4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Измерение концентраций действующих
веществ пестицидов в воде, почве, зеленой
массе, зерне и соломе зерновых культур,
семенах и масле рапса, зерне гороха,
семенах и масле льна

Сборник методических указаний
по методам контроля
МУК 4.1.3020-12; 4.1.3022-12;
4.1.3042-12; 4.1.3045-12

Москва 2013

1. Разработаны сотрудниками ГНУ «Всероссийский НИИ защиты растений» Россельхозакадемии, ФГУП «Всероссийский научно-исследовательский институт метрологии им. Д.И. Менделеева».

2. Введены в действие с момента утверждения.

3. Введены впервые.

СОДЕРЖАНИЕ

 

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Измерение остаточных количеств тебуконазола
в зерне гороха, семенах и масле льна
методом капиллярной газожидкостной хроматографии

Свидетельство о метрологической аттестации № 01.5.04.085/01.00043/2012.

Настоящие методические указания устанавливают метод капиллярной газожидкостной хроматографии для определения в зерне гороха, семенах и масле льна массовой концентрации тебуконазола в диапазоне концентраций 0,05 - 0,5 мг/кг.

Название действующего вещества по ИСО: тебуконазол.

Название действующего вещества по ИЮПАК: (RS)-1р-хлорфенил-4,4-диметил-3-(1Н-1,2,4-триазол-1-ил метил)пентан-3-ил.

Структурная формула:

Эмпирическая формула: C₁₆H₂₂ClN₃O.

Молекулярная масса: 307,8.

Химически чистый препарат - бесцветное кристаллическое вещество.

Температура плавления: 105 °С.

Давление паров при 20 °С - 1,7 ∙ 10^-3 mPa.

Коэффициент распределения н-октанол/вода: K_ow log P = 3,7 (20 °С)

Растворимость: в воде при 20 °С - 36 мг/дм³ (рН 5 - 9); гексане - < 0,1; изопропаноле, толуоле - 5 - 100; дихлорметане - > 200 (г/дм³ при 20 °С).

Вещество стабильно на свету, при повышенной температуре и гидролизу в чистой воде.

Краткая токсикологическая характеристика

Класс токсичности по ВОЗ - III, ЕПА - II.

Острая оральная токсичность (LD₅₀) для крыс 4000 мг/кг, дермальная - > 5000 мг/кг.

Гигиенические нормативы: МДУ в кукурузе (зерно) - 0,1 мг/кг, в сое (зерно, масло) - 0,1 мг/кг.

Область применения

Системный фунгицид широкого спектра действия для борьбы с болезнями листьев и колосьев зерновых (фузариоз, септориоз, ржавчина, мучнистая роса и др.), серой гнилью виноградной лозы, некоторыми заболеваниями сои, рапса, подсолнечника и др. Используется как протравитель семян на зерновых.

1. Погрешность измерений

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности Р = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

Таблица 1

Метрологические параметры

Таблица 2

Полнота извлечения тебуконазола, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для n = 20, Р = 0,95

2. Метод измерений

Методика основана на определении тебуконазола методом капиллярной ГЖХ с использованием термоионного детектора после его извлечения из образцов органическими растворителями с последующей очисткой перераспределением между двумя несмешивающимися жидкими фазами и на колонке с флорисилом.

Идентификация тебуконазола проводится по времени удерживания, количественное определение - методом абсолютной калибровки.

Избирательность метода обеспечивается сочетанием условий подготовки проб и хроматографирования.

3. Средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и материалы

3.1. Средства измерений

Примечание. Допускается использование средств измерения иных производителей с аналогичными или лучшими характеристиками.

3.2. Реактивы

Примечание. Допускается использование реактивов иных производителей с более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очистки растворителей.

3.3. Вспомогательное оборудование и материалы

Примечание. Допускается применение оборудования иных производителей с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4. Требования безопасности

4.1. При проведении работы необходимо соблюдать требования безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими, легковоспламеняющимися веществами (ГОСТ 12.1.007-76).

