4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Измерение концентраций штаммов
микроорганизмов в воздухе
рабочей зоны

Сборник методических указаний
МУК 4.2.3248-14
МУК 4.2.3250-14
МУК 4.2.3252-14
МУК 4.2.3254-14
МУК 4.2.3256-14

Выпуск 2

Москва 2015

1. Разработаны и подготовлены ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова» Минздрава России (д.б.н. Н.И. Шеина).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 6 ноября 2014 г. № 2).

3. Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 30 декабря 2014 г.

4. Введены впервые.

СОДЕРЖАНИЕ

Введение

Сборник методических указаний «Измерение концентраций штаммов микроорганизмов в воздухе рабочей зоны» (выпуск 2) разработан с целью обеспечения контроля соответствия фактических концентраций микроорганизмов их предельно допустимым концентрациям (ЦЦК), что является обязательным при осуществлении санитарно-эпидемиологического контроля.

Включенные в данный список методические указания по контролю биотехнологических штаммов в воздухе рабочей зоны разработаны в соответствии с требованиями ГОСТ 12.1.005-88 «ССТБ. Воздух рабочей зоны. Общие санитарно-гигиенические требования» и ГОСТ 8.563-96 ГСИ. «Методики выполнения измерений».

Методики выполнены с использованием современных и адекватных микробиологических методов исследования и позволяют контролировать концентрации биотехнологических штаммов на уровне и ниже их ЦЦК в воздухе рабочей зоны, установленных в гигиенических нормативах.

Методические указания по измерению концентраций штаммов микроорганизмов в воздухе рабочей зоны предназначены для лабораторий центров гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, санитарно-микробиологических лабораторий промышленных предприятий, а также для научно-исследовательских институтов и других заинтересованных министерств и ведомств, аккредитованных в установленном порядке на право проведения микробиологических исследований, для осуществления контроля за содержанием штаммов в воздухе рабочей зоны.

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Микробиологическое измерение концентрации
Lysinibacillus xylanilyticus 5rb ВКПМ В-11685
в воздухе рабочей зоны

1. Назначение и область применения

1.1. Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода микробиологического количественного анализа концентрации L. xylanilyticus 5rb ВКПМ В-11685 в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 50 до 50000 клеток в 1 м³ воздуха.

1.2. Методические указания носят рекомендательный характер.

2. Биологическая характеристика штамма L. xylanilyticus 5rb
ВКПМ В-11685 и его гигиенический норматив в воздухе
рабочей зоны

Штамм бактерии Lysinibacillus xylanilyticus 5rb выделен из нефтезагрязненных торфяных почв и верховых торфяников Тюменской области. Является природным изолятом, был отобран по способности эффективно снижать содержание нефти в загрязненной ею воде, песке и почвах. Активно растет на средах с гексадеканом и нефтью в качестве единственных источников углерода.

Является компонентом биопрепарата по очистке почв, грунтов, водоемов и стоков от нефти, нефтепродуктов и от других стойких органических загрязнителей, а также по очистке загрязненных промышленных объектов.

По результатам проведенного анализа секвенсов вариабельных участков генов, кодирующих 16S рРНК, тестируемый штамм наиболее близок к видам Lysinibacillus xylanilyticus (99 %).

Культурально-морфологические особенности штамма. Коковидные клетки. Колонии блестящие с желтовато-оранжевым оттенком. Рост умеренно хороший, через 48 ч при 25 - 28 °С штамм образует колонии на глюкозо-пептонном агаре.

Клетки представляют собой грамположительные одиночные подвижные кокковидные клетки, образующие споры. В первые часы роста (логарифмическая фаза) образуются цепочки из 2 - 3 клеток вытянутой формы. К 48 - 56 ч (стационарная фаза) цепочки распадаются, клетки утолщаются, появляются споры, имеющие центральное положение и овальную форму.

Штамм растет на жидких и агаризованных средах: глюкозно-пептонном агаре (ГПА), мясо-пептонном агаре (МПА), АГВ-среде, картофельном агаре (КА). Можно культивировать в LB-бульоне, на LB-arape и готовой глюкозо-пептонной среде (ГПС).

Штамм Lysinibacillus xylanilyticus 5rb депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под номером ВКПМ В-11685.

Предельно допустимая концентрация (ПДК) в воздухе рабочей зоны - 50000 кл/м³.

3. Пределы измерений

Методика обеспечивает выполнения измерений количества клеток в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 50 до 50000 клеток в 1 м³ воздуха при доверительной вероятности 0,95.

4. Методы измерений

Прямой метод основан на аспирации из воздуха рабочей зоны бактерий на глюкозо-пептонный агар и подсчета количества выросших колоний по типичным культурально-морфологическим признакам.

