Федеральная
служба по надзору в сфере защиты прав потребителей 4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ Определение остаточных Сборник методических указаний 1. Разработаны Московской сельскохозяйственной академией им. К.А. Тимирязева, Учебно-научным консультационным центром «Токсикология пестицидов и агрохимикатов» (Калинин В.А., Калинина Т.С., Рыбакова О.И., Калинин А.В.). 2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по санитарно-гигиеническому нормированию Минздрава России (протокол № 1 от 31 марта 2005 г.). 3. Утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 21 апреля 2005 г. 4. Введены в действие с 1 июля 2005 г. 5. Введены впервые. СОДЕРЖАНИЕ
4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ Определение остаточных количеств протиоконазола Методические указания 1. Вводная частьДействующее вещество: протиоконазол (JAU 6476) 2-[(2К8)-2-(1-хлорциклопропил)-3-(2-хлорфенил)-2-оксипропил]-2Н-1,2, 4-триазол-3(4Н)-тион (ИЮПАК) 2-[2-(1-хлорциклопропил)-3-(2-хлорфенил)-2-оксипропил]-1,2-дигидро-3Н-1,2,4-триазол-3-тион (С.А.). Структурная формула: Эмпирическая формула: C14H15Cl2N3OS. Молекулярная масса: 344,3. Бесцветное или светло-бежевое твердое вещество без запаха. Температура плавления: 139,1 - 144,5 °С. Давление паров при 20 °С: << 4×10-7 Па. Коэффициент распределения н-октанол/вода: KowlogP = 4,16 (рН 4), 3,82 (рН 7) и 2,0 (рН 9). Растворимость (г/л) при 20 °С: ацетон - более 250, этилацетат - более 250, дихлорметан - 88, ацетонитрил - 69; растворимость в воде - 0,005 (рН 4), 0,3 (рН 8) и 2,0 (рН 9). Вещество стабильно при хранении на воздухе, а также в кислой (DT50 = 120 дней) и щелочной (DT50 = > 1 года) средах. В присутствии света в водных фотолитических условиях протиоконазол достаточно быстро деградирует с периодом полураспада 47,7 ч. Краткая токсикологическая характеристика Острая пероральная токсичность (LD50) для крыс - более 6200 мг/кг; острая дермальная токсичность (LD50) для крыс - более 2000 мг/кг; острая ингаляционная токсичность (LD50) для крыс - более 4990 мг/м3 воздуха. Протиоконазол не оказывает раздражающего действия на кожу и слизистую оболочку глаз, не обладает эмбриотоксическим или тератогенным действием. LC50 для рыб - 1,83 мг/л (96 ч). Фунгицид нетоксичен для птиц, пчел, дождевых червей, дафний и почвенных микроорганизмов. Основной метаболит протиоконазола: протиоконазол-дестио (SXX 0665). α-(1-хлорциклопропил)-α-(2-хлорфенил)метил-1Н-1,2,4-триазол-1-этанол (С.А.). Эмпирическая формула: C14H15Cl2N3O. Молекулярная масса: 312,2. Бесцветный порошок без запаха. Температура плавления: 108,5 °С. Давление паров при 20 °С: 2,7×10-7 Па. Коэффициент распределения н-октанол/вода: KowlogP = 3,04. Растворимость (г/л) при 20 °С: гексан - 3, толуол - 84, ацетон - 100, ацетонитрил - 43, дихлорметан - более 200, вода - 0,051. Метаболит стабилен в кислой и щелочной средах (DT50 = > 500 ч). Другие физико-химические и токсикологические характеристики протиоконазол-дестио отсутствуют. Гигиенические нормативы для протиоконазола и протиоконазол-дестио в России не установлены. Область применения препарата Протиоконазол - фунгицид системного действия из группы ингибиторов синтеза эргостерина. Вещество обладает защитным, искореняющим и лечебным действием. При обработке вегетирующих растений оно эффективно подавляет развитие возбудителей ржавчины, мучнистой росы, септориоза, фузариоза колоса, ломкости стеблей и пятнистостей листьев на посевах ячменя, пшеницы и других культур, а при протравливании семян защищает последние от заражения твердой и пыльной головней и фузариозной корневой гнилью. Протиоконазол весьма лабильное вещество и при поступлении в растение очень быстро метаболизируется до более устойчивого соединения - протиоконазол-дестио (α-(1-хлорциклопропил)-α-(2-хлорфенил) метил-1Н-1,2,4-1-этанол) /SXX 0665/. В связи с этим разработан метод, позволяющий осуществлять контроль за содержанием остаточных количеств протиоконазола в зерне и соломе зерновых колосовых культур по протиоконазол-дестио. 2. Методика определения остаточных количеств
