Санитарные правила
«Микробиологические нормативы и методы анализа продуктов детского, лечебного и диетического питания и их компонентов»
СанПиН 42-123-4940-88

(утв. заместителем Главного государственного санитарного врача СССР 21 декабря 1988 г.)

Санитарные правила включают предельно допустимые количества микроорганизмов в сухих, жидких и пастообразных молочных продуктах детского, диетического и лечебного питания и в составляющих их компонентах.

Кроме того, в Санитарных правилах изложены методы микробиологического исследования вышеперечисленных продуктов.

В связи с тем, что к продуктам детского и диетического питания предъявляются повышенные санитарно-гигиенические требования, в особенности к продуктам для детей первых месяцев жизни, употребляемым без термической обработки (смеси «Детолакт», «Новолакт», «Бифидолакт» и др.), для сырья и компонентов, используемых для их изготовления, также должны быть установлены повышенные требования.

Однако большинство компонентов не нормированы по микробиологическим показателям, тогда как продукты детского питания строго регламентированы по ряду санитарно-показательных микроорганизмов.

Существующий в настоящее время микробиологический контроль производства продуктов питания предусматривает исследования только на наличие санитарно-показательных групп микроорганизмов, что не позволяет судить о степени безопасности готового продукта для детей раннего возраста.

Известно, что у взрослого человека потенциально патогенные микроорганизмы, такие как Staphylococcus aureus, энтеропатогенные E. coli, B. cereus и другие вызывают вспышки пищевых интоксикаций и токсикоинфекций при массивном обсеменении продукта, тогда как у детей эти возбудители при значительно меньшей дозе инфекта вызывают заболевания, текущие по типу острой или хронической кишечной инфекции.

Настоящие Правила разработаны и утверждены на основе Положения о государственном санитарном надзоре СССР (п. 7а), утвержденного постановлением Совета Министров СССР от 31.05.73 г., № 361.

Нарушение санитарно-гигиенических и санитарно-противоэпидемических правил и норм влечет дисциплинарную, административную или уголовную ответственность в соответствии с законодательством Союза ССР и союзных республик (ст. 18).

Государственный санитарный надзор за соблюдением санитарно-гигиенических и санитарно-противоэпидемических правил и норм государственными органами, а также всеми предприятиями, учреждениями и организациями, должностными лицами и гражданами возлагается на органы и учреждения санитарно-эпидемиологической службы Министерства здравоохранения СССР и министерств здравоохранения союзных республик (ст. 19) (Основы законодательства Союза ССР и союзных республик о здравоохранении, утвержденные законом СССР от 19 декабря 1969 г. и введенные в действие с 1 июля 1970 г.).

В целях охраны здоровья населения СССР устанавливаются Санитарные правила «Микробиологические нормативы и методы анализа продуктов детского, лечебного и диетического питания и их компонентов» № 42-123-4940-88 от 21 декабря 1988 г.

Эта уязвимость детского организма в отношении ряда микробов связана с недостаточной выработкой специфических и неспецифических защитных факторов и функциональной незрелостью желудочно-кишечного тракта.

Установлено, что наименее защищены против возбудителей инфекционных заболеваний недоношенные дети и дети первых трех месяцев жизни, находящиеся на искусственном вскармливании, для которых в большей степени и предназначены детские молочные продукты.

Следует подчеркнуть, что бактериологические нормативы на потенциально патогенные и патогенные микроорганизмы для детских молочных продуктов и их компонентов ранее не были разработаны.

Специальные экспериментальные исследования, проведенные в Институте питания АМН СССР, показали, что ряд представителей потенциально патогенных микроорганизмов (E. coli, S. aureus, энтерококки, B. cereus) способны интенсивно размножаться в условиях желудочно-кишечного тракта детей первых месяцев жизни.

Полученные данные позволили обоснованно подойти к строгому нормированию отсутствия патогенных и условно патогенных микроорганизмов в относительно большой массе детских молочных продуктов и компонентов.

Настоящие Санитарные правила составлены с учетом результатов изучения остаточной микрофлоры ряда готовых детских молочных продуктов и их компонентов, проведенных по единой методике в нескольких институтах (Институте питания АМН СССР, Киевском институте гигиены питания Минздрава Украинской ССР, Истринском отделении ВНИКМИ).

Кроме того, обобщены многолетние данные, полученные от ряда молочно-консервных комбинатов детских молочных продуктов и городских молочных заводов, вырабатывающих продукты детского питания в специализированных цехах.

Эти материалы послужили основанием для создания микробиологических нормативов на детские молочные продукты и их компоненты, изготавливаемые на предприятиях при строгом соблюдении санитарно-гигиенических правил, технологических режимов производства, условий хранения и сроков реализации.

Разработанные микробиологические нормативы на молочные продукты для детского питания и их основные компоненты предусматривают проведение контроля не только по общему количеству микроорганизмов в 1 г продукта, содержанию бактерий группы кишечных палочек, дрожжей и плесневых грибов, но и включают контроль за отсутствием в определенной массе продукта ряда потенциально патогенных и патогенных микроорганизмов (Staphylococcus aureus, E. coli, B. cereus, Salmonella).

Санитарные правила предусматривают наряду с общепринятыми методами микробиологического контроля детских молочных продуктов введение методов, усовершенствованных в соответствии с рекомендациями ФАО/ВОЗ. Последние модифицированы с учетом возможностей воспроизведения их в условиях санитарно-эпидемиологических станций и ведомственных производственных лабораторий.

Микробиологические показатели на сухие и жидкие продукты детского питания разработаны, с одной стороны, с учетом возрастных особенностей детей, для питания которых предназначаются эти продукты, с другой - с учетом степени термической обработки продукта перед употреблением (без термической обработки, доведение до кипения, кипячение, восстановление при температуре 80, 90 °C и т.д.).

Настоящими микробиологическими нормативами и методами исследования, изложенными в Санитарных правилах, должны руководствоваться санитарно-эпидемиологические станции и ведомственные производственные лаборатории предприятий при контроле детских молочных продуктов и их компонентов. Организация и периодичность контроля, проводимого ведомственными лабораториями предприятий молочной промышленности, должны осуществляться в соответствии с действующими «Инструкцией по микробиологическому контролю производства на молочно-консервных комбинатах детских продуктов», утвержденной Министерством мясной и молочной промышленности СССР 19 марта 1979 г., и «Инструкцией по микробиологическому контролю производства жидких и пастообразных детских молочных продуктов», утвержденной Минмясомолпромом СССР в 1980 г., но микробиологические нормативы, приведенные в этих инструкциях, «Санитарно-технологических требованиях к производству продуктов детского и лечебного питания», утвержденных Минмясомолпромом СССР в 1981 г., а также в ГОСТ 9225-84, утрачивают силу.

Кратность лабораторных исследований указанной продукции и компонентов, выполняемых санитарно-эпидемиологической службой, должна планироваться в соответствии с Методическими указаниями «Нормативы проведения основных санитарно-бактериологических исследований объектов окружающей среды», утвержденными Минздравом СССР 24 февраля 1983 г., № 2671-83.

Настоящими Санитарными правилами следует руководствоваться в части нормирования микробиологических показателей при пересмотре действующей и разработке вновь создаваемой нормативно-технической документации на детские молочные продукты и компоненты.

1. Микробиологические нормативы на сухие, жидкие и пастообразные молочные продукты детского питания и компоненты

1.1. Микробиологические показатели сухих, жидких и пастообразных молочных продуктов детского питания зависят от целого ряда факторов: качества сырья и компонентов, соблюдения режимов тепловой обработки, качества мойки и дезинфекции оборудования, тары, соблюдения правил личной гигиены персоналом и др.

Нормативы призваны способствовать улучшению качества молочных продуктов детского питания и сырья, применяемого для их изготовления, а также повышению санитарно-гигиенического уровня и совершенствованию технологических процессов производства на предприятиях, производящих указанную продукцию.

Микробиологические нормативы на сухие детские молочные продукты приведены в табл. 1, на сухие кисломолочные продукты - в табл. 2, на жидкие и пастообразные продукты детского питания - в табл. 3, на сухие молочные диетические и лечебные продукты - в табл. 4, на каши сухие молочные - в табл. 5.

Предельно допустимые количества микроорганизмов в компонентах, используемых в производстве сухих, жидких и пастообразных продуктов детского питания, приведены в табл. 7. При этом в продуктах и компонентах нормируются общее количество мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов (что соответствует прежнему показателю ОМЧ), плесневых грибов, дрожжей и B. cereus в 1 г продукта, и их содержание выражается количеством колониеобразующих единиц - КОЕ/г. Другие группы микроорганизмов - бактерии группы кишечных палочек, E. coli, коагулазоположительные стафилококки, патогенные микроорганизмы, в том числе сальмонеллы, не должны обнаруживаться в определенной, указанной в соответствующей графе, массе продукта.

В ряде продуктов введенный ранее норматив: отсутствие E. coli и S. aureus в 11 г продукта заменен на отсутствие в 10 г, что существенно не отражается на микробиологической безопасности продукта, но упрощает проведение исследований.

В кисломолочных продуктах детского питания нормируется также содержание ацидофильных бактерий и бифидобактерий.

Среди перечисленных продуктов и компонентов особое место занимают биологически активные добавки (БАД), которыми обогащают продукты детского питания (и даже термически обработанное донорское молоко). БАД вносят в количестве 1 г на 100 см³ восстановленного продукта или жидкого продукта. Обогащенные БАДами продукты предназначаются недоношенным и ослабленным детям первого года жизни. В обогащенных бифидобактериями БАДах определяют количество этих микроорганизмов (табл. 6).

1.2. Рекомендации по оценке результатов микробиологических исследований

Настоящими микробиологическими нормативами предусмотрен широкий спектр контролируемых микроорганизмов как в готовых детских молочных продуктах, так и в соответствующих компонентах.

При контроле готовых детских молочных продуктов санитарно-эпидемиологические станции осуществляют исследования на все виды микроорганизмов в соответствии с табл. 1, 2, 3, 4, 5, 6. В том случае, если один или несколько показателей превышают нормы, приведенные в указанных таблицах, производится микробиологический контроль ингредиентов в соответствии с табл. 7.

Производственные лаборатории осуществляют контроль сырья, компонентов и готовой продукции по всем показателям в соответствии с настоящими Санитарными правилами, за исключением анализа на сальмонеллы.

В производственных лабораториях комбинатов, производящих продукты типа «Детолакт» (употребляемые без термической обработки для питания детей с первых дней жизни), каждую партию готовых продуктов контролируют по всем показателям, предусмотренным настоящими Санитарными правилами. Контроль компонентов, используемых для изготовления этих продуктов, производят периодически в соответствии с показателями табл. 7. Периодичность контроля устанавливают в соответствии с действующей «Инструкцией по микробиологическому контролю производства на молочно-консервных комбинатах детских продуктов».

В производственных лабораториях комбинатов, производящих продукты типа «Малютка», «Малыш», употребляемых после термической обработки, контролируют каждую партию готового продукта и компонентов на содержание мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов, бактерий группы кишечных палочек, плесневых грибов и дрожжей. Контроль на содержание коагулазоположительных стафилококков и B. cereus в сухих готовых продуктах, их компонентах, жидких и пастообразных продуктах проводят периодически, не реже одного раза в месяц.

Анализ на наличие патогенных микроорганизмов, в том числе бактерий рода Salmonella, в этих видах продуктов детского питания осуществляют санитарно-эпидемиологические станции, за исключением производственных лабораторий МККДП, изолированных от производства и специально оборудованных.

При обнаружении повышенного содержания мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов в детских молочных продуктах следует также определять количественное содержание энтерококков в данных продуктах по методам, изложенным ниже.

При этом следует иметь в виду, что повышенное содержание мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов, бактерий группы кишечных палочек (колиформных бактерий), эшерихий коли, коагулазоположительных стафилококков свидетельствует либо о несоблюдении температурного режима на производстве, либо о повышенной бактериальной обсемененности исходных компонентов, либо о неудовлетворительном санитарном состоянии оборудования.

Более строгие требования к отсутствию сальмонелл в значительных объемах готовых продуктов и компонентов введены в связи со способностью практически всех сероваров этого рода вызывать инфекционные заболевания у детей.

Запрещается выпуск в реализацию готовой продукции, в которой обнаружены патогенные микроорганизмы в массе продукта, предусмотренной настоящими Санитарными правилами.

При наличии отклонений готовой продукции от указанных нормативов в сторону ухудшения осуществляют контроль компонентов на все виды микроорганизмов, указанных в табл. 1 - 7, а также контролируется санитарно-гигиеническое состояние оборудования, инвентаря, воздуха, воды, соблюдение правил личной гигиены и т.д. с последующим назначением санитарных дней и др. санитарно-гигиенических мероприятий.

При несоответствии качества компонентов требованиям настоящих Санитарных правил использование их в производстве запрещается.

Таблица 1

Микробиологические нормативы для сухих молочных продуктов

Таблица 2

Микробиологические нормативы для сухих кисломолочных продуктов

Таблица 3

Микробиологические нормативы для жидких и пастообразных продуктов детского питания

_______________

^*(1) При анализе стерилизованных продуктов, когда посев производят без разведений, учитываются все выросшие на чашке колонии.

^*(2) Закваски контролируют в соответствии с действующими НТД. S. aureus, БГКП должны отсутствовать в 10 см³ заквасок, патогенные микроорганизмы (в т.ч. сальмонеллы) - в 100 см³.

^*(3) Общее количество микроорганизмов не определяют в продуктах, содержащих специфическую микрофлору, поскольку подсчет бактерий в таких случаях не может быть показательным. Контроль специфической микрофлоры кисломолочных продуктов осуществляется путем просмотра микроскопического препарата в соответствии с действующими НТД на каждый вид продукта.

^*(4) В данных продуктах дополнительно нормируется количество плесневых грибов, КОЕ/г, не более 100.

Таблица 4

Микробиологические нормативы для сухих молочных лечебных и диетических продуктов^*

_________________

^* Могут быть использованы для лечебного питания взрослых.

^** Продукт содержит 1 ∙ 10⁶ ацидофильных бактерий в 1 г.

Таблица 5

Микробиологические нормативы для сухих молочных каш

Таблица 6

Микробиологические нормативы для сухих биологически активных добавок (БАД)

_________________

^* Соотношение засеваемой массы БАД и сред обогащения - 1:10.

Таблица 7

Микробиологические нормативы для компонентов, используемых в производстве продуктов детского питания

_________________

^* При изготовлении продукта с внесением концентрата сывороточного белкового в сырье с последующей термической обработкой допускается 25000 КОЕ/г.

^** При многократных исследованиях коагулазоположительный стафилококк не обнаруживался, поэтому этот анализ следует выполнять при повышенной обсемененности растительных масел.