При выполнении измерений с использованием газового хроматографа и работе с электроустановками соблюдать правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-2009 и инструкциями по эксплуатации приборов.

4.2. Помещение лаборатории должно соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и 2.2.5.2308-07. Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004-90.

4.3. При работе с газами, находящимися в баллонах под давлением до 15 мПа (150 кгс/см²) необходимо соблюдать «Правила устройства и безопасной эксплуатации стационарных компрессорных установок, воздуховодов и газопроводов под давлением» ПБ-03-576-03. Запрещается открывать вентиль баллона, не установив на нем понижающий редуктор.

5. Требования к квалификации операторов

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист-химик, имеющий опыт работы методом капиллярной газожидкостной хроматографии, ознакомленный с руководством по эксплуатации хроматографа, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 12.

6. Условия измерений

При выполнении измерений выполняют следующие условия:

• процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 ± 5) °С и относительной влажности не более 80 %;

• выполнение измерений на газовом хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

7. Отбор и хранение проб

Отбор проб зерна гороха проводят в соответствии с ГОСТ 28674-90 «Горох. Требования по заготовке и поставке». Для длительного хранения аналитические пробы зерна гороха помещают в герметично закрытый двойной полиэтиленовый пакет и хранят в морозильной камере с температурой -18 °С.

Отбор семян льна масличного проводят в соответствии с ГОСТ 10582-76 и ГОСТ 10852-86 «Семена масличные. Правила приемки и методы отбора проб». Семена хранят при комнатной температуре в полотняных мешочках, перед анализом доводят до стандартной влажности и измельчают. Масло хранят в холодильнике при температуре 0 - 4 °С в герметично закрытой стеклянной таре не более 2 месяцев.

8. Подготовка к определению

8.1. Подготовка и очистка реактивов и растворителей

Перед началом работы рекомендуется проверить чистоту применяемых органических растворителей. Для этого 100 мл растворителя упаривают в ротационном вакуумном испарителе при температуре 40 °С до объема 1,0 см³ и хроматографируют. При обнаружении мешающих определению примесей очистку растворителей производят в соответствии с общепринятыми методиками.

8.2. Кондиционирование колонки

Перед началом анализа капиллярную колонку, не присоединяя к детектору, кондиционируют в токе инертного газа (азот) при температуре 250 °С до получения стабильной нулевой линии.

8.3. Приготовление растворов

8.3.1. Раствор ацетона 50 %-й: в мерную колбу объемом 1000 см³ помещают 500 см³ ацетона и доводят объем до метки дистиллированной водой.

8.3.2. Элюент № 1 для колоночной хроматографии: в мерной колбе объемом 100 см³ смешивают 50 см³ н-гексана и 50 см³ этилацетата.

8.3.3. Элюент № 2 для колоночной хроматографии: в мерной колбе объемом 100 см³ смешивают 70 см³ н-гексана и 30 см³ этилацетата.

8.3.4. Элюент № 3 для колоночной хроматографии: в мерной колбе объемом 100 см³ смешивают 30 см³ н-гексана и 70 см³ этилацетата.

8.4. Приготовление основного и градуировочных растворов

8.4.1. Основной раствор с концентрацией 0,5 мг/см³: точную навеску тебуконазола (50 ± 0,1) мг помещают в мерную колбу на 100 см³, растворяют в ацетоне и доводят до метки тем же растворителем.

Градуировочные растворы с концентрациями 0,25; 0,5; 1,0; 2,0; 2,5 и 5,0 мкг/см³ готовят методом последовательного разбавления основного раствора по объему, используя ацетон или гексан.

8.4.2. Раствор № 1 с концентрацией тебуконазола 5 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 100 см³ вносят 1 см³ основного раствора и доводят объем до метки ацетоном.

8.4.3. Раствор № 2 с концентрацией тебуконазола 2,5 мкг/см³: в мерную пробирку вместимостью 10 см³ вносят 5 см³ основного раствора и доводят объем до метки ацетоном.