5. Средства измерений, вспомогательные устройства,
реактивы и материалы

При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства и материалы, реактивы и питательные среды.

5.1. Средства измерений

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

5.2. Вспомогательные устройства и материалы

Примечание. Допускается применение оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

5.3. Реактивы и питательные среды

Примечание. Допускается использование других питательных сред и диагностических препаратов с аналогичными характеристиками.

6. Требования безопасности

При выполнении измерений концентрации клеток в воздухе рабочей зоны соблюдают следующие требования.

6.1. СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней».

6.2. СП 1.3.2518-09. Дополнения и изменения 1 к СП 1.3.2322-08.

6.3. Правила техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.005-88.

6.4. Электробезопасность при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-79 и инструкции по эксплуатации прибора.

6.5. Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами.

7. Требования к квалификации операторов

К выполнению измерений и обработке их результатов допускают лиц с высшим или средним специальным образованием, прошедших соответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области микробиологических исследований.

8. Условия измерений

Приготовление сред, подготовку к анализу проводят в следующих условиях:

- температура воздуха (20 ± 5) °С;

- атмосферное давление (760 ± 20) мм рт. ст.;

- влажность воздуха не более 80 %.

9. Приготовление питательных сред

Для приготовления используют сухую готовую глюкозо-пептонную среду (ГПА): 50,0 г порошка размешивают в 1000 см³ дистиллированной воды.

Можно использовать отдельные компоненты среды следующего состава: пептон - 20,0 г, глюкоза - 10,0 г, хлорид натрия - 5,0 г, агар-агар - 15,0 г. Сухие компоненты растворяют в 1000 см³ дистиллированной воды и тщательно перемешивают.

Приготовленную среду разливают в стерильные колбы по 250 - 500 см³ и автоклавируют при 121 °С в течение 15 мин.

Готовую среду хранят в защищенных от света условиях при температуре не выше 8 °С в течение 14 дней, не более.

10. Проведение измерения

10.1. Отбор проб воздуха

Отбор проб воздуха проводят с учетом требований ГОСТ 12.1.005-88 с изменением 1 «ССБТ. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны» и ГОСТ 8.563-96. ГСИ. «Методики выполнения измерений».

Для этого воздух аспирируют при помощи пробоотборника на поверхность плотной питательной среды в соответствии с технической документацией (инструкцией) на прибор. Время аспирации и объем отбираемого воздуха зависит от предполагаемой концентрации микроорганизма.

Аппарат перед каждым отбором пробы воздуха тщательно протирают 96°-м этиловым спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенку прибора; наружную и внутреннюю стенку крышки. На подвижной диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо (количество питательной среды в чашки вносят в соответствии с инструкцией к прибору). После отбора пробы воздуха и остановки диска прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы.

10.2. Выполнение анализа

При выполнении анализа воздуха прямым методом стерильный глюкозо-пептонный агар (ГПА) расплавляют, остужают до 50 - 60 °С и разливают в чашки Петри.

Контроль чистоты розлива проводят в соответствии с п. 7.1.1 МУК 4.2.2316-08. Для этого чашки с застывшей средой помещают в термостат при температуре 37 °С не менее, чем на 18 ч. Проросшие чашки бракуют, стерильные чашки используют для контроля воздуха. Разлитую в чашки питательную среду хранят при температуре (2 - 8) °С не более 10 дней.

После отбора проб воздуха чашки Петри помещают в термостат с температурой (28 ± 2) °С. Через 1 - 2 суток производят подсчет выросших колоний по культурально-морфологическим признакам.

Ростовые свойства используемой питательной среды должны быть проверены до проведения анализа воздуха в соответствии с требованиями к ростовым свойствам питательных сред, руководствуясь МУК 4.2.2316-08. Для этого эталонный музейный штамм L. xylanilyticus 5rb ВКПМ В-11685 высевается на 2 - 3 чашки используемой среды.

Лиофилизованную культуру музейного штамма необходимо использовать 2 - 3 пассажа во избежание потери им заданных ростовых свойств.

11. Вычисление результатов измерения

Расчет концентрации клеток производят по формуле:

К = (П⋅1000)/С×Т, кл/м3, где

К - концентрация L. xylanilyticus 5rb в воздухе, кл/м³;

П - количество типичных колоний, выросших на чашке Петри;

1000 - коэффициент пересчета на 1 м³ воздуха;

С - скорость аспирации воздуха, л/мин;

Т - время аспирации, мин.

12. Оформление результатов измерений

Результаты измерений оформляют протоколом по ниже приведенной форме.