2. Методы отбора проб сырья, компонентов и готовой продукции

2.1. Отбор проб - по ГОСТ 26809-86 «Молоко и молочные продукты. Отбор проб и подготовка к испытанию», ГОСТ 13928-84 «Молоко и сливки заготовляемые. Правила приемки, методы отбора проб и подготовка их к анализу», ГОСТ 9225-84 «Молоко и молочные продукты. Методы микробиологического анализа», ГОСТ 26668-85 «Пищевые и вкусовые продукты. Порядок отбора проб для микробиологических анализов».

2.2. Пробы для микробиологических анализов отбирают до отбора проб для физико-химических и органолептических анализов способом, исключающим вторичное обсеменение продукта (в стерильную посуду с помощью стерильных приспособлений).

2.3. Для микробиологического анализа подготавливается усредненная проба продукта или компонента, которая должна быть массой не менее 100 - 150 г (см³) для производственных лабораторий и 200 - 250 г (см³) - для санитарно-эпидемиологических станций.

2.4. Перемешивание продукта и отбор проб производится отборником, черпаком, ложкой, металлической трубкой, шпателем или другими соответствующими приспособлениями, которые перед каждым использованием должны быть простерилизованы фламбированием, сухим жаром или в автоклаве.

2.4.1. Молоко заготовляемое.

Объединенную пробу объемом 100 - 150 (см³) составляют из точечных проб, отобранных из каждой фляги или цистерны после органолептической оценки и рассортировки по кислотности предельным методом по ГОСТ 3624-67.

2.4.2. Молоко, сливки пастеризованные, другие жидкие и сгущенные продукты, компоненты в транспортной таре.

От продукции, попавшей в выборку, после тщательного перемешивания мутовкой стерильно отбирают 50 - 60 (см³) продукта.

2.4.3. В жидких продуктах детского питания, попавших в выборку по ГОСТ 26809-86, анализы проводят отдельно в каждой единице фасовки.

Для контроля стерилизованных продуктов, выработанных однократной стерилизацией в потоке с последующим асептическим розливом при непрерывном процессе производства, через каждый час с каждого фасовочного автомата отбирают по одной единице фасовки. При контроле продуктов, выработанных двухступенчатым способом стерилизации, пробы отбирают через каждый час по 2 единицы фасовки после второй стерилизации.

2.4.4. Творог, творожные изделия и пастообразные продукты, попавшие в выборку в потребительской таре, отбирают для анализа в количестве, необходимом для получения усредненной пробы.

2.4.5. Сухие молочные продукты и компоненты.

От продукции, попавшей в выборку в транспортной таре, стерильно отбирают на анализ 40 - 50 г продукта.

2.4.6. Отбор проб сухой фасованной продукции производится в количестве 3 единиц фасовки от каждой однородной партии (в начале, середине и конце фасовки). Затем от каждого образца отбирают по 40 - 50 г продукта в одну емкость для получения усредненной пробы.

2.5. Посуду с пробой или пробу в потребительской таре снабжают этикеткой, на которой указывают:

номер пробы;

наименование продукта;

номер и объем партии;

дату и час отбора пробы;

должность и подпись лица, отбиравшего пробу;

обозначение действующей нормативно-технической документации, по которой вырабатывался продукт.

2.6. Пробу, отправляемую в лабораторию вне данного предприятия, пломбируют или опечатывают и снабжают этикеткой, на которой указывают:

номер пробы;

наименование предприятия-изготовителя;

наименование продукта;

номер и объем партии;

дату и час выработки продукта с момента окончания технологического процесса;

дату и час отбора пробы;

должность и подпись лица, отобравшего пробу;

объем необходимых анализов;

обозначение действующей нормативно-технической документации, по которой вырабатывался продукт.

2.7. Микробиологические анализы продукта проводят не более чем через 4 ч с момента отбора проб.

2.8. Пробы должны храниться и транспортироваться до начала исследований в условиях, обеспечивающих температуру продуктов не выше 6 °C, не допуская подмораживания.

2.9. При отборе проб для микробиологических исследований на предприятии работниками СЭС необходимо, чтобы микробиолог комбината одновременно с ними отбирал пробы и исследовал их.

3. Аппаратура, материалы, лабораторная посуда, реактивы, питательные среды

3.1. Аппаратура

Автоклав вертикальный по ГОСТ 9586-75.

Анализатор потенциометрический, диапазон измерения pH 3 - 8, погрешность измерения pH ±0,05 по ГОСТ 19881-74, ионометр универсальный ЭВ-74 или потенциометр универсальный pH - 340 по ГОСТ 9245-79.

Аппарат универсальный типа АВУ-6С для встряхивания жидкости в колбах и пробирках по ТУ 64-1-2451-78 (шуттель-аппарат).

Ареометр по ГОСТ 18481-81Е.

Баня водяная с подогревом.

Весы лабораторные общего назначения, 2 и 4 класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г и поверочной ценой деления, соответственно: 0,0001 г и 0,1 г по ГОСТ 24104-80.

Лупа измерительная по ГОСТ 25706-83.

Микроскоп биологический по ГОСТ 8284-78.

Прибор для счета колоний бактерий ПСБ по ТУ 64-1-2401-72.

Сахарометр.

Стерилизатор СС-200 М по ТУ 64-1-2498-75.

Термостат с водяной рубашкой электрический ЗЦ-1125 М по ТУ 64-1-1868-75 или термостат электрический суховоздушный ТС-80 по ТУ 64-1-1382-72.

Холодильник бытовой электрический по ГОСТ 16317-76.

Центрифуга медицинская по ГОСТ 3585-79Е.

Часы сигнальные по ГОСТ 3145-84.

Часы песочные настольные на 1, 5 и 10 минут.

Электроплитки по ГОСТ 14919-83.

3.2. Материалы

Бумага индикаторная универсальная по ТУ 6-09-1181-76.

Бумага фильтровальная лабораторная по ГОСТ 12026-76.

Вата медицинская гигроскопическая по ГОСТ 5556-81.

Карандаши по стеклу.

Кастрюли эмалированные по ГОСТ 24788-81.

Лотки эмалированные или кристаллизаторы.

Марля медицинская по ГОСТ 9412-74.

Нож консервный.

Ножницы медицинские по ГОСТ 212-9-77.

Пергамент по ГОСТ 1341-81.

Пинцеты анатомические 15 см по ГОСТ 21241-77.

Подпергамент по ГОСТ 1760-81.

Пробки резиновые.

Скальпели хирургические 15 см по ГОСТ 21240-77.

Шпатели металлические или фарфоровые 15 - 20 см.

Шпагат по ГОСТ 16266-70.

Штативы металлические, деревянные или пластмассовые.

3.3. Лабораторная посуда

Бутылки стеклянные для химических реактивов по ГОСТ 14182-80.

Колбы конические вместимостью 40, 200, 400, 1000, 1600 см³ по ГОСТ 19908-80.

Колбы исполнения 2 вместимостью 100, 500, 1000 см³ 2-го класса точности по ГОСТ 1770-74.

Пипетки исполнения 5, 1-го класса точности, вместимостью 1 см³ по ГОСТ 20292-74.

Пипетки исполнения 7, 1-го класса точности, вместимостью 10 см³ по ГОСТ 20292-74.

Пробирки Уленгута (поплавки).

Пробирки стеклянные исполнения 1 и 2 вместимостью 10 см³.

Пробирки исполнения ИК вместимостью 20 см³ по ГОСТ 19908-80.

Спиртовки лабораторные стеклянные по ГОСТ 23932-79.

Стаканчики для взвешивания типа СВ по ГОСТ 25336-82.

Стаканы типа ВН-100 вместимостью 100 см³ по ГОСТ 19908-80.

Стаканы высокие с носиком вместимостью 200 см³ по ГОСТ 19908-80.

Стекла предметные для микропрепаратов по ГОСТ 9284-75.

Стекла покровные для микропрепаратов по ГОСТ 6672-75Е.

Ступки фарфоровые с пестиками 85 см по ГОСТ 9147-80Е.

Цилиндры исполнения 1 вместимостью 100, 500 см³ по ГОСТ 1770-74Е.

Чашки биологические (Петри) по ГОСТ 23932-79.

3.4. Реактивы, питательные среды

Агар микробиологический по ГОСТ 17206-71.

Агар питательный сухой по ТУ 42-14-33-75.

Агар сывороточный «БФ».

α-нафтол по ГОСТ 5838-79.

Бриллиантовый зеленый по ТУ 6-09-4279-76.

Бромтимоловый синий по ТУ 6-09-2086-77.

Висмут-сульфитный агар по ТУ 42-141-27-78.

Гидролизат казеина панкреатический по ТУ 42-141-27-78.

Дефибринированная кровь человека, барана или кролика.

Дрожжи хлебные прессованные по ГОСТ 171-69.

D-глюкоза, ч. по ГОСТ 6038-79.

D-лактоза, N-водная по ТУ 6-09-22-93-79.

D(+)-мальтоза по МРТУ 6-09-1044-64 для микробиологических целей.

DL-триптофан по ТУ 6-09-1492-80.

Желчь сухая по ОСТ 49 278-75 или желчь нативная сельскохозяйственных животных, стерильная.

Железо III сернокислое 9-водное по ГОСТ 9485-74.

Йод по ГОСТ 4159-79.

Калий гидроокись по ГОСТ 24363-80.

Калий йодистый, ч.д.а. по ГОСТ 4232-74.

Калий фосфорнокислый однозамещенный, ч. по ГОСТ 4198-75.

Калий фосфорнокислый двузамещенный по ГОСТ 2493-75.

Кальций углекислый по ГОСТ 4530-76.

Кислота соляная, х.ч. по ГОСТ 3118-77.

Кристаллический фиолетовый по ТУ 6-09-4119-75.

Левомицетин (медпрепарат).

Лимонная кислота, х.ч. или ч. по ГОСТ 3652-69.

Литий хлористый, ч. или х.ч., ч.д.а. по ГОСТ 4328-77.

L-цистин солянокислый по ТУ 6-09-3252-80 или цистеин солянокислый, получаемый по импорту.

Магний сернокислый по ГОСТ 4523-77.

Магний хлористый 6-водный ч.х.ч., ч.д.а. по ГОСТ 4209-77.

Масло иммерсионное для микроскопирования по ГОСТ 13739-78.

Медь сернокислая 5-водная, х.ч. по ГОСТ 4165-78.

Метиленовый голубой по МРТУ 6-09-6045-69.

Молоко коровье, обезжиренное, стерильное, приготовляемое по ГОСТ 9225-84.

Молочная кислота.

Мочевина по ГОСТ 6691-77.

Мясо-пептонный бульон.

Натрий аммоний фосфорнокислый двузамещенный, 4-водный, ч. или х.ч. по ГОСТ 4170-78.

Натрий сернистокислый по ГОСТ 903-76.

Натрий серноватистокислый, ч.д.а. по СТ СЭВ 223-75.

Натрий лимоннокислый трехзамещенный, ч.д.а. по ГОСТ 22280-76.

Натрий гидроокись по ГОСТ 4328-77.

Натрий хлористый, ч., или х.ч., или ч.д.а. по ГОСТ 4233-77.

Неомицин (медпрепарат).

Парадиметиламинобензальдегид, ч. по ТУ 6-09-3272-77.

Пенициллин (медпрепарат).

Пергидроль, 30 % по ГОСТ 10929-76.

Пептон сухой ферментативный по ГОСТ 13805-76.

Полимиксина М сульфат по 500 000 ЕД (медпрепарат).

Плазма крови кролика сухая.

Сахароза по ГОСТ 5833-75.

Соль Мора по ГОСТ 4208-72.

Спирт этиловый ректификованный по ГОСТ 5962-67.

Спирт этиловый ректификованный технический по ГОСТ 18300-72.

Среда с индикатором ВР и маннитом сухая производства Дагестанского НИИ питательных сред.

Среда Кесслер сухая модифицированная по ТУ 49-365-76 производства Литовского филиала ВНИИМС.

Среда Левина сухая по ТУ 42-1495-77.

Среда Плоскирева по МРТУ 42164-67.

Среда Ресселя по ТУ 4-14128-78.

Среда Эндо.

Среда для определения дрожжей и плесневых грибов в молоке и молочных продуктах, производство Всесоюзного НИИ комплексного использования молочного сырья (г. Ставрополь).

Среда Клиглера.

Стрептомицин (медпрепарат).

Сусло солодовое неохмеленное.

Сыворотка сальмонеллезная О-агглютинирующая адсорбированная по ГОСТ 16449-78.

2, 3, 5-трифенилтетразолий хлористый, ч.д.а. по ТУ 6-09-3838-78.

Феноловый красный по ГОСТ 5853-51.

Фуксин основной по МРТУ 6-09-4119-75.

Хлороформ технический по ГОСТ 20015-74.

Экстракт кормовых дрожжей по ТУ 42-14-56-76.

Экстракт солодовый по ОСТ 18 418-84.

Яйцо куриное диетическое.

4. Подготовка к анализу

4.1. Подготовка проб к анализу

4.1.1. Молоко, сливки и другие жидкие продукты и компоненты.

Отобранные пробы перед исследованием тщательно перемешивают.

4.1.2. Сгущенные продукты и компоненты.

Отобранную пробу тщательно перемешивают стерильной ложкой, затем взвешивают стерильную сухую колбу и в нее помещают 10 г продукта.

4.1.3. Кисломолочные продукты и напитки, закваски.

Отобранные пробы перед исследованием перемешивают и нейтрализуют. Для этого на каждые 10 см³ (г) исследуемого продукта (или его первого разведения - для сухих кисломолочных продуктов), напитка или закваски в стерильную посуду добавляют 1 см³ стерильного раствора двууглекислого натрия с массовой концентрацией 100 г/дм³, содержимое перемешивают.

4.1.4. Стерилизованные продукты детского питания.

Отобранные пробы перед исследованием тщательно перемешивают. Перед вскрытием бутылок (пакетов) с продуктом крышку (поверхность пакета) протирают ватой, смоченной спиртом.

Открывают крышку фламбированным или стерильным консервным ножом. Края пакета вскрывают стерильным ножом, скальпелем или ножницами.

4.1.5. Творог, творожные изделия и пастообразные продукты.

Навеску творога, творожных изделий и пастообразных продуктов взвешивают на стерильном часовом стекле, чашке Петри, в бюксе, переносят в стерильную или фламбированную ступку, прикрытую крышкой от чашки Петри, и тщательно растирают, при посеве без разведений нейтрализуют по п. 4.1.3.

4.1.6. Топленое масло или молочный жир.

Перед исследованием пробу расплавляют на водяной бане при температуре 40 - 45 °C и перемешивают до получения однородной эмульсии.

4.1.7. Сухие продукты детского питания и компоненты.

Отобранную среднюю пробу тщательно перемешивают, взвешивают навеску продукта на кусочке стерильного пергамента, на чашке Петри, в бюксе или на часовом стекле, затем взвешенную пробу переносят в стерильную колбу или другую посуду.

4.2. Приготовление разведений продуктов для посева

4.2.1. Перед посевом готовят десятикратные разведения продукта в стерильных растворах разбавленного фосфатного буфера, изотонического раствора натрия хлорида или пептонной воды.

