Государственное санитарно-эпидемиологическое нормирование 4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ Измерение концентраций действующих Сборник методических указаний МУК 4.1.3021-12; 4.1.3043-12 Москва 2013 1. Разработаны сотрудниками ГНУ «Всероссийский НИИ защиты растений» Россельхозакадемии. 2. Введены в действие с момента утверждения. 3. Введены впервые. СОДЕРЖАНИЕ
4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ Измерение концентраций флуксапироксада в
воде, Методические указания МУК 4.1.3021-12 Свидетельство о метрологической аттестации от 11.10.2011 № 01.5.04.035/01.00043/2011. Настоящие методические указания устанавливают метод высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения массовой концентрации флуксапироксада в воде - в диапазоне концентраций 0,001 - 0,005 мг/дм3, в почве и зерне - в диапазоне концентраций 0,005 - 0,05 мг/кг, в зеленой массе - 0,02 - 0,1 мг/кг, соломе - 0,05 - 0,25 мг/кг. Название действующего вещества по номенклатуре ICO: флуксапироксад. Название действующего вещества по номенклатуре IUPAC: ( ± )3-(дифторметил)-1-метил-М(3¢,4¢,5¢-трифтор[1,1¢-бифенил]-2-ил)-1Н-пиразол-4-карбоксамид. Структурная формула:
Брутто формула: C18H12F5N3O. Молекулярная масса: 381. Химически чистое вещество представляет собой кристаллический порошок бежевого цвета без запаха. Температура плавления: > 157 °С. Давление пара 1,1×10-7 мРа. Коэффициент распределения в системе н-октанол-вода КowlgP > 3,0 (20 °С). Растворимость в воде (мг/дм3, 20 °С): 3,88. Растворимость в органических растворителях (г/дм3, 20 °С): ацетон ® 250; ацетонитрил, дихлорметан, этилацетат ® 100; метанол - 53,4; толуол - 20,0. Гидролитически стабилен в водных растворах при рН 4 - 9. Краткая токсикологическая характеристика Острая пероральная - ЛД50 > 2000 мг/кг массы тела. Острая кожная - ЛД50 > 2000 мг/кг массы тела. Острая ингаляционная - ЛК50 (4 ч) > 5,1 мг/л. Раздражающее действие - кролики: кожа - не раздражает; глаза - не раздражает. Сенсибилизация - не обладает. Область применения Фунгицид для обработки вегетирующих растений против комплекса болезней зерновых культур. 1. Погрешность измеренийПри соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности Р = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1, для соответствующих диапазонов концентраций. Таблица 1 Метрологические параметры
Таблица 2 Полнота извлечения флуксапироксада, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для п = 20, Р = 0,95
2. Метод измеренийМетодика основана на: определении флуксапироксада методом ВЭЖХ с использованием УФ-детектора после его твердофазной экстракции из воды или жидкостной экстракции из образцов почвы, зеленой массы и соломы ацетонитрилом в присутствии ацетатного буфера, насыщенного сульфатом магния, и обеспечивающего разделение водной и органической фаз; очистке ацетонитрильного экстракта с помощью дисперсионной твердофазной экстракции при одновременном удалении воды безводным сульфатом магния. При анализе зерна используют «Набор для пробоподготовки по методу QuEChERS Interlab VetexQ для обычных овощей, фруктов и зерна (кат. № IL-5056)» с дополнительной очисткой на патронах с силикагелем. Идентификация флуксапироксада проводится по времени удерживания, количественное определение - методом абсолютной калибровки. Избирательность метода обеспечивается сочетанием условий подготовки проб и хроматографирования. 3. Средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и материалы3.1. Средства измерений
Примечание. Допускается использование средств измерения иных производителей с аналогичными или лучшими характеристиками. 3.2. Реактивы
Примечание. Допускается использование реактивов иных производителей с более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очистки растворителей. 3.3. Вспомогательные устройства и материалы
