 1 мин. Аликвоту полученного водного экстракта 2,0 см3 выпаривают досуха на роторном испарителе при 70 °С. Дальнейшую очистку проводят на патронах с оксидом алюминия по п. 6.7. 6.7. Очистка на патронах с оксидом алюминия Сухой остаток в колбе, полученный при упаривании экстрактов по пп. 6.2 - 6.6, растворяют в 1 см3 метанола в ультразвуковой ванне в течение 0,5 мин и добавляют 4 см3 ацетонитрила. Полученный раствор количественно переносят в подготовленный картридж для твердофазной экстракции и дают ему впитаться. Промывают картридж 1 раз 5 см3 смеси метанол-ацетонитрил (1:4), затем 3 раза по 5 см3 смесью метанол-ацетонитрил (1:9). Элюат от 4 промывок собирают в грушевидную колбу емкостью 100 см3. Раствор упаривают досуха на вакуумном ротационном испарителе при температуре не выше 40 °С. Сухой остаток растворяют в 1 см3 смеси метиловый спирт:подвижная фаза А (1:9 по объему) и 10 мм3 раствора вводят в жидкостный хроматограф. 7. Условия измерений7.1. Хроматографические условия измерений Колонка: Zorbax Eclipse XDB-C18 (150×4,6) мм, 5 мкм. Температура термостата колонки (30 ± 1) °С. Подвижная фаза А: вода + муравьиная кислота (1000 + 1, v/v). Подвижная фаза Б: метанол + муравьиная кислота (1000 + 1, v/v). Скорость потока элюента: 0,4 мл/мин. Объем вводимой пробы 10 мм3. Режим элюирования: градиентный:
7.2. Масс-спектрометрические условия измерений
7.3. Обработка результатов анализа Анализ проводят в тех же условиях, в которых проводили градуировку прибора. Каждый раствор хроматографируют не менее 2 раз (параллельные определения). Растворы анализируют непосредственно друг за другом. Мепикват хлорид идентифицируют по абсолютному времени удерживания, определенному ранее при градуировке (±0,3 мин). В режиме автоматической обработки данных определяют площади пиков мепикват хлорида (в усл. ед.), соответствующих MRM (114→98) и MRM (114→58). Соотношение S98/S58 не должно отличаться от найденного при градуировке более чем на 15 %. Массовую концентрацию (Сх, мкг/см3) мепикват хлорида в каждом из анализируемых растворов определяют в режиме автоматической обработки данных по построенной ранее градуировочной характеристике. Содержание мепикват хлорида в исследуемых образцах (X, мг/кг) вычисляют по формуле: где Сх - концентрация мепикват хлорида, найденная по градуировке, мкг/см3; V - объём пробы, подготовленной для хроматографического анализа, см3; А1 - аликвота анализируемого экстракта (2,0 см3 - для рапса и почвы, 2,5 см3 - для зеленой массы и соломы, 4 см3 - для зерна); А2 - общий объем экстракта (200 см3 - для рапса, зерна, зеленой массы и соломы и 100 см3 - для почвы); Р - навеска анализируемого образца, г (см3 для воды). Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор мепикват хлорида 25 нг/см3, разбавляют подвижной фазой А для ВЭЖХ. 8. Проверка приемлемости результатов параллельных определенийЗа результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предел повторяемости: X1, X2 - результаты параллельных определений, мг/кг; r - значение предела повторяемости (r = 2,8σr). При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ. 9. Оформление результатовРезультат анализа представляют в виде: (Х ± Δ) мг/кг при вероятности Р = 0,95, где X - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг; Δ - граница абсолютной погрешности, мг/кг: где δ - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %. В случае, если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде: «содержание вещества в пробе «менее нижней границы определения» (например: менее 0,02 мг/кг*, где «*» - 0,02 мг/кг - предел обнаружения мепикват хлорида в зерне). 10. Контроль качества результатов измеренийОперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1 - 6-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений». 10.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов. 10.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок. Величина добавки Сд должна удовлетворять условию: , где ± Δл,Х (±Δл,Х') - характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно), мг/кг, при этом: Δт = ±0,84Δ, где Δ - граница абсолютной погрешности, мг/кг: где δ - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %. Результат контроля процедуры Кк рассчитывают по формуле: Кк = Х' - Х - Сд, где X', X, Сд - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 4) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки, соответственно, мг/кг. Норматив контроля К рассчитывают по формуле:
Проводят сопоставление результата контроля процедуры (Кк) с нормативом контроля (К). Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию |Кк| ≤ К, (2) процедуру анализа признают удовлетворительной. При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению. 10.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости. Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предел воспроизводимости где (3) X1, Х2 - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг; R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций), %. 11. Требования безопасности11.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-2009, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф с масс-спектрометрическим детектором. 11.2. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией, соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленные ГН 2.2.5.1313-03 и 2.2.5.2308-07. Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004-90. 12. Требования к квалификации оператораИзмерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист-химик, имеющий опыт работы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием, ознакомленный с руководством по эксплуатации прибора, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 10. 13. РазработчикиДолженко В.И., Цибульская И.А., Берестецкий А.О. (ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт защиты растений» Россельхозакадемии, Санкт-Петербург). Крылов А.И., Лопушанская Е.М. (ФГУП «Всероссийский научно-исследовательский институт метрологии им. Д.И. Менделеева», Санкт-Петербург). |