Для приготовления разведений готовят все необходимые стерильные материалы и посуду в соответствии со спецификой анализа исследуемого продукта: пробирки с 9 см³ или колбы с 90 см³ одного из растворов, используемых для приготовления разведений.

4.2.2. Из проб молока, сливок, кисломолочных продуктов и напитков, кукурузного масла, молочного жира и других жидких продуктов и компонентов отбирают стерильной пипеткой 10 см³ и вносят в 90 см³ одного из стерильных растворов, используемых для приготовления разведений, взбалтывают в течение 3 - 5 мин круговыми движениями до возможно более полного растворения. При этом пипетку промывают до 10 раз раствором этого продукта до верхнего уровня имеющихся на ней делений.

Получают разведение 1:10 (первое разведение).

Топленое масло и молочный жир вносят в растворы, подогретые до 40 - 45 °C.

4.2.3. Приготовленные навески по 10 г сухих молочных продуктов детского питания, сывороточных белковых концентратов, казецитов и др. компонентов, сгущенных продуктов, творога, творожных изделий и других пастообразных продуктов переносят в колбу с 90 см³ одного из стерильных растворов, используемых для приготовления разведений, подогретых до 40 - 45 °C, и взбалтывают в течение 3 - 5 мин круговыми движениями до возможно более полного эмульгирования.

Получают разведение 1:10.

При другом способе разведения к приготовленным навескам по 10 г вышеуказанных продуктов добавляют 90 см³ одного из стерильных растворов, подогретых до 40 - 45 °C, и далее поступают, как указано в п. 4.2.3.

4.2.4. Для получения однородной взвеси продукта допускается перемешивание на аппарате для встряхивания жидкостей в течение 5 - 7 мин, избегая намокания пробок. Первое разведение продукта (1:10) можно гомогенизировать в стерильном стакане гомогенизатора или растереть в стерильной ступке.

4.2.5. Из первого разведения продукта стерильной пипеткой берут 1 см³ и переносят в пробирку, содержащую 9 см³ одного из стерильных растворов, используемых для приготовления разведений, перемешивают осторожно, набирая и выдувая из пипетки 5 - 10 раз. Получают второе разведение продукта (1:100). Последующие разведения в зависимости от предполагаемого обсеменения продукта - 1:1000, 1:10 000 и т.д. готовят аналогично.

Для приготовления каждого разведения берут новую стерильную пипетку. Вводят пипетку в пробирку не более чем на 2 - 3 см ниже поверхности взвеси.

Время от момента приготовления разведений до посева не должно превышать 20 - 30 мин. Перед посевом все разведения осторожно встряхивают. При посеве на чашки Петри или в пробирки посевной материал вносят от большего разведения к меньшему. В этом случае пользуются одной пипеткой.

4.2.6. Для приготовления разведений сухих молочных каш для детского питания используют надосадочную жидкость первого разведения продукта после отстаивания его в течение 2 - 3 мин.

4.3. Подготовка посуды и материалов

4.3.1. Всю новую посуду, предназначенную для бактериологических работ, кипятят в подкисленной воде (раствор соляной кислоты с объемной долей 1 - 2 %) в течение 15 мин и затем ополаскивают дистиллированной водой.

Посуду, бывшую в употреблении, моют 0,5 %-ным щелочным раствором с помощью ершей и щеток и ополаскивают водопроводной водой. Сильно загрязненную посуду со следами жира, красок и иммерсионного масла опускают на 2 ч в хромовую смесь, подогретую до 45 °C, затем тщательно промывают проточной водопроводной водой.

Посуда с питательными средами после подсчета на них дрожжей, плесневых грибов, бактерий группы кишечных палочек, E. coli, S. aureus, энтерококков, сальмонелл и др. видов условно-патогенных и патогенных микроорганизмов обеззараживается перед мойкой путем стерилизации в автоклаве при 121 °C в течение 30 мин или кипячением в течение 1 ч.

Вымытую посуду не вытирают, а сушат при комнатной температуре или горячим воздухом.

Предметные стекла после мойки и ополаскивания вытирают чистой салфеткой или помещают в склянку с притертой пробкой в смесь этилового спирта и наркозного эфира в соотношении 1:1.

4.3.2. Лабораторную посуду перед использованием обязательно стерилизуют. Стерилизацию осуществляют сухим жаром в сушильном шкафу при 160 °C в течение 2 ч или паром в автоклаве при 1 атм. (121 °C) в течение 30 мин с последующим подсушиванием в сушильном шкафу.

Чашки Петри, пипетки и т.п. стерилизуют завернутыми в плотную оберточную бумагу или в пеналах. В верхнюю часть пипетки предварительно вкладывают кусочек ваты.

Пробирки, флаконы, бутылки, колбы закрывают ватно-марлевыми пробками. Поверх пробки (кроме пробирок) надевают бумажный колпачок, который обвязывают вокруг горлышка ниткой или закрепляют резиновым колечком.

Каучуковые, корковые и стеклянные пробки стерилизуют отдельно в автоклаве завернутыми в бумагу.

Стерильную посуду хранят в плотно закрывающихся шкафах или ящиках с крышками. Срок хранения стерильной посуды не более 30 сут.

5. Питательные среды и реактивы

5.1. Питательные среды и реактивы общего назначения

5.1.1. Концентрированный фосфатный буферный раствор.

Взвешивают 34,0 г однозамещенного фосфорнокислого калия и растворяют в 500,0 см³ дистиллированной воды в мерной колбе вместимостью 1000 см³. Устанавливают pH раствора 7,2 1 н раствором гидроокиси натрия и доводят дистиллированной водой до 1000 см³. Хранят в емкости, укупоренной резиновой пробкой, в условиях холодильника.

5.1.2. Разбавленный фосфатный буферный раствор.

Вносят пипеткой вместимостью 2,0 см³ 1,25 см³ концентрированного фосфатного буферного раствора в мерную колбу вместимостью 1000 см³ и доводят объем дистиллированной водой до метки, проверяют pH (7,0 - 7,2).

Разливают разбавленный фосфатный буферный раствор по 10,0 см³ в пробирки, по 100,0 см³ в колбы вместимостью 200 см³ и по 900,0 см³ в колбы вместимостью 1600 см³, закрывают ватными пробками. Стерилизуют в автоклаве при 121 °C в течение 20 мин.

5.1.3. 0,1 %-ный водный раствор пептона (пептонная вода).

К 1 л дистиллированной воды добавляют 1 г пептона. После размешивания среду кипятят, фильтруют и разливают в пробирки и флаконы в необходимых количествах. Стерилизуют при 121 °C в течение 30 мин.

5.1.4. Изотонический 0,85 %-ный раствор хлористого натрия.

Для приготовления изотонического раствора с pH 6,9 - 7,0 используют дистиллированную воду, pH которой проверяют индикатором бромтимолблау. При его добавлении цвет воды должен быть бутылочно-зеленым. В иных случаях воду не используют.

В 1 дм³ воды растворяют 8,5 г хлористого натрия, разливают раствор в чистые пробирки диаметром 18 - 20 мм по 10 см³, а в колбы - по 93 см³ и стерилизуют в течение 15 мин при 121 °C.

5.1.5. Стерильная дистиллированная вода.

Дистиллированную воду разливают в колбы или пробирки в необходимых количествах и стерилизуют 20 мин при 121 °C.

5.1.6. Реактивы для окраски по Граму (модификация Г.П. Калины).

Реактив 1.

К 100 см³ этилового спирта добавляют 0,5 г кристаллического фиолетового.

Реактив 2.

К 96 см³ 0,5 %-ного спиртового раствора йодистого калия добавляют 2 см³ 5 %-ного спиртового раствора основного фуксина и 2 см³ 5 %-ного спиртового раствора йода.

Примечание. Растворение йодистого калия в спирте рекомендуется проводить в водяной бане при температуре 45 - 50 °C при постоянном помешивании.

5.1.7. Приготовление реактивов из метиленового голубого:

а) приготовление основного спиртового раствора метиленового голубого.

10 г метиленового голубого смешивают со 100 см³ 96 %-ного этилового спирта. Раствор ставят в термостат при температуре 37 °C на 24 ч, а затем фильтруют в термостате при той же температуре.

Срок хранения основного раствора метиленового голубого в термостате при температуре 37 °C не более 3 мес. при условии герметичной укупорки;

б) приготовление рабочего раствора метиленового голубого.

Основной раствор помещают в водяную баню при температуре 45 °C на 5 - 10 мин, перемешивают до полного растворения кристаллов. Затем быстро охлаждают до температуры 20 °C и 5 см³ этого раствора прибавляют к 195 см³ дистиллированной воды. Смесь хорошо перемешивают. Срок хранения рабочего раствора метиленового голубого - не более 7 сут. при температуре не выше 8 - 10 °C;

в) приготовление раствора метиленового голубого для окраски препаратов.

К 30 см³ основного спиртового раствора метиленового голубого прибавляют 100 см³ дистиллированной воды и 1 см³ раствора гидроокиси калия с массовой концентрацией 10 г/дм³.

5.1.8. Приготовление карболового раствора кристаллического фиолетового для окраски препаратов.

1 г красителя кристаллического фиолетового растирают в ступке с 2 г кристаллической карболовой кислоты до кашицы, прибавляют небольшими порциями 10 см³ 96 %-ного этилового спирта. Доводят объем до 100 см³ дистиллированной водой. Таким образом получают основной раствор для приготовления рабочего раствора.

К 10 см³ основного карболового раствора кристаллического фиолетового добавляют 90 см³ дистиллированной воды. Тщательно перемешивают.

Растворы хранят в темном флаконе под притертой пробкой.

5.1.9. Мясо-пептонный бульон.

Говяжье мясо, освобожденное от жира и сухожилий, пропускают через мясорубку, взвешивают, складывают в кастрюлю, смешивают с двойным количеством водопроводной воды и оставляют на 12 - 14 ч при температуре 4 - 6 °C. Для ускорения процессов экстракции питательных веществ содержимое кастрюли подогревают при 50 °C в течение 1 ч и затем кипятят 30 мин. После кипячения бульон в горячем состоянии фильтруют через двойной бумажный или ватно-марлевый фильтр. Фильтрат измеряют и добавляют к нему водопроводную воду до первоначального объема, а также 1 % пептона и 0,5 % поваренной соли. После установления реакции (pH 7,2 - 7,4) бульон разливают в колбы и стерилизуют при 121 °C в течение 20 мин.

Бульон перед использованием фильтруют через складчатый фильтр, разливают по пробиркам и стерилизуют при 121 °C в течение 10 мин.

5.1.10. Мясо-пептонный агар.

К 1 дм³ мясо-пептонного бульона или перевара Хоттингера с концентрацией аминного азота не менее 100 мг/л добавляют 15 г мелко нарезанного агара в волокнах или порошке. После 10 - 15-минутного набухания агар-агара смесь кипятят при постоянном помешивании до полного его растворения. Полученную среду после установления pH 7,2 - 7,4 фильтруют в горячем виде через ватно-марлевый фильтр, разливают во флаконы и пробирки и стерилизуют при 121 °C 20 мин.

5.1.11. Раствор двууглекислого натрия для нейтрализации кисломолочных продуктов.

10 г двууглекислого натрия помещают в мерную колбу вместимостью 100 см³, растворяют дистиллированной водой, доводят объем раствора до метки. Раствор разливают в пробирки и стерилизуют при 121 °C в течение 30 мин.

5.2. Специальные питательные среды и реактивы

5.2.1. Среды для определения общего количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов

5.2.1.1. Среда для определения общего количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов.

5.2.1.2. Сухая питательная среда производства Всесоюзного НИИ комплексного использования молочного сырья (г. Ставрополь) (ТУ 49 513-78). Подготовку среды для посева проводят согласно прописи на этикетке^*(1).

____________

^*(1) Использование среды 5.2.1.2 допускается только в ведомственных лабораториях Госагропрома СССР.

В арбитражных случаях использование среды 5.2.1.1 обязательно.

5.2.2. Среды и реактивы для обнаружения бактерий группы кишечных палочек и эшерихий коли.

5.2.2.1. Среда Кесслера (с лактозой).

К 1 дм³ водопроводной воды добавляют 10 г пептона и 50 см³ стерильной бычьей желчи. Смесь кипятят на водяной бане при помешивании 20 - 30 мин. Затем фильтруют ее через ватно-марлевый фильтр, добавляют 2,5 г лактозы, доводят объем водой до 1 дм³. Устанавливают pH 7,4 - 7,6, используя 1 н растворы NaOH или HCl и проверяя значение pH на потенциометре или универсальной индикаторной бумагой. Добавляют 4 см³ 1 %-ного водного раствора генцианового фиолетового, разливают в пробирки по 10 см³, закладывают поплавки. Стерилизуют 15 мин при 121 °C.

5.2.2.2. Сухая среда Кесслера (модифицированная) производства Литовского филиала ВНИИМС (ТУ 49 365-76) с учетом изм. № 2 от 01.05.85 г.

Подготовку среды для посева проводят согласно прописи на этикетке.

5.2.2.3. Среды Левина, Эндо.

Среды Левина (эозинметиленовоголубой агар), Эндо выпускаются в сухом виде Дагестанским НПО «Питательные среды». Их следует готовить согласно прописям, указанным на этикетке банок. Изготовленные и разлитые в стерильные чашки Петри среды можно хранить при температуре 4 °C до 10 сут.

5.2.2.4. Среда на индол.

10,0 г сухого панкреатического гидролизата казеина (или 100,0 см³ жидкого панкреатического гидролизата казеина с содержанием 500 мг% аминного азота), 5,0 г хлористого натрия, 1,0 г DL-триптофана растворяют в 1 дм³ дистиллированной воды. Доводят pH до 7,0 1 н растворами NaOH или HCl и, измеряя значение pH на потенциометре или по универсальной индикаторной бумаге, разливают в пробирки по 5 см³, стерилизуют 15 мин при 121 °C.

5.2.2.5. Среда Кларка.

Взвешивают 5,0 пептона, 5,0 г глюкозы, 5,0 г двузамещенного фосфорнокислого калия. Растворяют ингредиенты в 950 см³ дистиллированной воды, устанавливают pH 6,9 ± 0,1, используя 1 н растворы NaOH или HCl. Проверяют pH на потенциометре или универсальной индикаторной бумагой. Доводят общий объем до 1000 см³ дистиллированной водой и при необходимости фильтруют. Разливают в пробирки по 5 см³, стерилизуют в течение 20 мин при 115 °C.

5.2.2.6. 90 %-ный раствор этилового спирта.

В колбу емкостью 1000 см³ с 900 см³ 96 %-ного этилового спирта добавляют 60 см³ дистиллированной воды.

5.2.2.7. Раствор индикатора метилового красного.

0,1 г индикатора метилового красного помещают в мерную колбу вместимостью 500 см³, растворяют в 300 см³ 90 %-ного раствора этилового спирта, доливают до 500 см³ дистиллированной водой. Хранят раствор в колбе с притертой пробкой при температуре 4 °C.

5.2.2.8. 0,5 %-ный раствор бромтимолового синего в спирте.