Примечание. Допускается применение оборудования иных производителей с аналогичными или лучшими техническими характеристиками. 4. Требования безопасности4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-2009, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф. 4.2. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией, соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и 2.2.5.2308-07. Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004-90. 5. Требования к квалификации операторовИзмерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист-химик, имеющий опыт работы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, ознакомленный с руководством по эксплуатации хроматографа, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 13. 6. Условия измеренийПри выполнении измерений выполняют следующие условия: • процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 ± 5) °С и относительной влажности не более 80 %; • выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору. 7. Подготовка к определению7.1. Кондиционирование колонки Перед началом анализа колонку (Acquity ВЕН С18 и Acquity Shield RP18) кондиционируют в потоке подвижной фазы (0,1 - 0,2 см3/мин) до стабилизации нулевой линии. 7.2. Приготовление растворов 7.2.1. Раствор 0,005 М ортофосфорной кислоты: (0,5 ± 0,01) г 98 %-й ортофосфорной кислоты помещают в мерную колбу объемом 1 дм3, растворяют в бидистиллированной воде и доводят объем до метки. 7.2.2. Для приготовления подвижной фазы смешивают ацетонитрил с 0,005 М раствором ортофосфорной кислоты в соотношении 50:50 по объёму, используя мерные цилиндры. 7.2.3. Приготовление элюента № 1: в колбе на 100 см3 смешивают 80 см3 н-гексана и 20 см3 этилацетата, используя мерные цилиндры. 7.2.4. Приготовление элюента № 2: в колбе на 100 см3 смешивают 50 см3 н-гексана и 50 см3 этилацетата, используя мерные цилиндры. 7.3. Приготовление основного и градуировочных растворов 7.3.1. Основной раствор с концентрацией 0,5 мг/см3: точную навеску флуксапироксада (50 ± 0,5) мг помещают в мерную колбу вместимостью 100 см3, растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки ацетонитрилом. 7.3.2. Приготовление градуировочных растворов (анализ на колонке Acquity ВЕН С18). Градуировочные растворы с концентрациями флуксапироксада 0,02; 0,04; 0,06; 0,08 и 0,1 мкг/см3 готовят методом последовательного разбавления по объему, используя раствор подвижной фазы (смесь ацетонитрила и 0,005 М ортофосфорной кислоты в соотношении 50:50). 7.3.2.1. Раствор № 1 с концентрацией 0,1 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 100 см3 вносят 1 см3 основного раствора и доводят до метки подвижной фазой (5 мкг/см3). В другую мерную колбу вместимостью 100 см3 переносят 2,0 см3 полученного раствора. Объем вновь доводят до метки подвижной фазой (0,1 мкг/см3). 7.3.2.2. Раствор № 2 с концентрацией 0,08 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 10 см3 помещают 8,0 см3 раствора № 1 и доводят объем до метки подвижной фазой. 7.3.2.3. Раствор № 3 с концентрацией 0,06 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 10 см3 помещают 6 см3 раствора № 1 и доводят объем до метки подвижной фазой. 7.3.2.4. Раствор № 4 с концентрацией 0,04 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 10 см3 помещают 4 см3 раствора № 1 и доводят объем до метки подвижной фазой. 7.3.2.5. Раствор № 5 с концентрацией 0,02 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 10 см3 помещают 2 см3 раствора № 1 и доводят объем до метки подвижной фазой. 7.3.3. Приготовление градуировочных растворов (анализ на колонке Acquity Shield RP18). Градуировочные растворы с концентрациями флуксапироксада 0,01, 0,02, 0,05, 0,1 и 0,2 мкг/см3 готовят методом последовательного разбавления по объему, используя раствор подвижной фазы (смесь ацетонитрила и 0,005 М ортофосфорной кислоты в соотношении 50:50). 7.3.3.1. Раствор № 1 с концентрацией 5,0 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 100 см3 вносят 1 см3 основного раствора и доводят до метки подвижной фазой. 