|
Анализируемый объект |
Метрологические параметры, Р = 0,95, n = 20 |
|||||
предел обнаружения, мг/кг |
диапазон определяемых концентраций, мг/кг |
среднее значение определения, % |
стандартное отклонение S, % |
относительное отклонение DS, % |
доверительный интервал среднего, % |
|
Зерно |
0,02 |
0,02 - 0,2 |
88,6 |
5,3 |
2,4 |
±4,9 |
Солома |
0,1 |
0,1 - 1,0 |
83,6 |
3,6 |
1,6 |
±3,4 |
Протиоконазол-дестио с содержанием д.в. 98,5 % (Байер, Германия) |
|
Ацетон, чда |
|
Вода бидистиллированная |
ГОСТ 7602-72 |
Гексан, ч |
ТУ 6-09-3375-78 |
Дихлорметан |
|
Калия перманганат |
|
Кальция хлорид, хч |
ГОСТ 4161-77 |
Калий углекислый, хч |
|
Кислота серная, хч |
|
Натрия гидроксид, хч |
|
Натрий двууглекислый |
|
Натрия сульфат безводный, хч |
|
Этилацетат |
|
Элюент № 1 для колоночной хроматографии: смесь гексан-этилацетат (85:15, по объему) |
|
Элюент № 2 для колоночной хроматографии: смесь гексан-этилацетат (70:30, по объему) |
|
Элюент № 1 для Диапак-диола: смесь гексан-дихлорметан (1:1, по объему) |
|
Алюминия оксид 90 (0,063 - 0,2 мм), нейтральный для адсорбционной хроматографии (Мерк, Германия) I степени активности по Брокману Концентрирующий патрон Диапак-диол (ЗАО БиоХимМак СТ, Москва, Ленинские горы, МГУ) |
|
Азот газообразный, осч |
ГОСТ 0203-74 |
Стекловата |
|
Фильтры бумажные «синяя лента» |
ТУ 6-09-1678 |
Хроматограф газовый «Кристалл 2000М» с ЭЗД с пределом детектирования по линдану не выше 3,18×10-14 г/с или аналогичный |
|
Колонка хроматографическая, набивная, стеклянная, 1000×3 мм, неподвижная фаза - 3 % OV-17 на Хромосорбе W/HP (0,12 - 0,15 мм) |
|
Микрошприц емкостью 10 мкл МШ-10Ф |
ТУ 64-1-2850 |
Аппарат для встряхивания АВУ |
ТУ 64-1-1081-83 |
Весы аналитические типа ВЛР-200 |
ГОСТ 19401-74 |
Водоструйный насос |
ГОСТ 10696-75 |
Колонка для адсорбционной хроматографии |
|
Мельница электрическая, лабораторная или аналогичная |
ТУ 46-22-236-79 |
Ротационный испаритель, тип ИР-1М |
ТУ 25-11-917-76 |
Баня ультразвуковая, модель D 50 |
|
Branson Instr.Co, США |
|
Баня водяная |
ТУ 46-22-603-75 |
Воронка Бюхнера |
ГОСТ 0147-73 |
Воронки делительные, вместимостью 100 мл |
|
Воронки для фильтрования стеклянные |
ГОСТ 8613-75 |
Колба Бунзена |
ГОСТ 5614-75 |
Колбы круглодонные на шлифе, вместимостью 100, 250 мл |
ГОСТ 9737-70 |
Колбы конические с притертыми пробками вместимостью 250 мл |
|
Колбы мерные, вместимостью 25, 50 и 100 мл |
|
Колбы грушевидные, вместимостью 50 и 100 мл |
|
Пипетки мерные вместимостью 1, 2, 5 и 10 мл |
|
Пробирки градуированные с притертыми пробками, вместимостью 5 мл |
ГОСТ 10515-75 |
Цилиндры мерные, вместимостью 25, 50 и 100 мл |
Отбор проб производится в соответствии с «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов» (от 21.08.79 № 2051-79).
Отобранные пробы зерна и соломы досушивают до стандартной влажности и хранят в стеклянной или полиэтиленовой таре при комнатной температуре или в холодной комнате при температуре 4 °С. Перед анализом зерно и солому размалывают на лабораторной мельнице.