Взвешивают 0,5 г бромтимолового синего, помещают в мерную колбу вместимостью 100 α-нафтола и доводят этиловым спиртом до метки. Раствор хранят при температуре 4 °C в течение 30 сут. в колбе с притертой пробкой.

5.2.2.9. 0,5 %-ный и 0,1 %-ный растворы бриллиантового зеленого.

Для приготовления 0,5 %-ного раствора асептически взвешивают 0,5 г индикатора бриллиантового зеленого, вносят в стерильную мерную колбу вместимостью 100 см³ и доводят стерильной дистиллированной водой до метки.

Для приготовления 0,1 %-ного раствора в стерильный мерный цилиндр или колбу к 10 см³ исходного 0,5 %-ного раствора индикатора добавляют 40 см³ стерильной дистиллированной воды.

Растворы хранят в холодильнике в течение 7 сут.

5.2.2.10. 1,6 %-ный раствор бромкрезолового пурпурного в спирте.

Взвешивают 1,6 г индикатора бромкрезолового пурпурного и количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 см³. Доводят 96 %-ным этиловым спиртом до метки. При необходимости фильтруют через бумажный фильтр. Хранят в колбе со шлифом в условиях холодильника.

5.2.2.11. 5 %-ный раствор α-нафтола.

Взвешивают 5,0 г α-нафтола, растворяют в 100 см³ 96 %-ного этилового спирта. Хранят раствор при температуре 4 °C.

5.2.2.12. 40 %-ный раствор гидроокиси калия.

В стакане вместимостью 100 см³ взвешивают 40,0 г гидроокиси калия, переносят в мерную колбу вместимостью 100 см³, растворяют в 60,0 см³ дистиллированной воды, затем доводят до метки дистиллированной водой. Раствор хранят при температуре 4 °C.

5.2.2.13. 1 %-ный водный раствор генцианового (кристаллического) фиолетового.

Взвешивают 1,0 г генцианового (кристаллического) фиолетового, помещают в мерную колбу вместимостью 100 см³ и доводят до метки дистиллированной водой. Раствор хранят при температуре 4 °C в течение 7 сут.

5.2.2.14. Реактив на индол (Эрлиха).

Взвешивают 5,0 г парадиметиламинобензальдегида в стеклянном стакане вместимостью 100 см³, помещают в коническую колбу вместимостью 200 см³ и растворяют в 50 см³ этилового спирта. С помощью мерного цилиндра вместимостью 100 см³ медленно добавляют 50 см³ концентрированной соляной кислоты. Раствор хранят в колбе с притертой пробкой при температуре 4 °C.

5.2.2.15. Среда Козера.

Взвешивают 1,5 г натрия-аммония фосфорнокислого, 1,0 г калия фосфорнокислого двузамещенного, 0,2 г магния сульфата, 3,0 г натрия лимоннокислого трехзамещенного. Растворяют в 950 см³ дистиллированной воды, добавляют 10 см³ 0,5 %-ного спиртового раствора бромтимолового синего. Устанавливают pH 6,8 1 н растворами NaOH или HCl, проверяя значение pH на потенциометре. Доводят объем дистиллированной водой до 1 дм³. Разливают по 10 см³ в пробирки, стерилизуют в течение 15 мин при 121 °C.

5.2.2.16. Среда Симмонса.

Среду готовят аналогично среде Козера (п. 5.2.2.15), но после измерения pH в нее добавляют 20 г агар-агара на 1000 см³, прогревают на водяной бане до расплавления агара, стерилизуют в течение 15 мин при 121 °C. Разливают в стерильные чашки Петри или пробирки.

5.2.2.17. Среда с 5 % сахарозы.

В 1000 см³ дистиллированной воды растворяют 30 г сухого питательного агара Дагестанского НПО «Питательные среды» и 50 г сахарозы. Стерилизуют 30 мин при 112 °C.

5.2.3. Среды и реактивы для обнаружения бактерий рода Salmonella.

5.2.3.1. Магниевая среда.

Среду готовят из трех растворов^*(2).

____________

^*(2) При использовании среды двойной концентрации масса (объем) всех ингредиентов, кроме воды, удваивается.

После растворения всех ингредиентов растворы соединяют, разливают приготовленную таким образом среду в колбы и флаконы.

Среду стерилизуют при температуре 112 °C в течение 30 мин.

5.2.3.2. Дрожжевой диализат.

Взвешивают 1000 г свежих хлебных (прессованных) дрожжей, размешивают в 1000 см³ дистиллированной воды в кастрюле до состояния гомогенной массы, которую переливают в целлофановый мешок, предварительно промытый дистиллированной водой. Мешок завязывают, обмывают под струей питьевой воды, а затем дистиллированной водой и погружают в эмалированную посуду, в которую предварительно наливают 1300 см³ дистиллированной воды. Мешок должен быть полностью погружен в жидкость. Диализ ведут при температуре 60 - 80 °C в течение 6 ч. За это время количество жидкости в кастрюле должно уменьшиться примерно в 2 раза. Затем жидкость из кастрюли переливают в стерильную бутыль и добавляют хлороформ (0,5 % к общему объему жидкости) и сохраняют при 5 - 7 °C до 7 мес.

5.2.3.3. Среда Мюллера.

К 90 см³ стерильного мясо-пептонного бульона добавляют:

а) 4,5 г химически чистого мела, предварительно простерилизованного во флаконе сухим жаром (при 160 °C в течение 2 ч);

б) 10 см³ раствора гипосульфита натрия (50 г чистого кристаллического гипосульфита натрия в 100 см³ дистиллированной воды стерилизуют текучим паром в течение 30 мин);

в) 2 см³ раствора Люголя (металлического йода 25 г, йодистого калия 20 г, дистиллированной воды 100 см³).

После добавления указанных ингредиентов смесь взбалтывают и разливают в пробирки по 10 - 15 см³.

5.2.3.4. Среда Кауфмана.

К 100 см³ среды Мюллера добавляют 1 см³ водного раствора бриллиантового зеленого (1:1000) и 5 см³ стерильной бычьей желчи. Приготовленную смесь стерилизуют текучим паром в течение 30 мин. Среда сохраняется длительное время. До стерилизации среда зеленого цвета, после стерилизации она приобретает зеленовато-коричневый тон.

5.2.3.5. Селенитовая среда накопления Лейфсона^*(2)

____________

^*(2) При использовании среды двойной концентрации масса (объем) всех ингредиентов, кроме воды, удваивается.

Среду готовят из двух основных растворов. Прежде всего экспериментально определяют точную пропорцию двузамещенного и однозамещенного фосфата натрия, которая с используемым образцом пептона и кислого селенистокислого натрия дает pH не выше 6,9 - 7,1, что регулируется соотношением фосфатов. Такая предварительная подтитровка производится всякий раз, когда меняется серия любого из входящих в среду основных ингредиентов (пептон, кислый селенистокислый натрий, фосфаты).

После установления указанных соотношений к приготовленному раствору фосфатов добавляют пептон и лактозу, разливают во флаконы по 50 мл и стерилизуют текучим паром 2 дня по 30 мин или при 112 °C однократно в течение 30 мин.

Отдельно на стерильной воде асептически готовят 10 %-ный раствор кислого селенита натрия. Перед началом работы на каждый флакон с 50 см³ основного раствора добавляют 2 см³ раствора кислого селенита натрия. Приготовленную среду разливают в необходимых количествах в стерильные пробирки или колбы, закрывают плотно пригнанными пробками.

5.2.3.6. Среда Плоскирева и висмут-сульфитный агар.

Среда Плоскирева и висмут-сульфитный агар (ВСА) выпускаются в сухом виде Дагестанским НПО «Питательные среды». Их следует готовить согласно прописям, указанным на этикетках банок. Изготовленные и разлитые в стерильные чашки Петри среды можно хранить в холодильнике до 10 сут.

5.2.3.7. Трехсахарный агар с мочевиной (среда Олькеницкого).

Трехсахарный агар с мочевиной готовят смешением следующих ингредиентов:

Тщательно перемешивают и устанавливают pH 7,2 - 7,4. Разливают в пробирки по 5 см³ и стерилизуют текучим паром по 20 мин 3 дня подряд. После стерилизации среду скашивают. Готовая среда имеет бледно-розовый цвет.

5.2.3.8. 0,4 %-ный водный раствор фенолового красного.

Взвешивают 0,1 г индикатора фенолового красного, вносят в колбу вместимостью 50 см³ и вливают 25 см³ дистиллированной воды. Тщательно перемешивают до полного растворения. Раствор хранят в холодильнике до 7 сут.

Для получения 0,04 %-ного рабочего раствора индикатора 1 см³ 0,4 %-ного раствора смешивают с 9 см³ дистиллированной воды.

5.2.3.9. Среда Ресселя из сухих питательных сред.

К 950 см³ дистиллированной воды добавляют 40 г сухого питательного агара с лактозой и индикатором ВР производства ДагНПО «Питательные среды» и 5 г питательного агара. Смесь растворяют при нагревании до кипения. Затем в 50 см³ дистиллированной воды растворяют 1 г химически чистой глюкозы и добавляют к приготовленной смеси.

Разливают в стерильные пробирки по 5 - 6 см³ и стерилизуют текучим паром 3 дня подряд по 30 мин или однократно при 111 °C 30 мин. Среду скашивают так, чтобы остался небольшой столбик (не менее 3 см высотой).

5.2.3.10. Среда Клиглера из сухих питательных сред.

Среду готовят и стерилизуют согласно прописи на этикетке. Готовую среду скашивают в пробирках так, чтобы остался небольшой столбик (не менее 3 см высотой).

5.2.3.11. Поливалентная агглютинирующая сальмонеллезная сыворотка.

Необходимые разведения сыворотки готовят перед использованием согласно прилагаемой к коробке инструкции.

5.2.4. Среды и реактивы для обнаружения стафилококков.

5.2.4.1. Солевой бульон.

К 100 см³ мясо-пептонного бульона (МПБ) с pH 7,2 - 7,4 в колбе вместимостью 200 см³ добавляют 6,5 г хлористого натрия и разливают в пробирки по 10,0 см³. Стерилизуют в автоклаве при 121 °C в течение 20 мин.

5.2.4.2. Агар типа Байрд-Паркер.

30 г сухого питательного агара на основе ферментативного гидролизата кормовых дрожжей производства ДагНПО «Питательные среды» размешивают в 1 дм³ дистиллированной воды, добавляют 10 г пирувата натрия, 5 г хлористого лития, тщательно перемешивают. Смесь нагревают при помешивании и кипятят в течение 1 мин. до полного растворения ингредиентов. Устанавливают pH 7,2. Разливают во флаконы объемами 100 - 200 - 300 см³ в зависимости от потребности и стерилизуют при 121 °C 15 мин. Среда может храниться в течение месяца в условиях холодильника. Перед употреблением в растопленную и охлажденную до 45 - 50 °C среду с соблюдением правил асептики прибавляют (из расчета на 100 см³ среды) 0,5 см³ 2 %-ного раствора теллурита калия и 5 см³ эмульсии яичного желтка. Среду тщательно перемешивают и разливают в чашки Петри в объеме не менее 20 см³ на чашку. Чашки со средой могут быть использованы в течение 24 часов, максимум 48 часов. Перед посевом чашки со средой подсушивают в термостате общепринятым способом.

5.2.4.3. Желточно-солевой агар (ЖСА).

Основа - солевой агар: к мясо-пептонному бульону (МПБ) с pH 7,2 - 7,4 добавляют 2 % агара и 6,5 % хлористого натрия, расплавляют на водяной бане, при необходимости фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают мерным цилиндром по 100 см³ в колбы вместимостью 250 см³ и стерилизуют при 121 °C в течение 30 мин. Получают солевой агар. Вместо мясо-пептонного бульона можно использовать сухой питательный агар, добавив к нему 6,5 % хлористого натрия.

ЖСА: на 100 см³ стерильного расплавленного и остуженного до 45 °C солевого агара добавляют 20 см³ эмульсии яичного желтка. После полного размешивания желточно-солевой агар разливают в стерильные чашки Петри по 20 - 25 см³ и хранят в холодильнике до 5 - 7 дней.

5.2.4.4. Эмульсия яичного желтка.

На дно стерильной чашки Петри помещают куриное яйцо, которое тщательно протирают ватой, смоченной этиловым спиртом. Стерильным пинцетом пробивают с двух противоположных сторон яйца два отверстия. Через одно из этих отверстий из яйца полностью удаляют белок, а затем, несколько увеличив отверстие, выливают желток в стерильную колбу вместимостью 200 см³. К желтку постепенно добавляют (частями по 20 - 30 см³) 180 - 200 см³ стерильного физиологического раствора, затем содержимое тщательно встряхивают до получения гомогенной массы.

5.2.4.5. Цитратная плазма кролика.

Цитратная плазма кролика для реакции плазмокоагуляции выпускается в сухом виде. Готовят непосредственно перед употреблением согласно прописи в прилагаемом наставлении.

5.2.5. Среды и реактивы для обнаружения B. cereus.

5.2.5.1. Среда Донована.

К 1 дм³ расплавленного питательного или мясо-пептонного агара добавляют 2,5 г трехзамещенного цитрата натрия, 2,5 г хлористого лития, стерилизуют при 110 °C 30 мин, охлаждают до 45 - 50 °C, добавляют 200 000 ЕД полимиксина М и эмульсию двух желтков. Тщательно перемешивают и разливают в чашки Петри, которые можно хранить в холодильнике не более 7 - 10 суток.

5.2.5.2. Эмульсия яичных желтков.

Асептически отделяют от яиц 2 желтка, как описано в 5.2.4.4. К желткам добавляют 10 см³ стерильного физиологического раствора, тщательно встряхивают для получения гомогенной массы.

5.2.5.3. Солевой полимиксиновый агар с 2, 3, 5-трифенилтетразолием хлористым.

К 1 дм³ 2 % питательного или мясо-пептонного агара добавляют 60,0 г хлористого натрия, 200 000 - 400 000 ЕД полимиксина М, 0,1 - 0,2 г 2, 3, 5-трифенилтетразолия хлористого, эмульсию двух желтков.

Полимиксин, 2, 3, 5-трифенилтетразолий хлористый и эмульсию желтков добавляют в агар после расплавления и охлаждения до 40 - 45 °C, хорошо перемешивают и разливают в чашки Петри. Хранят среду в холодильнике не более 7 - 10 сут.

5.2.5.4. Кровяной агар.

К 100 см³ расплавленного и остуженного до 40 - 45 °C 2 % мясо-пептонного агара добавляют 5 см³ дефибринированной крови^*(3) человека, барана или кролика, тщательно перемешивают и разливают в стерильные чашки Петри. Приготовленную среду хранят в холодильнике до 5 сут.

____________

^*(3) В качестве антикоагулянта применяют 5 %-ный раствор лимоннокислого натрия или 5 %-ный раствор щавелевокислого натрия (или калия). Антикоагулянт берут из расчета 1 объем на 9 объемов крови (1:9).

5.2.5.5. Среда с маннитом.