7.3.3.2. Раствор № 2 с концентрацией 0,2 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 100 см3 вносят 4,0 см3 раствора № 1 и доводят до метки подвижной фазой. 7.3.3.3. Раствор № 3 с концентрацией 0,1 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 100 см3 вносят 2,0 см3 раствора № 1 и доводят до метки подвижной фазой. 7.3.3.4. Раствор № 4 с концентрацией 0,05 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 10 см3 помещают 5 см3 раствора № 3 и доводят объем до метки подвижной фазой. 7.3.3.5. Раствор № 5 с концентрацией 0,02 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 10 см3 помещают 2 см3 раствора № 3 и доводят объем до метки подвижной фазой. 7.3.3.6. Раствор № 6 с концентрацией 0,01 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 10 см3 помещают 1 см3 раствора № 3 и доводят объем до метки подвижной фазой. Основной раствор можно хранить в холодильнике при температуре 0 - 4 °С в течение 1 месяца, градуировочные растворы - в течение суток. При изучении полноты определения флуксапироксада в воде, почве, зерне, зеленой массе и соломе зерновых культур используют ацетонитрильные растворы вещества, приготовленные из основного раствора методом последовательного разбавления по объему ацетонитрилом. 7.4. Построение градуировочного графика Дня установления градуировочной характеристики (площадь пика - концентрация флуксапироксада в растворе) в хроматограф вводят по 10 мм3 градуировочных растворов (не менее 3 параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4 точек по диапазону измеряемых концентраций). Затем измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации флуксапироксада в градуировочном растворе. Методом наименьших квадратов рассчитывают градуировочный коэффициент (К) в уравнении линейной регрессии: C = KS, где S - площадь пика градуировочного раствора. Градуировку признают удовлетворительной, если значение коэффициента линейной корреляции оказывается не ниже 0,99. Градуировочную характеристику необходимо проверять при замене реактивов, хроматографической колонки или элементов хроматографической системы, а также при отрицательном результате контроля градуировочного коэффициента. Градуировочную зависимость признают стабильной при выполнении следующего условия: где С - аттестованное значение массовой концентрации флуксапироксада в градуировочном растворе; Ск - результат контрольного измерения массовой концентрации флуксапироксада в градуировочном растворе; lконтр. - норматив контроля градуировочного коэффициента, % (lконтр. = 10 % при Р = 0,95). 8. Отбор проб и хранениеОтбор проб производится в соответствии с «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов» (от 21.08.79 № 2051-79), а также в соответствии с ГОСТ Р 51592-2000 «Вода. Общие требования к отбору проб»; ГОСТ Р 50436-92 (ИСО 950-79) «Зерновые. Отбор проб зерна»; ГОСТ 28168-89 «Почвы. Отбор проб». Пробы зерна и соломы для определения остатков в урожае хранят в бумажной или тканевой упаковке при комнатной температуре. Для длительного хранения пробы почвы подсушиваются при комнатной температуре в отсутствие прямого солнечного света. Сухие почвенные образцы могут храниться в течение года. Перед анализом сухую почву доводят до стандартной влажности, просеивают через сито с отверстиями диаметром 1 мм, зерно и солому измельчают на лабораторных мельницах. 9. Проведение определения9.1. Определение флуксапироксада в воде Через патрон Диапак С16 пропускают 50 см3 воды. Фильтрат отбрасывают. Флуксапироксад элюируют 3 см3 ацетона. Элюат упаривают досуха на вакуумном ротационном испарителе при температуре бани не выше 40 °С. Сухой остаток растворяют в 2,5 см3 подвижной фазы. 10 мм3 полученного раствора вводят в хроматограф. 