8.4.4. Раствор № 3 с концентрацией тебуконазола 2 мкг/см³: в мерную пробирку вместимостью 10 см³ вносят 4 см³ раствора № 1 и доводят объем до метки ацетоном.

8.4.5. Раствор № 4 с концентрацией тебуконазола 1 мкг/см³: в мерную пробирку вместимостью 10 см³ вносят 5 см³ раствора № 3 и доводят объем до метки ацетоном.

8.4.6. Раствор № 5 с концентрацией тебуконазола 0,5 мкг/см³: в мерную пробирку вместимостью 10 см³ вносят 5 см³ раствора № 4 и доводят объем до метки гексаном.

8.4.7. Раствор № 6 с концентрацией тебуконазола 0,25 мкг/см³: в мерную пробирку вместимостью 10 см³ вносят 5 см³ раствора № 5 и доводят объем до метки гексаном.

Основной раствор можно хранить в холодильнике при температуре 0 - 4 °С в течение 6 месяцев, градуировочные растворы - в течение 2 недель.

Для внесения в образец семян льна или зерна гороха при определении полноты извлечения используют растворы тебуконазола, приготовленные из градуировочного раствора № 1 методом последовательного разбавления ацетоном.

Для внесения в образец масла льна при определении полноты извлечения используют растворы тебуконазола, приготовленные из градуировочного раствора № 2 методом последовательного разбавления гексаном.

8.5. Построение градуировочного графика

Для построения градуировочного графика (площадь пика - концентрация тебуконазола в растворе) в хроматограф вводят по 1 мм³ градуировочных растворов (не менее 3 параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4 точек по диапазону измеряемых концентраций), измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика (мв ∙ с) от концентрации тебуконазола в градуировочном растворе (мкг/см³).

Методом наименьших квадратов рассчитывают градуировочный коэффициент (К) в уравнении линейной регрессии:

С = KS, где

S - площадь пика в градуировочном растворе.

Градуировку признают удовлетворительной, если значение коэффициента линейной корреляции оказывается не ниже 0,99.

Градуировочную характеристику необходимо проверять при замене реактивов, хроматографической колонки или элементов хроматографической системы, а также при отрицательном результате контроля градуировочного коэффициента.

Градуировочную зависимость признают стабильной при выполнении следующего условия:

 где

С - аттестованное значение массовой концентрации тебуконазола в градуировочном растворе;

С_к - результат контрольного измерения массовой концентрации тебуконазола в градуировочном растворе;

λ_контр. - норматив контроля градуировочного коэффициента, % (λ_контр. = 10 % при Р = 0,95).

8.6. Подготовка колонки с флорисилом для дополнительной очистки экстракта

На дно стеклянной колонки длиной 25 см и внутренним диаметром 10 мм помещают тампон из стекловаты и вносят через воронку суспензию 4 г флорисила в 20 см³ элюента № 1, дают растворителю стечь до верхнего края сорбента, сверху наносят слой 5 - 10 мм безводного сульфата натрия и снова промывают колонку 20 см³ элюента № 1. Когда уровень растворителя достигнет верхнего слоя в колонке, кран закрывают. Колонка готова к работе.

8.7. Проверка хроматографического поведения тебуконазола на колонке с флорисилом

В круглодонную колбу емкостью 10 см³ отбирают 1 см³ раствора тебуконазола с концентрацией 5 мкг/см³, отдувают растворитель током азота, растворяют сухой остаток в 2 см³ элюента № 1 и вносят в колонку с флорисилом. Раствору дают впитаться, после чего через колонку последовательно пропускают 20 см³ гексана и 10 см³ элюента № 2, элюат отбрасывают. Затем пропускают 40 - 50 см³ элюента № 3, отбирая фракции по 10 см³ каждая, упаривают досуха, растворяют в 1 см³ ацетона и определяют концентрацию тебуконазола по п. 9.5. Фракции, содержащие тебуконазол, объединяют, упаривают досуха, растворяют в 1 см³ ацетона и анализируют по п. 9.5. Рассчитывают содержание тебуконазола, полноту вымывания тебуконазола из колонки и необходимый объем элюата № 3.