В дистиллированную воду прибавляют 1 % пептона и 0,5 % хлористого натрия. Растворяют при нагревании, прибавляют 0,1 % спиртового (1,6 %) раствора бромкрезолового пурпурного (можно бромтимолового синего), нагревают до 80 °C и устанавливают pH 7,2, проверяя значение на pH-метре. Затем среду кипятят 5 мин, фильтруют и доливают до первоначального объема дистиллированной водой. Добавляют 0,5 - 1 % маннита, разливают по пробиркам с поплавками. Стерилизуют автоклавированием при 115 °C 15 мин.

5.2.5.6. Среда с индикатором ВР и маннитом сухая производства ДагНПО «Питательные среды».

Подготовку среды для посева проводят согласно прописи на этикетке.

5.2.6. Среды и реактивы для обнаружения плесневых грибов и дрожжей.

5.2.6.1. Солодовое сусло с массовой долей сухих веществ (7,5 ± 0,5) %.

Сусло фильтруют через полотно или фильтровальную бумагу и стерилизуют 30 мин в автоклаве при 108 °C. Затем сусло декантируют. В сусле определяют содержание сухих веществ ареометром-сахаромером. Сусло разбавляют водой до массовой доли сухих веществ (7,5 ± 0,5) %, разливают в колбы и стерилизуют при 116 °C в течение 20 мин. Солодовое сусло можно заменить виноградным суслом, которое готовят аналогично солодовому.

5.2.6.2. Сусловый агар.

К 1 дм³ солодового сусла с массовой долей сухих веществ (7,5 ± 0,5) % прибавляют 30 г агара. Среду нагревают до полного расплавления агара и фильтруют через гигроскопическую вату или фильтровальную бумагу. Охлаждают до 50 °C и устанавливают pH 3,6 с помощью молочной кислоты, разливают в колбы или пробирки и стерилизуют 20 мин при 116 °C.

5.2.6.3. Агар сывороточный «БФ».

К 1 дм³ дистиллированной воды прибавляют 60 г порошка агара сывороточного «БФ», нагревают до полного растворения (при наличии осадка фильтруют). Устанавливают pH 4,0 - 4,5 добавлением молочной кислоты, разливают в пробирки или колбы и стерилизуют при 121 °C в течение 15 мин.

5.2.6.4. Среда для определения дрожжей и плесневых грибов в молоке и молочных продуктах производства Всесоюзного НИИ комплексного использования молочного сырья (г. Ставрополь)^*(4).

____________

^*(4) Использование сред 5.2.6.4 и 5.2.6.6 допускается только в ведомственных лабораториях Госагропрома СССР.

Среда готовится по прописи на этикетке.

5.2.6.5. Среда Сабуро.

К 1 дм³ дистиллированной воды добавляют 18,0 г агара и оставляют на 30 мин для его набухания, затем добавляют 40,0 г мальтозы или глюкозы и 10,0 г пептона, нагревают до полного растворения (при наличии осадка фильтруют). Устанавливают pH с помощью молочной кислоты таким образом, чтобы после стерилизации он составлял при 25 °C 6,5. Разливают в пробирки или колбы и стерилизуют при 116 °C в течение 20 мин.

5.2.6.6. Среда с солодовым экстрактом.

К 1 дм³ дистиллированной воды добавляют 20 г солодового экстракта, 5 г пептона, 0,4 г лимонной кислоты, 5 г сахарозы, 18 г агара. Среду плавят в автоклаве, поднимая температуру до 120 °C (без выдержки). Давлению дают упасть, расплавленную среду фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают и стерилизуют при 115 °C в течение 15 мин.

Среды хранят при температуре 4 °C не более 14 сут.

Для повышения элективности питательных сред 5.2.6.2. - 5.2.6.6. добавляют антибиотики в соответствии с табл. 8.

Таблица 8

Водные растворы антибиотиков вносят перед использованием в расплавленную и охлажденную до 46 °C питательную среду.

Среды с антибиотиками хранению не подлежат.

5.2.6.7. Приготовление раствора пенициллина.

Во флакон с пенициллином, содержащим 500 000 ЕД, добавляют 5 - 7 см³ стерильной дистиллированной воды, тщательно перемешивают до растворения. Содержимое флакона переносят в стерильную мерную колбу вместимостью 100 см³ и доводят до метки стерильной дистиллированной водой при температуре 35 - 40 °C. Получают раствор пенициллина, содержащий 5000 ЕД в 1 мл.

При использовании флаконов с пенициллином другой активности его растворяют в мерной колбе соответствующей вместимости.

5.2.6.8. Приготовление раствора стрептомицина.

400 мг стрептомицина вносят в стерильную мерную колбу вместимостью 100 см³, добавляют 10 - 20 см³ стерильной дистиллированной воды при температуре 35 - 40 °C, перемешивают до растворения, затем доливают стерильной дистиллированной водой до метки. Массовая доля стрептомицина в растворе - 0,4 %.

5.2.6.9. Приготовление раствора неомицина.

500 г неомицина вносят в стерильную мерную колбу вместимостью 100 см³, добавляют 10 - 20 см³ стерильной дистиллированной воды при температуре 35 - 40 °C, перемешивают до растворения, затем доливают стерильной дистиллированной водой до метки. Массовая доля неомицина в растворе 0,5 %.

5.2.6.10. Приготовление раствора левомицетина (хлорамфеникола).

400 мг левомицетина вносят в стерильную мерную колбу вместимостью 100 см³, добавляют 10 - 20 см³ стерильной дистиллированной воды при температуре 35 - 40 °C, перемешивают до растворения, затем доливают стерильной дистиллированной водой до метки. Массовая доля левомицетина в растворе 0,4 %.

5.2.7. Среды и реактивы для определения бифидобактерий.

5.2.7.1. Гидролизованное молоко.

Обычное или восстановленное обезжиренное молоко (обрат) доводят до кипения и кипятят 2 мин, охлаждают до 14 °C, устанавливают pH 7,9 10 - 20 %-ным раствором NaOH.

Добавляют панкреатин из расчета 1 г/дм³, предварительно разведенный в небольшом количестве нагретой до 44 °C воды, размешивают и ставят в термостат на 40 °C под ватной пробкой. В течение первых двух часов перемешивание и коррекцию pH до 7,9 проводят каждые 30 мин, в следующие два часа - через каждый час. Через 4 ч от начала гидролиза добавляют 1 - 2 % хлороформа, закрывают резиновой пробкой и ставят в термостат. Через 4 ч доводят pH до 4,4 30 %-ным раствором уксусной кислоты, кипятят, помешивая, не менее 15 мин, фильтруют через бумажный фильтр. Готовый гидролизат должен содержать 200 - 300 мг % аминного азота. Хранят гидролизат под хлороформом (1 % к объему) при 6 °C.

5.2.7.2. Гидролизатно-молочная среда.

Гидролизованное молоко, приготовленное по п. 5.2.7.1, разводят питьевой водой в соотношении 1:1.

В небольшом количестве разведенного гидролизата расплавляют агар в количестве 2,5 г на 1 дм³ приготовляемой среды. К остальному количеству гидролизата добавляют 20 г пептона и 3,5 г хлористого натрия, смесь нагревают до температуры 80 °C, после чего соединяют с расплавленным агаром. В смеси устанавливают pH 7,5, кипятят в течение 15 мин, дают отстояться, сливают с осадка, не фильтруя, доливают горячей дистиллированной водой до заданного объема и добавляют в нее 10,0 г лактозы и 0,15 г солянокислого цистина. Среду разливают в пробирки высоким столбиком 10 см³ и стерилизуют при температуре 112 °C в течение 30 мин с предварительным подогревом автоклава паром в течение 30 мин, pH готовой среды 7,1.

5.2.7.3. Кукурузно-лактозная среда.

В небольшом количестве дистиллированной воды расплавляют агар в количестве 2,5 г на 1 дм³ приготовляемой среды. К остальному количеству дистиллированной воды добавляют 10 г пептона, 40 см³ водного раствора кукурузного экстракта, разбавленного 1:6, 6 г натрия лимоннокислого трехзамещенного, 0,12 г магния сернокислого, 2 г калия фосфорнокислого двузамещенного, смесь нагревают до температуры 80 °C, после чего соединяют с расплавленным агаром, добавляют 10 г лактозы и 0,15 г солянокислого цистина или 0,5 г аскорбиновой кислоты. Цистин предварительно растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды, в которой устанавливают pH 8,5 с помощью 10 % раствора NaOH, и нагревают на водяной бане до полного его растворения. Смесь доливают горячей дистиллированной водой до заданного объема и устанавливают pH среды 7,1 с помощью 40 %-ного раствора NaOH или 25 %-ного раствора аммиака. Среду разливают в пробирки высоким столбиком по 10 см³ и стерилизуют при 0,05 МПА в течение 30 мин.

5.2.8. Среда для обнаружения ацидофильных бактерий.

5.2.8.1. Стерилизованное обезжиренное молоко.

Обезжиренное молоко (кислотность 16 - 18 °Т) разливают в пробирки по 10 см³ и затем стерилизуют при 115 °C в течение 10 мин.

5.2.9. Среды и реактивы для обнаружения энтерококков.

5.2.9.1. Молочная среда с полимиксином по Г.П. Калине.

К 1 дм³ мясо-пептонного бульона добавляют 5,0 г натрия хлористого, 15,0 г агара. Стерилизуют при 121 °C в течение 20 мин. Полученный таким образом основной агар расплавляют и охлаждают до 45 °C. К 85,0 см³ основного агара добавляют 1,25 см³ 0,01 %-ного водного раствора кристаллического фиолетового, 0,50 см³ 10 %-ного водного раствора 2, 3, 5-трифенилтетразолия хлористого, 15 см³ стерильного обезжиренного молока (п. 5.2.8.1), 20 000 - 40 000 ЕД полимиксина М. Все ингредиенты асептически смешивают и среду тонким слоем разливают в чашки Петри. Чашки со средой можно хранить в холодильнике в течение 7 - 10 сут.

5.2.9.2. 1 %-ный раствор перекиси водорода.

К 320 см³ дистиллированной воды в колбе вместимостью 400 см³ добавляют 10 см³ концентрированного раствора пергидроля с исходной концентрацией 33 %. Тщательно перемешивают, переливают в колбу с притертой пробкой. Хранят в холодильнике в колбе, обернутой темной бумагой.

5.2.9.3. Бульон с 40 % желчи.

К 60 см³ мясо-пептонного бульона прибавляют 40 см³ нативной профильтрованной желчи крупного рогатого скота, устанавливают pH 7,2 - 7,4. Разливают во флаконы или пробирки, стерилизуют при 121 °C в течение 30 мин.

5.2.9.4. Бульон с pH 9,6.

Мясо-пептонный бульон с pH 7,2 - 7,4 нейтрализуют 1 н раствором гидроокиси натрия до pH 9,6, проверяя значение pH универсальной индикаторной бумагой или по pH-метру. Разливают в пробирки или флаконы и стерилизуют при 121 °C в течение 30 мин.

5.2.10. Контроль питательных сред.

5.2.10.1. Определение активной кислотности (pH).

Электрометрическое определение проводят на потенциометре или pH-метре по прилагаемым к ним инструкциям.

Определение активной кислотности с помощью индикаторной бумаги проводится по прилагаемой к ней инструкции.

5.2.10.2. Контроль на стерильность.

Среды проверяют на стерильность путем выдержки при температуре 37 °C в течение двух суток. Если после этого на пробных питательных средах не обнаруживается колоний микроорганизмов, а в жидких средах нет помутнения среды или осадка, свидетельствующих о росте микроорганизмов, питательные среды считаются стерильными.

5.2.10.3. Сроки и условия хранения питательных сред.

При отсутствии специально установленных условий и сроков хранения плотные питательные среды хранят не более 1 мес. при температуре 20 °C и не более двух мес. при температуре 6 °C. Жидкие питательные среды хранят не более 14 дней при 6 °C.

6. Методы анализа

При контроле микробиологического качества и безопасности продуктов детского питания определяются следующие группы микроорганизмов: общее количество мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов, бактерии группы кишечных палочек, E. coli, S. aureus, B. cereus, бактерии рода Salmonella, дрожжи, плесневые грибы.

В кисломолочных продуктах проводится также контроль за количеством технологически значимой микрофлоры: молочнокислых бактерий и бифидобактерий. Проведенные исследования по определению E. coli и S. aureus показали идентичность результатов, получаемых при посеве 10 и 11 г продукта. Исходя из этого для упрощения выполнения анализов вводится объем посевного материала 10 г взамен рекомендованного ранее 11 г.

Следует обратить внимание лабораторных работников на обязательное использование при проведении посевов на индикаторные, условно-патогенные и патогенные микроорганизмы контрольных культур соответствующих микроорганизмов, которые следует изучать в тестах идентификации параллельно с культурами, выделенными из исследуемых образцов продуктов.

6.1. Определение общего количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов

6.1.1. Сущность метода.

Метод основан на количественном подсчете колоний микроорганизмов, вырастающих на плотном питательном агаре при температуре 30 °C в течение 72 ч.

Аппаратура, материалы и реактивы - согласно п. 3.

6.1.2. Подготовка к анализу.

Подготовку проб и приготовление разведений осуществляют, как указано в п.п. 4.1 и 4.2. Посуду, материалы и реактивы стерилизуют, как указано в п. 4.3.

6.1.3. Проведение анализа.

Для определения общего количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов выбирают те разведения, при посеве которых на чашках вырастает не менее 30 и не более 300 колоний. При посеве продуктов, не требующих разведения, учитывают все выросшие на чашках колонии (то есть и менее 30).

Посев на чашки.

Перед посевом чашки маркируют. На дне чашки карандашом по стеклу ставят номер исследуемого образца продукта, разведение и дату.

По 1 см³ цельного продукта или каждого соответствующего его разведения вносят в 2 чашки Петри (параллельное определение). Пипетку с посевным материалом держат под углом 45 °, касаясь концом пипетки дна чашки, не выдувая последнюю каплю из пипетки. Затем наливают в каждую чашку по 15 - 20 см³ питательной среды, расплавленной на водяной бане и остуженной до 45 °C (приготовление питательных сред для определения общего количества бактерий указано в п.п. 5.1.9, 5.1.10, 5.2.1.1, 5.2.1.2).

Края колб с питательной средой перед каждой заливкой фламбируют в пламени газовой горелки или спиртовки. Сразу после заливки агара содержимое чашки Петри тщательно перемешивают путем легкого вращательного покачивания для равномерного распределения посевного материала.

6.1.4. Инкубация.

После застывания среды чашки Петри переворачивают крышками вниз и помещают в таком виде в термостат при 30 °C на 72 ч (допускается предварительный учет через 48 ч с последующим окончательным учетом еще через 24 ч).

Чашки Петри с посевами распределяют в термостате таким образом, чтобы каждая их группа отделялась от соседних чашек, от верха и стенок термостата не менее чем на 3 см.

6.1.5. Учет и обработка результатов.