Органические растворители перед началом работы очищают, сушат и перегоняют в соответствии с типовыми методиками. Гексан и хлористый метилен встряхивают с небольшими порциями концентрированной серной кислоты до тех пор, пока свежая порция кислоты не перестанет окрашиваться. Затем растворители последовательно промывают водой, 2 %-ным раствором гидроксида натрия и снова водой, после чего сушат над гидроксидом натрия и перегоняют.
Ацетон перегоняют над перманганатом калия и поташом (на 1 л ацетона 10 г KMnO4 и 2 г K2CO3.
Этилацетат промывают равным объемом 5 %-го раствора двууглекислого натрия, сушат над хлористым кальцием и перегоняют.
Оксид алюминия III степени активности по Брокману получают добавлением 4,6 % воды к навеске оксида алюминия фирмы Мерк (Германия) I степени активности.
Готовую насадку (3 % OV-17 на Хромосорбе W/HP) засыпают в стеклянную колонку, уплотняют под вакуумом, колонку устанавливают в термостат хроматографа, не подсоединяя к детектору, и стабилизируют в токе азота при температуре 250 °С в течение 8 - 10 ч.
Основной стандартный раствор протиоконазол-дестио с содержанием 100 мкг/мл готовят растворением 0,0102 г вещества, содержащего 98,5 % д.в., в этилацетате в мерной колбе на 100 мл. Раствор хранят в холодильнике при температуре -12 °С не более месяца.
Рабочие стандартные растворы с концентрациями 0,05; 0,1; 0,25 и 0,5 мкг/мл готовят из основного стандартного раствора метаболита соответствующим последовательным разведением этилацетатом.
При изучении полноты открывания протиоконазол-дестио в модельных матрицах используются ацетоновые растворы вещества.
Для построения калибровочного графика в инжектор хроматографа вводят по 2 мкл рабочего стандартного раствора протиоконазол-дестио с концентрацией 0,05; 0,1; 0,25 и 0,5 мкг/мл. Осуществляют не менее 5 параллельных измерений и находят среднее значение площади хроматографического пика для каждой концентрации. Строят калибровочный график зависимости площади хроматографического пика в мВ × с от концентрации протиоконазол-дестио в растворе в мкг/мл.
В нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см и внутренним диаметром 0,8 см вставляют тампон из стекловаты, закрывают кран и вносят суспензию 5 г оксида алюминия III степени активности по Брокману в 20 мл смеси гексан-этилацетат (85:15, по объему). Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента и помещают на него слой безводного сульфата натрия высотой 1 см. Колонку промывают 15 мл смеси гексан-этилацетат (85:15, по объему) со скоростью 1 - 2 капли в секунду, после чего она готова к работе.
Концентрирующий патрон Диапак-диол промывают сначала с помощью медицинского шприца 10 мл смеси дихлорметан-ацетон (1:1, по объему), а затем 8 мл смеси гексан-дихлорметан (7:3, по объему) со скоростью 5 мл/мин.
В круглодонную колбу емкостью 10 мл отбирают 0,1 мл стандартного раствора протиоконазол-дестио с концентрацией 10 мкг/мл. Отдувают растворитель потоком теплого воздуха, остаток растворяют в 3 мл смеси гексан-этилацетат (85:15, по объему) и наносят на подготовленную хроматографическую колонку (п. 2.5.5). Промывают колонку 30 мл элюента № 1 (смесь гексан-этилацетат, 85:15) и затем 30 мл элюента № 2 (смесь гексан-этилацетат, 70:30) со скоростью 1 - 2 капли в секунду. Отбирают фракции по 5 мл каждая, упаривают досуха, остаток растворяют в 2 мл этилацетата и анализируют на содержание протиоконазол-дестио по п. 2.7.
Фракции, содержащие протиоконазол-дестио, объединяют, упаривают досуха, остаток растворяют в 5 мл этилацетата и вновь анализируют по п. 2.7. Рассчитывают содержание вещества в элюате, определяют полноту смывания с колонки и необходимый для очистки объем элюента.
Примечание: Профиль вымывания протиоконазол-дестио может меняться при использовании новых партий сорбента и растворителей.