Примечание. Необходимо проверять профиль вымывания тебуконазола при использовании новой партии сорбента.

9. Проведение определения

9.1. Экстракция тебуконазола из зерна гороха

Навеску измельченного на лабораторной мельнице зерна гороха массой (10 ± 0,1) г помещают в коническую колбу на 100 см³, заливают 50 см³ 25 %-го водного ацетона и экстрагируют тебуконазол в ультразвуковой ванне в течение 15 мин. Суспензию фильтруют через складчатый бумажный фильтр «красная лента» на воронке Бюхнера. Экстракцию повторяют дважды порциями водного ацетона по 50 см³. Осадок из колбы переносят на фильтр, ополаскивают колбу 20 см³ водного ацетона и промывают им осадок.

Объединенный экстракт упаривают на ротационном испарителе при температуре не выше 40 °С до объема 10 см³. К полученному экстракту добавляют 40 см³ дистиллированной воды, 2 - 5 см³ насыщенного раствора хлористого натрия и экстрагируют тебуконазол по 30 см³ дихлорметана трижды, встряхивая смесь каждый раз в течение 2 - 3 мин в делительной воронке объемом 250 см³. Объединенный дихлорметановый экстракт пропускают через слой безводного сульфата натрия в колбу-концентратор объемом 250 см³ и выпаривают досуха на ротационном испарителе при температуре 40 °С. Сухой остаток растворяют в 1 см³ ацетона и 1 мм³ вводят в испаритель хроматографа.

При наличии мешающих примесей проводят дополнительную очистку на колонке с флорисилом по п. 9.4.

9.2. Экстракция тебуконазола из семян льна

Навеску измельченных семян льна массой (10 ± 0,1) г помещают в коническую колбу объемом 100 см³ и экстрагируют тебуконазол 50 см³ ацетонитрила в ультразвуковой ванне в течение 15 мин. Полученную суспензию фильтруют через складчатый фильтр «красная лента» на воронке Бюхнера. Экстракцию повторяют дважды порциями ацетонитрила по 30 см³. Осадок из конической колбы переносят на фильтр, ополаскивают колбу 20 см³ ацетонитрила и промывают осадок.

Объединенный ацетонитрильный экстракт семян льна промывают гексаном в делительной воронке дважды порциями по 25 см³, встряхивая воронку каждый раз в течение 1 - 2 мин и собирая нижний органический слой. Полученный экстракт упаривают на ротационном испарителе при температуре 40 °С до объема 10 см³, добавляют 40 см³ дистиллированной воды, 2 - 5 см³ насыщенного раствора хлористого натрия и экстрагируют тебуконазол 30 см³ дихлорметана трижды, встряхивая смесь каждый раз в течение 2 - 3 мин в делительной воронке объемом 250 см³. Объединенный дихлорметановый экстракт пропускают через слой безводного сульфата натрия в колбу-концентратор объемом 250 см³ и выпаривают досуха на ротационном испарителе при температуре 40 °С. Сухой остаток растворяют в 1 см³ ацетона и 1 мм³ вводят в испаритель хроматографа.

При наличии мешающих примесей проводят дополнительную очистку на колонке с флорисилом по п. 9.4.

9.3. Экстракция тебуконазола из льняного масла

Навеску масла (5 ± 0,1) г растворяют в 10 см³ гексана в конической колбе на 100 см³ в УЗ-ванне в течение 15 мин. Полученный экстракт количественно переносят в делительную воронку объемом 250 см³ и экстрагируют тебуконазол трижды ацетонитрилом порциями по 30 - 50 см³, встряхивая смесь каждый раз в течение 2 - 3 мин и собирая нижний ацетонитрильный слой.

Объединенный ацетонитрильный экстракт промывают гексаном и далее доводят до сухого остатка по п. 9.2.

При наличии мешающих примесей проводят дополнительную очистку на колонке с флорисилом по п. 9.4.