Количество выросших колоний подсчитывают на каждой чашке, поместив ее вверх дном на темном фоне, пользуясь лупой с увеличением от 4 до 10 раз. Каждую подсчитанную колонию отмечают на дне чашки чернилами. При подсчете колоний рекомендуется пользоваться специальным прибором.

При большом числе колоний и равномерном их распределении дно чашки Петри делят на четыре и более одинаковых сектора, подсчитывают число колоний на двух-трех секторах (но не менее чем на 1/3 поверхности чашки), находят среднее арифметическое число колоний и умножают на общее количество секторов всей чашки. Таким образом находят общее количество колоний, выросших на одной чашке.

Если инкубированные чашки с разведением 1:10 не содержат колоний, то результат выражают так: меньше чем 1 ∙ 10 ¹ или менее 10 бактерий на 1 см³ (г) продукта. Если на каждой из двух параллельных чашек с разведением 1:10 содержится меньше чем 30 колоний, то результат выражают так: количество микроорганизмов менее М или M ∙ 10, где М - число выросших колоний.

Если количество колоний более 30, подсчитывают колонии на обеих чашках с одним и тем же разведением и вычисляют среднюю величину, умножают ее на соответствующее разведение и получают число микроорганизмов в 1 см³ (г) продукта.

Полученный результат округляют в соответствии с ГОСТ 26670-85 «Продукты пищевые и вкусовые. Методы культивирования микроорганизмов»:

до числа, кратного 5, если среднее арифметическое число микроорганизмов менее 100;

до числа, кратного 20, если среднее арифметическое число микроорганизмов более 100 и оканчивается цифрой 5;

до числа, кратного 10, если среднее арифметическое число микроорганизмов более 100 и не оканчивается цифрой 5.

Среднее арифметическое от подсчитанного количества колоний, выросших на чашках, является общим количеством мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов в 1 г (см³) исследуемого продукта.

Ответ выражают в виде числа КОЕ/г с указанием соответствия или несоответствия продукта микробиологическому нормативу на этот показатель.

Пример: посеяно разведение 1:10; чашка 1 - 185 колоний, чашка 2 - 203 колонии; расчет:

185 + 203 = 388 : 2 = 194 - округляем до 200;

результат 20 ∙ 10 = 2000 = 2,0 ∙ 10³ КОЕ/г (см³).

6.2. Определение бактерий группы кишечных палочек (колиформных бактерий)

6.2.1. Сущность метода.

В соответствии с принятой международной номенклатурой в настоящих Санитарных правилах к бактериям группы кишечных палочек (БГКП) отнесены грамотрицательные, не образующие спор палочки, сбраживающие лактозу с образованием кислоты и газа при температуре 37 °C в течение 24 - 48 ч, в основном являющиеся представителями родов Escherichia, Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella, Serratia (то есть учитываются как цитратотрицательные, так и цитратположительные варианты БГКП).

Сухие продукты типа «Детолакт», «Новолакт ММ», предназначенные для детей с первого дня жизни и употребляемые после восстановления при 37 и 70 °C, перед посевом должны подвергаться предварительной инкубации в неселективной жидкой среде для восстановления физиологических свойств бактерий, поврежденных в процессе технологической обработки продукта. В качестве неселективной среды обогащения используют фосфатный буферный раствор (5.1.2).

Без предварительной инкубации исследуют сухие продукты, подвергающиеся различным способам термической обработки перед употреблением (разведение кипяченой водой 85 °C и выше, доведение до кипения, пастеризация восстановленной смеси и т.д.), биологически активные добавки, стерилизованные, кисломолочные (сухие и жидкие) и пастообразные продукты детского питания, а также составляющие их компоненты.

6.2.2. Подготовка к анализу.

Посуду, материалы и реактивы подготавливают, как указано в п. 4.3.

6.2.3. Приготовление разведений.

Подготовку проб и приготовление разведений осуществляют, как указано в п.п. 4.1 и 4.2.

6.2.4. Посев с предварительной инкубацией детских сухих молочных продуктов.

Асептически взвешивают 1 г сухого продукта, вносят в колбочку или пробирку с 9 см³ разбавленного фосфатного буфера для предварительного обогащения. Взвесь тщательно перемешивают, проверяют значение pH при помощи индикаторной бумаги (стерильной стеклянной палочкой наносят каплю испытуемой взвеси на полоску универсальной индикаторной бумаги и полученную окраску немедленно сравнивают со шкалой). При необходимости доводят значение pH до 7,0, используя стерильные растворы 1 н гидроокиси натрия или 1 н соляной кислоты.

Колбочки помещают в термостат при температуре 37 °C и выдерживают 24 ч. На следующий день засевают 1 см³ проинкубированной в буферном растворе взвеси продукта в пробирку с 10 см³ среды Кесслер с лактозой и проводят анализ в соответствии с п. 6.2.5.

6.2.5. Прямой посев.

Для посева используют то количество продукта, в котором предусматривается отсутствие БГКП (колиформных бактерий) соответствующими пунктами табл. 1 - 7. Посев производится в среду Кесслер с лактозой (с поплавками), с соблюдением соотношения продукта и среды 1:10. Применение среды Кода не допускается.

В производственных лабораториях возможно производить посев сухих продуктов из первого разведения в объеме 10 см³.

Прямые посевы продуктов или посевы после преинкубации помещают в термостат при температуре 37 °C на 24 ч. При отсутствии признаков роста - газообразования или помутнения среды - дают заключение об отсутствии БГКП (колиформных бактерий) в 1 г и о соответствии исследуемого продукта нормативу на БГКП (колиформные бактерии). При наличии признаков роста - газообразования, помутнения среды Кесслера с лактозой - для окончательного заключения о наличии в продукте БГКП (колиформных бактерий) из подозрительных колб или пробирок производят высев на чашки со средой Эндо или Левина (п. 5.2.2.3). Посев производят петлей из каждой пробирки так, чтобы получить рост изолированных колоний, - на отдельный сектор, лучше - на отдельную чашку. Чашки с посевами помещают в термостат при температуре 37 °C на 18 - 24 ч.

Учет результатов.

При отсутствии на среде Эндо или Левина колоний, типичных для бактерий группы кишечных палочек (колиформных бактерий) (на среде Эндо - красных с металлическим блеском или без него, розовых и бледно-розовых; на среде Левина - черных с металлическим блеском, темных с черным центром, сиреневых с темным центром), засеянная навеска продукта считается не загрязненной ими, т.е. исследуемый продукт соответствует нормативу на БГКП (колиформные бактерии).

При наличии на среде Эндо или Левина типичных для кишечных палочек (колиформных бактерий) колоний их продолжают изучать. Из изолированных колоний, характерных или подозрительных на БГКП, делают препараты, окрашивая их по Граму, и микроскопируют.

Обнаружение грамотрицательных, не содержащих спор палочек указывает на наличие БГКП (колиформных бактерий) в анализируемой массе продукта и несоответствие продукта микробиологическому нормативу.

Примечание. Обнаружение на среде Эндо колоний с желтым или желто-коричневым оттенком при анализе сухих молочных каш, содержащих в качестве компонента муку рисовую и гречневую, толокно овсяное, крупу манную, указывает на возможную принадлежность выделенных бактерий к роду Erwinia.

Бактерии рода Erwinia - грамотрицательные, не образующие спор палочки, способные утилизировать лактозу с образованием кислоты и газа, по комплексу других биохимических признаков отличающиеся от бактерий группы кишечных палочек. Бактерии рода Erwinia являются типичными представителями эпифитной микрофлоры зерновых культур и не обладают патогенностью для человека и животных. Для определения принадлежности к роду Erwinia выросших на среде Эндо нетипичных для БГКП колоний последние пересевают на питательный агар с 5 % сахарозы (п. 5.2.2.17), на котором они дают выраженный мукоидный рост, не свойственный бактериям группы кишечных палочек. При подтверждении принадлежности подозрительных колоний роду Erwinia и отсутствии других микроорганизмов, типичных для БГКП, исследуемый продукт считается соответствующим нормативу на БГКП (колиформные бактерии).

6.3. Определение E. coli

E. coli - не утилизирующие цитрат грамотрицательные бесспоровые палочки, входящие в группу колиформных бактерий и являющиеся индикатором относительно свежего фекального загрязнения, способные расти и ферментировать лактозу при температурах выше температуры тела человека и теплокровных животных (44,0 - 45,5 °C).

6.3.1. Сущность метода.

Метод основан на способности E. coli ферментировать лактозу с образованием кислоты и газа при температуре 44,0 °C в течение 24 - 48 часов. Идентификацию E. coli проводят по признакам: образование индола, положительная реакция с метиловым красным, отрицательная реакция Фогес-Проскауэра (образование ацетилметилкарбинола) и отсутствие способности утилизировать цитраты.

6.3.2. Аппаратура, материалы и реактивы.

При проведении анализов используют аппаратуру, материалы и реактивы, перечисленные в п. 3.

6.3.3. Подготовка к анализу.

Подготовку проб и приготовление разведений осуществляют, как указано в пп. 4.1 и 4.2.

Посуду и материалы стерилизуют, как указано в п. 4.3.

6.3.4. Проведение анализа с предварительной инкубацией.

6.3.4.1. Асептически взвешивают 10,0 г сухого продукта типа «Детолакт» (табл. 1), растворяют в колбе с 90,0 см³ разбавленного фосфатного буфера.

Для доведения pH до 7,0 используют простерилизованный 1 н раствор гидроокиси натрия или 1 н раствор соляной кислоты, проверяя значение pH индикаторной бумагой.

Колбу помещают в термостат и выдерживают при температуре 37 °C в течение 24 ч.

6.3.4.2. На следующий день засевают из этих колб 1,0 см³ в пробирку или колбу с 9 см³ среды Кесслер с лактозой (пп. 5.2.2.1, 5.2.2.2) (с поплавками), помещают в термостат и выдерживают при температуре 44 °C в течение 24 ч. При отсутствии газа в посевах продуктов, подвергшихся предварительной инкубации, результат анализа считают отрицательным и дают заключение об отсутствии E. coli и соответствии нормативу по этому показателю.

6.3.5. Проведение анализа без предварительной инкубации.

6.3.5.1. Навеску продукта 10 г (см³) помещают в колбу с 90 см³ среды Кесслер с лактозой (с поплавками). Помещают в термостат при 44 °C на 24 ч. На следующий день колбы просматривают, при отсутствии признаков роста посевы оставляют в термостате еще на 24 ч.

6.3.5.2. Пробирки и колбы с посевами просматривают на присутствие газа. При отсутствии газа в посевах дают заключение об отсутствии в продукте E. coli и соответствии нормативу по этому показателю.

Пробирки (колбы), в которых обнаружен газ или другие признаки роста (помутнение среды), подвергают дальнейшим исследованиям. Из этих пробирок производят посев штрихом или рассевом на поверхность чашки Петри с подсушенной средой Эндо или Левина так, чтобы получить изолированные колонии. Посевы выдерживают в термостате при температуре 37 °C в течение 24 ч.

Эшерихии на среде Эндо образуют колонии красные с металлическим блеском или без него, розовые, на агаре Левина - черные, темно-коричневые колонии с темным центром, с металлическим блеском или без него. Если при окрашивании по Граму и просмотре под микроскопом подтверждается наличие грамотрицательных бесспоровых палочек, то все типичные колонии подвергают идентификации по ИМАЦ-тестам (реакция на индол, реакция с метиловым красным, реакция Фогеса-Проскауэра, утилизация цитрата).

6.3.5.3. Реакция на индол.

Из типичной изолированной колонии на среде Эндо (Левина) производят высев в пробирку с бульоном на индол (п. 5.2.2.4). Пробирки выдерживают в термостате при температуре 37 °C в течение 24 ч.

После выдерживания в термостате в пробирки с индольной средой добавляют 5 - 10 капель реактива Эрлиха (п. 5.2.2.14). Появление темно-красного окрашивания в поверхностном слое свидетельствует об образовании индола.

6.3.5.4. Реакция Фогеса-Проскауэра.

Типичную, хорошо изолированную колонию пересевают в пробирку со средой Кларка (п. 5.2.2.5). Выдерживают в термостате при температуре 37 °C в течение 48 ч. Вынимают пробирки из термостата и из каждой из них пипеткой стерильно отбирают 1,0 см³ культуральной жидкости в чистые пробирки. Затем к 1 см³ добавляют 0,60 см³ 5 %-ного раствора α-нафтола (п. 5.2.2.11) и 0,20 см³ 40 %-ного раствора гидроокиси калия (п. 5.2.2.12), хорошо перемешивают. Появление красного окрашивания в первые 5 мин свидетельствует о положительной реакции (образование ацетилметилкарбинола).

6.3.5.5. Реакция с метиловым красным.

В пробирки с оставшейся культурой в среде Кларка добавляют по 5 капель реактива метилового красного (п. 5.2.2.7) в каждую пробирку. Четкое красное окрашивание указывает на положительную реакцию^*(5).

____________

^*(5) Согласно контрактным материалам фирмы «Abbott. Laborat.» при контроле за готовым продуктом «Детолакт» рекомендуется инкубация в течение 96 ч на среде Кларка для проведения теста с метилрот. Однако по данным большинства исследователей для этого теста достаточно инкубации в течение 48 ч.

6.3.5.6. Утилизация цитратов.

Производят пересев из типичных колоний со среды Эндо или Левина на чашки Петри с подсушенной средой Симмонса или в пробирки со средой Козера (п.п. 5.2.2.15, 5.2.2.16). Посевы выдерживают в термостате при температуре 37 °C в течение 24 - 48 ч. При учете результатов обращают внимание на наличие роста и изменение окраски среды.

Наличие роста и изменение цвета среды с зеленого в синий или желтый характерно для цитрат-положительных культур.

Для цитрат-отрицательных разновидностей характерно отсутствие роста и изменения цвета среды.

6.3.6. Оценка результатов идентификации.

Таблица 9

Классификация колиформных бактерий по ИМАЦ-тестам

При выделении из продукта грамотрицательных неспорообразующих палочек, продуцирующих газ из лактозы при 44,0 °C, образующих и не образующих индол, дающих положительную реакцию с метиловым красным, отрицательную реакцию Фогес-Проскауэра и не растущие на среде Симмонса (Козера), считают, что в 10 г продукта содержатся эшерихии коли; продукт в данном случае бракуется.

При обнаружении в 10 г продукта бактерий родов Enterobacter и Citrobacter, но при отсутствии колиформных бактерий (БГКП) в 1 г продукт браковке не подлежит. Однако микробиолог предприятия должен усилить контроль за соблюдением санитарно-гигиенических правил на предприятии и обратить внимание на необходимость дополнительного контроля технологического режима при изготовлении продукта.

6.4. Определение сальмонелл

Сальмонеллы - обширный род семейства энтеробактерий, включающий более 2000 серотипов, большинство которых обладает патогенными свойствами. К сальмонеллам относятся аэробные и факультативно-анаэробные грамотрицательные подвижные палочки, хорошо растущие на обычных питательных средах и разнообразных пищевых субстратах.

6.4.1. Сущность метода.