9.2. Определение флуксапироксада в зеленой массе и соломе зерновых культур В полипропиленовую центрифужную пробирку вместимостью 50 см3 помещают 10 г измельченной зеленой массы или 4 г соломы, прибавляют 10 см3 воды, 10 см3 ацетонитрила, 0,1 см3 ледяной уксусной кислоты, 4 г безводного магния серно-кислого и 1 г натрия уксусно-кислого. Пробирку плотно закрывают пробкой, встряхивают на аппарате в течение 15 мин и центрифугируют при скорости 8000 об./мин в течение 10 мин. Супернатант декантируют и количественно переносят в другую тефлоновую центрифужную пробирку. Если супернатант декантировать не удается, то массу фильтруют на воронке Бюхнера через бумажный фильтр «красная лента». Измеряют объем супернатанта или фильтрата и прибавляют к нему силикагель и безводный магний серно-кислый из расчета 50 мг силикагеля, 150 мг магния серно-кислого на 1 см3 супернатанта. При работе с образцами зеленой массы или соломы к супернатанту также прибавляют активированный уголь из расчета 7,5 мг на 1 см3 супернатанта. Пробирку плотно закрывают пробкой, встряхивают на аппарате 15 мин и центрифугируют при скорости 8000 об./мин в течение 10 мин. Количественно отбирают с помощью шприца верхний ацетонитрильный слой, переносят его в мерную колбу вместимостью 10 см3 и доводят объем до метки водой. 10 мм3 полученного раствора вводят в хроматограф. 9.3. Определение флуксапироксада в почве В полипропиленовую центрифужную пробирку вместимостью 50 см3 помещают 10 г просеянной почвы, прибавляют 3 см3 воды для смачивания пробы, через 2 мин прибавляют 10 см3 воды, 10 см3 ацетонитрила, 0,1 см3 ледяной уксусной кислоты, 4 г безводного магния серно-кислого и 1 г натрия уксусно-кислого. Пробирку плотно закрывают крышкой, встряхивают на аппарате в течение 15 мин и центрифугируют при скорости 4000 об./мин в течение 10 мин. Отбирают 5 см3 верхнего ацетонитрильного слоя и переносят его в полипропиленовую центрифужную пробирку вместимостью 15 см3, содержащую 250 мг силикагеля и 750 мг безводного магния серно-кислого. Пробирку плотно закрывают крышкой, встряхивают на аппарате 10 мин и центрифугируют при скорости 4000 об./мин в течение 10 мин. Аликвоту 2 см3 переносят в круглодонную колбу и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе, остаток очищают на патроне Диапак С. 9.4. Определение флуксапироксада в зерне В полипропиленовую центрифужную пробирку вместимостью 50 см3 помещают 10 г измельченного зерна, добавляют 15 см3 воды, 10 см3 ацетонитрила и содержимое влагонепроницаемого пакета из «Набора для пробоподготовки по методу QuEChERS Interlab VetexQ для обычных овощей, фруктов и зерна (кат. № IL-5056)». Пробирку плотно закрывают, встряхивают на аппарате в течение 15 мин, центрифугируют при скорости 4000 об./мин в течение 10 мин. Отбирают 5 см3 верхнего ацетонитрильного слоя и переносят в полипропиленовую центрифужную пробирку из набора вместимостью 15 см3, содержащую сорбент. Пробирку плотно закрывают, встряхивают на аппарате в течение 15 мин, центрифугируют при скорости 4000 об./мин в течение 10 мин. Аликвоту 2 см3 переносят в круглодонную колбу и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе, остаток очищают на патроне Диапак С. 9.5. Очистка на патроне Диапак С 9.5.1. Кондиционирование патрона Диапак С Патрон с силикагелем Диапак С промывают 2 см3 элюента № 2, затем 3 см3 гексана. 9.5.2. Дополнительная очистка проб почвы и зерна на патронах Диапак С Сухой остаток, полученный по пп. 9.4 или 9.5 растворяют в 1 см3 гексана, наносят на предварительно кондиционированный патрон, колбу ополаскивают 1 см3 гексана и так же наносят на патрон. Патрон промывают 6 см3 элюента № 1, элюат отбрасывают. Флуксапироксад элюируют 3 см3 смеси № 2, элюат собирают, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе, остаток растворяют в 1 см3 подвижной фазы и 10 мм3 вводят в хроматограф. 