9.4. Очистка экстрактов на колонке с флорисилом

Сухой остаток, полученный по пп. 9.1 - 9.3, растворяют в 2 см³ элюента № 1 и количественно переносят в кондиционированную хроматографическую колонку (п. 8.6). Колонку промывают 20 см³ гексана и 10 см³ элюента № 2, элюат отбрасывают. Тебуконазол элюируют 40 см³ элюента № 3, элюат упаривают на вакуумном ротационном испарителе при температуре не выше 40 °С до сухого остатка. Сухой остаток растворяют в 1 см³ ацетона и хроматографируют.

9.5. Условия хроматографирования

Газовый хроматограф «Кристалл 2000 М» с ТИД, колонка кварцевая капиллярная длиной 30 м, диаметром 0,25 мм, неподвижная фаза НР-1, толщина слоя 0,25 мкм. Температура колонки программируется от 150 (15 с) до 250 °С со скоростью 20 °С/мин. Температура детектора 350 °С, испарителя 250 °С. Расход газа-носителя через колонку Г₁ (азот) - 1,4 см³/мин (деление потока 1:7,5), водорода - 14,4 см³/мин, воздуха - 200 см³/мин. Расход газа Г₃ (азот) - 10 см³/мин. Дозируемый объем - 1 мм³. Анализируемый объем - 1 см³. Время удерживания тебуконазола - 8 мин (35 ± 5) с.

Линейный диапазон детектирования 0,25 - 5 нг.

9.6. Обработка результатов анализа

Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки, содержание тебуконазола в образцах зерна гороха, семян или масла льна (X, мг/кг) вычисляют по формуле:

 где

Н₁ - высота (площадь) пика тебуконазола в стандартном растворе, мм (мв ∙ с);

Н₂ - высота (площадь) пика тебуконазола в анализируемой пробе, мм (мв ∙ с);

V - объём экстракта, подготовленного для хроматографирования, см³;

Р - навеска анализируемого образца, г;

С - концентрация тебуконазола в стандартном растворе, мкг/см³.

Содержание остаточных количеств тебуконазола в анализируемом образце вычисляют как среднее из 2 параллельных определений.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор тебуконазола 5 мкг/мл разбавляют ацетоном.

10. Проверка приемлемости результатов параллельных определений

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предел повторяемости:

 где                                                 (1)

X₁, X₂ - результаты параллельных определений, мг/кг;

r - значение предела повторяемости (r = 2,8σ_r).

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

11. Оформление результатов

Результат анализа представляют в виде:

 мг/кг при вероятности Р = 0,95, где

 - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

Δ - граница абсолютной погрешности, мг/кг:

 где

δ - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

В случае, если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

содержание вещества в пробе «менее нижней границы определения» (например: менее 0,05 мг/кг^*, где «^*» - 0,05 мг/кг - предел обнаружения тебуконазола в зерне гороха, семенах и масле льна).

12. Контроль качества результатов измерений

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1 - 6-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».

12.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

12.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

Величина добавки C_д должна удовлетворять условию:

С_д = Δ_л,Х + Δ_л,Х', где

±Δ_л,Х (±Δ_л,Х') - характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно), мг/кг, при этом:

Δ_л = ± 0,84Δ, где

Δ - граница абсолютной погрешности, мг/кг:

 где

δ - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

Результат контроля процедуры К_к рассчитывают по формуле:

К_к = Х' - Х - С_д, где

X', X, С_д - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 4) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки соответственно, мг/кг.

Норматив контроля К рассчитывают по формуле:

Проводят сопоставление результата контроля процедуры (К_к) с нормативом контроля (К).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию

|К_к| < К,                                                              (2)

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.

12.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предел воспроизводимости (2):

 где                                              (3)

X₁, X₂ - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций), %.

13. Разработчики

Долженко В.И., Цибульская И.А., Карпова Л.М. (ГНУ «Всероссийский НИИ защиты растений» Россельхозакадемии)