Метод основан на использовании сред обогащения для увеличения роста сальмонелл, их выделения на специальных агаровых средах с последующим проведением серологической реакции.

6.4.2. Аппаратура, материалы, реактивы - согласно п. 3.

6.4.3. Подготовка к анализу.

6.4.3.1. Подготовку проб и приготовление разведений осуществляют, как указано в пп. 4.1 и 4.2. Посуду и материалы стерилизуют, как указано в п. 4.3.

6.4.4. Проведение анализа.

Для посева используют то количество продукта, в котором регламентируется отсутствие бактерий рода сальмонелла соответствующими пунктами табл. 1 - 7.

Посев сухих молочных и кисломолочных продуктов, энпитов, молочных каш, БАДов производится с предварительной инкубацией в фосфатном буферном растворе.

Стерилизованные жидкие молочные продукты, жидкие кисломолочные и пастообразные продукты детского питания, а также компоненты засевают без предварительной инкубации непосредственно в колбы со средой для селективного обогащения. В случае выявления бактерий рода сальмонелла в готовых сухих молочных продуктах компоненты, входящие в их состав, повторно исследуются на наличие сальмонелл с предварительной инкубацией продукта по п. 6.4.4.1.

6.4.4.1. Посев с предварительной инкубацией.

Взвешивают в стерильных условиях в стакане сухой продукт или БАД в количествах, предусмотренных в табл. 1, 2, 4, 5 и 6, и затем для предварительного обогащения навеску асептически переносят в колбу с разбавленным фосфатным буфером (п. 5.1.2). Соблюдают соотношение массы продукта и буферного раствора 1:10. Проверяют pH с помощью индикаторной бумаги и доводят pH смеси до 6,8 - 7,2 1 н раствором гидроокиси натрия.

Все тщательно перемешивают. При плохом растворении продукта пробы подвергают механическому встряхиванию на аппарате для встряхивания жидкости (шуттель-аппарат). К приготовленной взвеси продукта добавляют 0,1 %-ный водный раствор бриллиантового зеленого (п. 5.2.2.9) в количестве 2 % к объему (то есть 20 см³ раствора красителя к 1000 см³ взвеси продукта), перемешивают и выдерживают в термостате при 37 °C в течение 18 - 24 ч.

На следующий день переносят 1,0 см³ выдержанной в термостате смеси в пробирки с 10 см³ магниевой среды (п. 5.2.3.1) или среды Мюллера (п. 5.2.3.3). Пробирки помещают в термостат с температурой 37 °C на 18 - 24 ч.

6.4.4.2. Прямой посев в среды для селективного обогащения.

Асептически взвешенные навески сухих компонентов, стерильно отмеренные объемы жидких стерилизованных молочных продуктов или компонентов в количествах, предусмотренных соответствующими графами табл. 3 и 7, засевают в колбы с магниевой средой или средой Мюллера, соблюдая соотношение продукта и среды не менее 1:5.

Жидкие кисломолочные и пастообразные продукты детского питания, подготовленные согласно п. 4.1.5, в количествах, указанных в таблице 3, засевают в колбы с магниевой средой или средой Мюллера также при соблюдении соотношения продукта и среды не менее 1:5.

Для жидких продуктов допускается использование среды с двойной концентрацией ингредиентов при соотношении продукта и среды 1:1.

Колбы с посевами помещают в термостат с температурой 37 °C на 18 - 24 ч.

6.4.4.3. После инкубации в термостате производят высев из колб и пробирок с магниевой средой или средой Мюллера на поверхность подсушенных чашек с дифференциально-диагностическими средами Плоскирева и висмут-сульфитного агара. Для получения отдельных колоний петлей берут минимальное количество посевного материала и производят посев штрихом. Чашки с посевами помещают в термостат с температурой 37 °C на 24 - 48 ч. Проверку посевов осуществляют дважды: через 24 ч и 48 ч после инкубации в термостате.

6.4.5. Обработка результатов.

6.4.5.1. На среде Плоскирева колонии сальмонелл бесцветные, плотные, на висмут-сульфитном агаре - черные, с характерным металлическим блеском, при этом наблюдается прокрашивание в черный цвет участка среды под колонией.

При отсутствии типичных колоний сальмонелл на каждой из сред конечный результат анализа записывают как отрицательный, то есть в исследуемой массе продукта сальмонеллы отсутствуют.

При наличии на любой из питательных сред на чашках Петри типичных колоний или подозрительных на сальмонеллы, производят их дальнейшее изучение.

6.4.5.2. Из каждой среды на чашке Петри, содержащей подозреваемую колонию сальмонелл, выбирают хорошо изолированную колонию и высевают штрихом и уколом на трехсахарный агар с мочевиной (п. 5.2.3.7) или среду Клиглера (п. 5.2.3.10). Пробирки с посевами выдерживают в термостате при 37 °C в течение 24 ч. Производят идентификацию культур, высеянных на среду Клиглера или трехсахарный агар с мочевиной, по ферментации лактозы, глюкозы, сахарозы и расщеплению мочевины.

Покраснение или пожелтение скошенной части столбика среды указывает на образование кислоты в результате ферментации лактозы, сахарозы или обоих сахаров. Покраснение самого столбика указывает на расщепление глюкозы. Восстановление цвета среды до исходного (бледно-розовый) свидетельствует о расщеплении мочевины.

Механизм действия среды Клиглера идентичен с трехсахарным агаром. Об образовании сероводорода судят по почернению среды в столбике.

Если культуры сбраживают лактозу с образованием газа и расщепляют мочевину, они не принадлежат к бактериям рода сальмонелла.

Культуры, не ферментирующие лактозу и не расщепляющие мочевину, но ферментирующие глюкозу (с образованием или без образования газа), подвергаются дальнейшему изучению.

Культуры, ферментирующие глюкозу без образования газа, подозрительны как брюшнотифозные или дизентерийные.

Культуры, ферментирующие глюкозу с образованием газа, дающие в среде пузырьки и продуцирующие сероводород, могут принадлежать к роду сальмонелла.

Если ни в одной из пробирок не обнаружено ни одной характерной для сальмонелл реакции, то результат считают отрицательным и дают заключение об отсутствии в исследуемой массе продукта бактерий рода сальмонелла.

6.4.5.3. Если обе пробирки покажут типичную для сальмонелл окраску сред, проводят серологическое исследование. Для этой цели берут петлей небольшое количество культуры из пробирок с трехсахарным агаром или средой Клиглера, эмульгируют в капле физиологического раствора на предметном стекле. Добавляют каплю сальмонеллезной О-сыворотки (п. 5.2.3.11) к раствору и осторожно покачивают предметное стекло, чтобы смешать жидкости.

Положительная реакция на сальмонеллы (агглютинация) наблюдается в течение 30 - 60 с. Обязательна постановка отрицательной реакции (культура + физиологический раствор). Если при проведении серологического исследования агглютинации не обнаруживается, конечный результат записывают как «отрицательный».

Любая агглютинация, которая появляется на стекле, говорит о вероятности присутствия сальмонелл.

6.4.5.4. При выделении культур грамотрицательных палочек, ферментирующих глюкозу с образованием или без образования газа, не ферментирующих лактозу и сахарозу, образующих или не образующих сероводород и обладающих четкой серологической характеристикой, считают, что в исследуемой навеске продукта присутствуют бактерии рода сальмонелла. Продукт к реализации не допускается. Проводится тщательная санитарная обработка всей технологической линии.

6.5. Определение коагулазоположительных стафилококков (S. aureus)

S. aureus - аэробные грамположительные сферические пигментообразующие микроорганизмы, обладающие ферментом коагулазой, большая часть из которых способна к продукции энтеротоксинов.

6.5.1. Сущность метода.

Метод основан на способности микроорганизмов из рода Staphylococcus расти на питательных средах с повышенным содержанием поваренной соли. Наибольшее санитарно-гигиеническое значение имеет Staphylococcus aureus (золотистый стафилококк), принадлежность к которому, в основном, определяется по способности коагулировать цитратную плазму крови человека или кролика.

6.5.2. Аппаратура, материалы и реактивы согласно п. 3.

6.5.3. Подготовка к анализу.

6.5.3.1. Подготовку проб и приготовление разведений осуществляют, как указано в п.п. 4.1, 4.2.

Посуду и материалы стерилизуют, как указано в п. 4.3.

6.5.4. Проведение анализа.

При исследовании продуктов, употребляемых без предварительной термической обработки после восстановления (см. табл. 1), навеска продукта должна составлять 10,0 г; для продуктов, употребляемых с предварительной термической обработкой, и компонентов - 1,0 г (см. табл. 1 - 7). Сухие молочные продукты типа «Деталакт», «Новолакт ММ», «Новолакт-1» и т.п., восстанавливаемые перед употреблением при 37 и 70 °C, подвергаются предварительной инкубации в фосфатном буферном растворе перед посевом.

Остальные продукты и компоненты, предусмотренные в табл. 1 - 7, засевают без предварительной инкубации непосредственно в питательную среду.

В случае выявления S. aureus в готовых сухих молочных продуктах компоненты, входящие в их состав, исследуются на наличие S. aureus с предварительной инкубацией.

6.5.4.1. Взвешивают в стерильных условиях 10,0 г или 1,0 г продукта и помещают в колбы с 90 см³ или с 9 см³ разбавленного фосфатного буфера. Хорошо размешивают. Смесь выдерживают в термостате при температуре 37 °C в течение 18 - 24 ч. На следующий день пипеткой переносят 1,0 см³ смеси в пробирку с солевым бульоном (п. 5.2.4.1) и помещают в термостат при температуре 37 °C на 24 ч.

Жидкие и пастообразные продукты, подготовленные согласно п. 4.1.5, и другие продукты, не подвергающиеся предварительной инкубации, в количестве 1,0 или 10,0 г (см³) засевают в пробирки или колбы с солевым бульоном и помещают в термостат при температуре 37 °C.

6.5.4.2. Через 24 ч производят пересев петлей из бульона для получения изолированных колоний на чашки Петри с подсушенными средами типа Байрд-Паркер (п. 5.2.4.2) или ЖСА (желточно-солевой агар) (п. 5.2.4.3). Чашки с посевами выдерживают в термостате при температуре 37 °C в течение 18 - 24 ч.

S. aureus на среде Байрд-Паркер растут в виде черных, блестящих, выпуклых колоний в диаметре 1 - 1,5 мм, окруженных зоной просветления среды шириной 1 - 3 мм. Около 90 % S. aureus, выделенных из пищевых продуктов, и штаммы, образующие энтеротоксин, на агаре типа Байрд-Паркер дают зоны просветления через 24 ч инкубации при 37 °C. Эти колонии не требуют подтверждения в принадлежности к S. aureus и подлежат учету через 24 ч инкубации.

На ЖСА колонии стафилококков имеют форму выпуклых дисков диаметром 2 - 4 мм белого, желтого, кремового, лимонного, золотистого цвета с ровными краями; вокруг колоний образуется радужное кольцо и зона помутнения среды.

Из характерных колоний, подозрительных на стафилококки, готовят мазки-препараты, окрашивают по Граму и микроскопируют. Колонии грамположительных мелких кокков, расположенных в мазке гроздьевидно, отсеивают на сектора чашки Петри или в пробирки со скошенным мясо-пептонным агаром (п. 5.1.10), посевы выдерживают в термостате при 37 °C в течение 18 - 24 ч. Из культур, выросших на МПА, после предварительной проверки мазка на чистоту под микроскопом ставят реакцию плазмокоагуляции.

6.5.4.3. Постановка реакции плазмокоагуляции.

В пробирку с 0,50 см³ разведенной кроличьей плазмы вносят петлю суточной агаровой культуры. Одну пробирку с плазмой оставляют незасеянной, а в другую засевают заведомо коагулазоположительный стафилококк в качестве контроля. Пробирки помещают в термостат при температуре 37 °C. Учитывают результаты через 2 - 4 ч. и оставляют до утра при комнатной температуре для окончательного учета. Ускорение реакции производят за счет использования 3- и 4-часовых бульонных культур стафилококков, добавляя их по 0,10 см³ в 0,50 см³ разведенной цитратной плазмы.

Пробирки на свертывание плазмы следует просматривать осторожно, чтобы не разрушить начало образования сгустка.

При учете реакции плазмокоагуляции могут наблюдаться три степени активности фермента коагулазы:

++++ - сгусток плотный;

+++ - сгусток, имеющий небольшой отсек;

++ - сгусток в виде взвешенного мешочка.

Все три варианта являются положительным результатом.

6.5.5. Обработка результатов.

6.5.5.1. Положительная реакция плазмокоагуляции свидетельствует о присутствии коагулазоположительных стафилококков в засеянной массе продукта (в 10,0 или в 1,0 г см³).

6.5.5.2. Отрицательная реакция плазмокоагуляции свидетельствует об отсутствии коагулазоположительных стафилококков в засеянной массе продукта (в 10,0 или в 1,0 г см³).

6.5.5.3. Примечание.

При обнаружении значительного роста коагулазоположительных стафилококков в готовых детских сухих молочных смесях микробиолог должен обратить внимание на санитарно-гигиеническое содержание предприятия, так как у детей грудного возраста некоторые варианты коагулазоположительных стафилококков (S. epidermidis) также способны вызывать острые стафилококковые энтериты.

6.6. Определение энтерококков

Определение энтерококков проводят в случае обнаружения в выработанной партии значительного превышения количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов в целях выяснения причин несоответствия изготовленного продукта этому нормативу.

6.6.1. Сущность метода.

Метод основан на количественном подсчете колоний энтерококков, вырастающих на плотных питательных средах, в состав которых входят ингибиторы (кристаллический фиолетовый, трифенилтетразолий хлористый, антибиотики: пенициллин, стрептомицин, полимиксин), подавляющие развитие других бактерий.

6.6.2. Аппаратура, материалы, лабораторная посуда и реактивы согласно п. 3.

6.6.3. Подготовка к анализу.

Подготовку проб и приготовление разведений проводят, как указано в п.п. 4.1 и 4.2.

Посуду и материалы стерилизуют, как указано в п. 4.3.

6.6.4. Проведение анализа.

6.6.4.1. Посев.

Берут по 0,1 см³ жидких продуктов или из первого разведения сухих и пастообразных продуктов и высевают на подсушенную поверхность молочной среды с полимиксином (п. 5.2.5.1) в двух чашках Петри. Посевной материал тщательно втирают шпателем в поверхность среды. Посевы инкубируют при 37 °C в течение 48 ч.

6.6.4.3. Обработка результатов.

Посевы просматривают. Типичные колонии энтерококков имеют округлую форму, ровные края, блестящую поверхность, диаметр 1,5 - 2 мм и красную окраску с зоной протеолиза на светло-голубом фоне среды. Подсчитывают все типичные колонии на обеих чашках и среднеарифметическое их число умножают на 10 или 100 соответственно, получая количество энтерококков в 1 г или 1 см³ продукта.

Идентификация культур.