9.6. Условия хроматографирования 9.6.1. Условия анализа проб воды, зеленой массы и соломы Ультраэффективный жидкостный хроматограф «ACQUITY» фирмы Waters с быстросканирующим УФ-детектором, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки. Аналитическая колонка ACQUITY UPLC ВЕН С18 (2,1´100) мм, 1,7 мкм (Waters). Температура колонки (30 ± 1) °С. Подвижная фаза: смесь ацетонитрила и 0,005 М ортофосфорной кислоты в соотношении 50:50. Скорость потока элюента: 0,2 см3/мин. Рабочая длина волны УФ-детектора 230 нм. Объем вводимой пробы 10 мм3. Время удерживания флуксапироксада (4,8 ± 0,1) мин. 9.6.2. Условия анализа проб почвы и зерна Ультраэффективный жидкостный хроматограф «ACQUITY» фирмы Waters с быстросканирующим УФ-детектором, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки. Аналитическая колонка ACQUITY SHIELD RP 18 (2,1´100) мм, 1,7 мкм (Waters). Температура колонки (30 ± 1) °С. Подвижная фаза: смесь ацетонитрила и 0,005 М ортофосфорной кислоты в соотношении 50:50. Скорость потока элюента: 0,2 см3/мин. Рабочая длина волны УФ-детектора 230 нм. Объем вводимой пробы 10 мм3. Время удерживания флуксапироксада (5,0 ± 0,1) мин. Линейный диапазон детектирования сохраняется в интервале концентраций (0,01 - 0,2) мкг/см3. 10. Обработка результатов анализаКоличественное определение проводят методом абсолютной калибровки. Содержание флуксапироксада в воде, почве, зеленой массе, зерне и соломе зерновых (X, мг/кг) вычисляют по формуле: где Sx - площадь пика флуксапироксада на хроматограмме испытуемого образца, мм2 (AU); К - градуировочный коэффициент, найденный на стадии построения соответствующей градуировочной зависимости; V - объём пробы, подготовленной для хроматографического анализа, см3; Р - навеска анализируемого образца, г; F - полнота извлечения флуксапироксада, приведенная в табл. 2, %. Содержание остаточных количеств флуксапироксада в образце вычисляют как среднее из двух параллельных определений. Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор флуксапироксада с концентрацией 0,2 мкг/см3, разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ. 11. Проверка приемлемости результатов параллельных определенийЗа результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предел повторяемости: X1, Х2 - результаты параллельных определений, мг/кг; r - значение предела повторяемости (r = 2,8sr). При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ. 12. Оформление результатовРезультат анализа представляют в виде: мг/кг при вероятности Р = 0,95, где - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг; D - граница абсолютной погрешности, мг/кг; где d - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %. В случае, если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде: «содержание вещества в пробе «менее нижней границы определения» (например: менее 0,005 мг/кг*, где «*» - 0,005 мг/кг - предел обнаружения флуксапироксада в почве и зерне зерновых). 13. Контроль качества результатов измеренийОперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1 - 6-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений». 13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов. 13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок. Величина добавки Сд должна удовлетворять условию: где , () - характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой, соответственно), мг/кг; при этом: Dл = ± 0,84D, где D - граница абсолютной погрешности, мг/кг: где d - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %. Результат контроля процедуры Кк рассчитывают по формуле:
, , Сд - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки соответственно, мг/кг. Норматив контроля К рассчитывают по формуле
Проводят сопоставление результата контроля процедуры (Кк) с нормативом контроля (K). Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию процедуру анализа признают удовлетворительной. При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению. 13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости. Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предел воспроизводимости (R): где (3) X1, Х2 - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг; R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций), %. 14. РазработчикиДолженко В.И., Цибульская И.А., Журкович И.К., Черменская Т.Д., Комарова А.С. (ГНУ Всероссийский НИИ защиты растений Россельхозакадемии). |