К навеске размолотого зерна (20 г) или соломы (5 г) добавляют 100 мл 70 %-го водного ацетона и суспензию перемешивают в течение 1 часа на аппарате для встряхивания. Суспензию фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через бумажный фильтр в колбу емкостью 250 мл. Осадок на фильтре промывают 50 мл 70 %-ного водного ацетона. Из объединенного экстракта отбирают аликвоту раствора (соответственно около 35 и 25 мл), эквивалентную 5 г зерна или 1 г соломы. Дальнейшую очистку проводят по пп. 2.6.2, 2.6.3 и 2.6.4.
Отобранные аликвоты растительного экстракта (из п. 2.6.1) упаривают до водной фазы (объем около 5 мл) на роторном испарителе при температуре 40 °С. Водный остаток переносят в делительную воронку емкостью 100 мл, приливают 20 мл бидистиллированной воды, 30 мл дихлорметана и смесь встряхивают в течение 1 минуты. После разделения слоев собирают органическую фракцию, а водную фазу обрабатывают дихлорметаном еще два раза (30 + 20 мл). Объединенный дихлорметановый экстракт пропускают через слой безводного сульфата натрия и упаривают досуха на роторном испарителе при температуре 30 °С.
К остатку в колбе, полученному при упаривании очищенных по п. 2.6.2 экстрактов растительного материала, приливают 3 мл смеси гексан-этилацетат (85:15, по объему) и помещают в ультразвуковую баню на 3 минуты. Раствор переносят в подготовленную хроматографическую колонку (п. 2.5.5). Промывают колонку 25 мл смеси гексан-этилацетат (85:15, по объему), которые отбрасывают. Протиоконазол-дестио элюируют 25 мл смеси гексан-этилацетат (70:30, по объему) в грушевидную колбу емкостью 100 мл. Раствор упаривают досуха на роторном испарителе при температуре 40 °С. Сухой остаток экстракта зерна растворяют в 2 мл этилацетата и анализируют по п. 2.7. Экстракт соломы подвергают дополнительной очистке на концентрирующем патроне Диапак-диол.
Сухой остаток экстракта соломы из п. 2.6.3 переносят двумя 1-мл порциями смеси гексан-дихлорметан (7:3, по объему) в подготовленный концентрирующий патрон Диапак-диол (п. 2.5.5). Патрон промывают 5 мл смеси гексан-дихлорметан (1:1, по объему) со скоростью 5 мл/мин, которые отбрасывают. Протиоконазол-дестио элюируют 12 мл дихлорметана. Элюат упаривают досуха в грушевидной колбе емкостью 50 мл на роторном испарителе при температуре 30 °С. Для удаления следовых количеств дихлорметана в колбу приливают 5 мл гексана и упаривают досуха на роторном испарителе при температуре 30 °С. Сухой остаток растворяют в 2 мл этилацетата и анализируют по п. 2.7.
Газовый хроматограф «Кристалл 2000М» с электронозахватным детектором (Ni63) с пределом детектирования по линдану не выше 3,18×10-14 г/с.
Колонка хроматографическая, стеклянная, 1000×3 мм, неподвижная фаза - 3 % OV-17 на Хромосорбе W/HP (0,12 - 0,15 мм).
Температура детектора - 320 °С, испарителя - 270 °С, термостата колонки - 230 °С.
Скорость потока газа-носителя (азот) - 30 мл/мин; поддув - 25 мл/мин.
Объем вводимой пробы - 2 мкл.
Время удерживания протиоконазол-дестио - 2 мин 28 с.
Линейный диапазон детектирования: 0,1 - 1 нг.
Каждую анализируемую пробу вводят в хроматограф 3 раза и вычисляют среднюю площадь пика.
Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор с концентрацией 0,5 мкг/мл, разбавляют этилацетатом.
Содержание протиоконазол-дестио рассчитывают методом абсолютной калибровки по формуле:
Х - содержание протиоконазол-дестио в пробе, мг/кг;
H1 - площадь пика образца, мВ⋅с;
H0 - площадь пика стандарта, мВ⋅с;
А - концентрация стандартного раствора протиоконазол-дестио, мкг/мл;
V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, мл;
m - масса анализируемой части образца, г (для зерна - 5 г, для соломы - 1 г).
При установлении уровня протиоконазола полученное значение содержания протиоконазола-дестио (X) умножают на 1,1.
Необходимо соблюдать общепринятые правила безопасности при работе с органическими растворителями, токсичными веществами, электронагревательными приборами.
Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ ИСО 5725-1 - 6-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».
Дубовая Л.В., Макеев А.М.
ВНИИ фитопатологии, 143050 Московская обл., п/о Большие Вяземы, тел. 592-92-20.