Три - пять колоний отсеивают на скошенный мясо-пептонный агар для дальнейшей идентификации. На скошенном агаре посевы культивируют при 37 °C в течение 24 ч.

Из колоний, выросших на скошенном агаре, готовят мазки и окрашивают по Граму. Определяют каталазную активность культуры: на чистое обезжиренное стекло наносят каплю 1 %-ного водного раствора перекиси водорода (п. 5.2.9.2) и в ней растирают петлю культуры. Если пузырьки газа не выделяются, значит реакция отрицательная. Кроме того, изучаемые культуры засевают в бульоны, содержащие 40 % желчи (п. 5.2.9.3) и имеющие pH 9,6 (п. 5.2.9.4). Инкубируют посевы при 37 °C в течение 18 - 24 ч. Рост изучаемых культур в указанных бульонных средах подтверждают микроскопией мазка, окрашенного по Граму.

Энтерококки - грамположительные кокки - в мазках из жидких сред располагаются в виде коротких или длинных цепочек, из плотных - в виде диплококков или скоплений кокков; растут в бульонах с 40 % желчи и при pH 9,6 - 10,2, не разлагают перекись водорода, так как не вырабатывают фермент каталазу.

Обнаружение значительного роста энтерококков при посеве исследуемого материала свидетельствует о необходимости контроля за термическим режимом технологического процесса или проведения санитарной обработки оборудования и технологических линий.

6.7. Определение B. cereus^*(6)

____________

^*(6) При введении ГОСТ «Продукты пищевые. Метод определения B. cereus» допускается использование рекомендуемых в нем селективных сред и тестов идентификации.

B. cereus - аэробные спорообразующие грамположительные палочки, часть штаммов способна продуцировать энтеротоксин.

6.7.1. Сущность метода.

Метод основан на количественном подсчете колоний B. cereus, относящихся к спорообразующим аэробным бациллам, при росте их на плотных питательных средах с антибиотиком и яичным желтком.

6.7.2. Аппаратура, материалы и реактивы - согласно п. 3.

6.7.3. Проведение анализа.

6.7.3.1. Подготовку проб и приготовление разведений проводят, как указано в пп. 4.1 и 4.2.

Посуду, материалы и реактивы стерилизуют, как указано в п. 4.3.

6.7.3.2. Посев.

Производят посев по 0,1 см³ разведения сухих молочных продуктов 1:10 (0,01 г продукта), по 0,2 см³ БАДов из разведения 1:10 (0,02 г продукта) на поверхность хорошо подсушенной питательной среды в 2-х чашках Петри. Посевной материал тщательно растирают шпателем. Для посева используют питательные среды по п. 5.2.5.1 (среда Донована) или п. 5.2.5.3 (солевой полимиксиновый агар).

Посевы инкубируют в термостате при температуре 30 °C от 24 до 96 ч.

6.7.3.3. Обработка результатов.

При отсутствии роста на обеих чашках дают заключение о соответствии детской сухой молочной смеси нормативу на этот показатель.

При обнаружении роста изучают морфологию колоний: штаммы B. cereus на солевом полимиксиновом агаре с 2, 3, 5-трифенилтетраводным хлористым образуют ярко-рубиновые колонии на фоне широкой зоны глубокого равномерного коагулята, колонии в первые часы округлые, выпуклые; в дальнейшем (через 24 - 48 ч) - распластанные по поверхности агара, с изрезанными краями. На среде Донована штаммы B. cereus образуют крупные белые распластанные колонии со слегка изрезанными краями, окруженные широкой зоной глубокого белого равномерного матового коагулята или двойной зоной - коагулята и просветления (лецитиназная активность).

Из типичных колоний готовят мазки и окрашивают по Граму.

B. cereus - грамположительные споровые палочки, в некоторых культурах - грамотрицательные.

6.7.3.4. Идентификация культур.

Пересеивают 3 - 5 колоний на скошенный агар с последующей инкубацией при температуре 30 °C 18 - 24 ч.

Проводят микроскопию висячей и раздавленной капли для установления подвижности и посев на среду с маннитом (п. 5.2.5.5) и на кровяной агар (п. 5.2.5.4). Инкубацию посевов проводят при 30 °C 24 - 48 ч. Культуру также пересевают в пробирки со средой Кларка (п. 5.2.2.5), которую инкубируют при температуре 30 °C в течение 48 ч для последующей постановки реакции Фогес-Проскауэра.

Постановка реакции Фогес-Проскэуэра описана в п. 6.3.5.4.

Характерными признаками для B. cereus являются образование зон просветления на кровяном агаре (гемолитическая активность), положительные реакции на лецитиназу и Фогес-Проскауэра, подвижность и отсутствие способности сбраживать маннит.

6.7.3.5. При обнаружении роста для определения количества B. cereus в исследуемом продукте количество выросших типичных колоний на чашках умножают на соответствующее разведение и выражают в пересчете на 1 г или 1 см³ исследуемого продукта.

6.7.3.6. В продуктах, выработанных с соблюдением технологических правил, при посеве 0,01 г рост B. cereus должен отсутствовать, что соответствует показателю на этот микроорганизм - менее 100 клеток/г.

При обнаружении роста микробиолог в заключении указывает подсчитанное количество B. cereus в 1 г продукта.

Если несоответствие нормативу по B. cereus в сухих молочных продуктах типа «Детолакт», не подвергающихся термической обработке перед употреблением, выражается в обнаружении в отдельных случаях от 100 до 200 КОЕ/г, но при соответствии продукта другим микробиологическим показателям, то партия однократно не задерживается для реализации. В таких случаях микробиолог проводит исследования на наличие B. cereus в компонентах растительного и животного происхождения и в случаях обнаружения в них значительных количеств B. cereus дает рекомендации о возможности и путях использования их в производстве.

Аналогично поступают при обнаружении от 200 до 400 КОЕ/г B. cereus в сухих молочных продуктах типа «Малыш», подвергающихся термической обработке перед употреблением.

6.8. Определение количества дрожжей и плесневых грибов

6.8.1. Сущность метода.

Метод основан на количественном подсчете числа колоний дрожжей и плесеней, вырастающих на плотных питательных средах с антибиотиками при температуре 24 °C при посеве исследуемых продуктов.

6.8.2. Аппаратура, материалы и реактивы - согласно п. 3.

6.8.3. Проведение анализа.

6.8.3.1. Подготовку проб и приготовление разведений для посева проводят согласно пп. 4.1 и 4.2.

Посуду, материалы и реактивы стерилизуют, как указано в п. 4.3.

6.8.3.2. Посев.

Для определения количества дрожжей и плесневых грибов из каждой пробы делают посев по 1 см³ нативного продукта или по 1 см³ разведений 1:10 и 1:100 на две чашки Петри. В каждую чашку Петри с заранее промаркированной крышкой добавляют не позднее чем через 15 - 20 мин 14 см³ одной из агаризованных сред (пп. 5.2.6.2; 5.2.6.3; 5.2.6.4; 5.2.6.5; 5.2.6.6), охлажденной до 45 °C^*(7). Среду немедленно тщательно перемешивают и оставляют для застывания.

____________

^*(7) К средам добавляются антибиотики согласно п. 5.2.6.6.

Чашки с посевами выдерживают в термостате при температуре 24 °C в течение 120 ч - 5 сут. - с предварительным учетом через 3 сут.

Контроль стерильности питательных сред и воздуха проводят, как указано в п. 5.2.10.2.

6.8.3.3. Обработка результатов.

Количество колоний дрожжей и плесневых грибов подсчитывают раздельно на каждой чашке. Колонии дрожжей на указанных средах имеют беловато-желтый цвет, сметанообразную консистенцию, по мере роста и увеличения размеров приобретают перламутровый оттенок и куполообразное возвышение.

Типичные колонии плесневых грибов с поверхности покрыты пушистым мицелием, часто напоминающим вату. Окраска варьирует.

Содержание дрожжей и плесневых грибов в 1 см³ или в 1 г продукта - (x) в КОЕ вычисляют по формуле:

x = n ∙ 10^m,

где n - количество колоний, подсчитанных на чашке Петри;

m - число десятикратных разведений.

За окончательный результат анализа принимают среднее арифметическое, полученное по всем чашкам.

6.8.3.4. При обнаружении в 1 г исследуемого продукта количеств дрожжевых и плесневых грибов, превышающих установленные нормативы по этим показателям, партия готового продукта к реализации задерживается для повторного расширенного микробиологического контроля. Микробиолог отбирает удвоенное количество образцов готовых детских сухих молочных смесей с проведением посева на все микробиологические показатели, указанные в табл. 1 Санитарных правил. Одновременно микробиолог должен произвести внеочередной контроль (на содержание дрожжевых и плесневых грибов) оборудования по ходу технологического процесса (контрольные точки и узлы трубопроводов) и воздуха в фасовочном отделении.

Компоненты растительного происхождения с содержанием дрожжевых и плесневых грибов, превышающим норматив не более чем в 5 раз, допускаются на изготовление сухих молочных смесей только после проведения технологических мероприятий, позволяющих снизить обсемененность.

6.9. Определение содержания ацидофильных бактерий

6.9.1. Сущность метода.

Определение содержания ацидофильных бактерий в продукте проводят методом предельных разведений.

Метод основан на способности молочнокислых палочек расти в молоке при температуре 37 - 38 °C и образовывать сгусток.

6.9.2. Аппаратура, материалы и реактивы - согласно п. 3.

6.9.3. Подготовка к анализу.

6.9.3.1. Подготовку проб и приготовление разведений проводят, как указано в пп. 4.1 и 4.2.

Подготовку посуды и материалов производят, как указано в п. 4.3.

6.9.4. Проведение исследований.

6.9.4.1. Из первого разведения исследуемого продукта, приготовленного по п. 4.2, готовят последующие - 1:100, 1:1000 и т.д., примерно до 10-го разведения, с таким расчетом, чтобы последние из них не содержали ацидофильных палочек.

Из приготовленных разведений исследуемого продукта делают посевы по 1 см³ в стерильное обезжиренное молоко, приготовленное по п. 5.2.8.1 (по две пробирки для каждого разведения).

6.9.5. Инкубация.

Посевы выдерживают в термостате при температуре 38 °C 3 - 5 дней. В течение этого времени во всех пробирках, в которых содержатся ацидофильные бактерии, молоко должно свернуться. Из трех последних разведений со свернувшимся обезжиренным молоком готовят микроскопические препараты.

Если при микроскопировании видны палочки, то делается вывод, что образование сгустка произошло за счет ацидофильных палочек, после чего учитывается результат.

6.9.6. Обработка результатов.

Для подсчета количества ацидофильных бактерий пользуются таблицей.

Таблица 10

Сначала составляют числовую характеристику. Она состоит из трех цифр, указывающих число пробирок со свернувшимся молоком в трех последних разведениях. Первая цифра числовой характеристики соответствует тому разведению, при котором во всех пробирках молоко свернулось. Следующие две цифры обозначают число пробирок со свернувшимся молоком из двух последующих разведений.

По числовой характеристике находят в таблице наиболее вероятное число микробов, которое умножают на то разведение, с которого начиналась первая цифра числовой характеристики.

За окончательный результат анализа принимают число, которое соответствует количеству клеток ацидофильных бактерий в 1 см³ или 1 г продукта.

Пример. При свертывании молока в двух параллельных пробирках разведения 1:10000, в одной пробирке разведения 1:100 000 и отсутствии свертывания в пробирках с последующими разведениями числовая характеристика будет 210. Она соответствует числу 6 по таблице. Это число необходимо умножить на то разведение, с которого начиналась первая цифра числовой характеристики, т.е. 1 ∙ 10⁴.

Таким образом, количество ацидофильных палочек в 1 см³ или 1 г исследуемого продукта составит 6 ∙ 10⁴.

6.10. Определение количества клеток бифидобактерий

6.10.1. Сущность метода.

Метод основан на способности бифидобактерий расти в питательных средах при температуре 38 °C и образовывать в них через 24 - 72 ч гвоздикообразные колонии.

6.10.2. Аппаратура, материалы и реактивы - согласно п. 3.

6.10.3. Подготовка к анализу.

6.10.3.1. Подготовку проб и приготовление разведений проводят, как указано в п.п. 4.1 и 4.2.

Подготовку посуды и материалов производят, как указано в п. 4.3.

6.10.4. Проведение исследований.

6.10.4.1. Из первого разведения исследуемого продукта, приготовленного по п. 4.2, готовят последующие - 1:100, 1:1000 и т.д., примерно до 10-го разведения, с таким расчетом, чтобы последние из них не содержали бифидобактерий.

6.10.4.2. Перед употреблением кукурузно-лактозную среду (п. 5.2.7.3) для учета бифидобактерий следует разогреть на кипящей водяной бане до полного растворения агара. После чего пробирки необходимо охладить до температуры 40 °C. Гидролизатно-молочную среду (п. 5.2.7.2) перед употреблением нагревают до температуры 40 °C.

6.10.4.3. Из приготовленных разведений исследуемого продукта делают посевы по 1 см³ в два параллельных ряда пробирок с питательной средой (гидролизатно-молочная или кукурузно-лактозная среда, приготовленная по п.п. 5.2.7.2 и 5.2.7.3 соответственно) и тщательно перемешивают пипеткой. Для каждого посева берут новую пипетку.

6.10.5. Инкубация.

Посевы выдерживают в термостате с температурой 38 °C в течение 72 ч. Допускается предварительный учет через 48 ч с последующим окончательным учетом через 72 ч.

6.10.6. Обработка результатов.

6.10.6.1. Из изолированных колоний, выросших в последнем разведении и характерных для бифидобактерий, делают препараты, окрашивают по Граму и микроскопируют.

Приготовление, окрашивание и микроскопирование препарата проводят по п. 6.11.

Клетки бифидобактерий представляют собой грамположительные слегка изогнутые палочки с раздвоением или утолщением на одном-двух концах, располагаются в мазке группами или поодиночке, в виде китайских иероглифов, могут образовывать короткие цепочки.

6.10.6.2. Подсчет количества клеток бифидобактерий в 1 см³ (1 г) продукта производят путем умножения числа выросших колоний на соответствующее разведение. За окончательный результат анализа принимают среднее арифметическое результатов, полученных в 2-х параллельных посевах.

6.11. Метод микроскопирования

6.11.1. Сущность метода.

Метод основан на просмотре окрашенных препаратов под микроскопом для ориентировочной характеристики микрофлоры молочных продуктов.

6.11.2. Проведение анализа.

Для приготовления препарата на чистое предметное стекло наносят петлей небольшую каплю исследуемого материала и распределяют на площади около 1 см². При исследовании творога детского и пастообразных продуктов, а также агаровой культуры на стекло наносят каплю стерильной воды, вносят в нее петлей продукт, тщательно перемешивают и растирают на площади 1 см². Препарат высушивают при комнатной температуре, фиксируют на пламени горелки и красят метиленовым голубым (5.1.7) или раствором карболового кристаллического фиолетового (п. 5.1.8).

6.11.3. Ориентировочный состав микрофлоры исследуемых продуктов представлен в табл. 11.

Таблица 11

 

Содержание